Extracto
Apo2 (Apo2L) /factor de necrosis tumoral relacionados ligando inductor de apoptosis (TRAIL) es un prometedor agente terapéutico del cáncer. Recombinante humana Apo2L /TRAIL ha sido objeto de ensayos clínicos, mientras que varios tipos de tumores malignos tienen resistencia a la Apo2L /TRAIL. Nosotros y otros han demostrado que varios agentes contra el cáncer y flavonoides superar la resistencia al Apo2L /TRAIL por la regulación al alza del receptor de muerte 5 (DR5) en las células tumorales malignas. Sin embargo, los mecanismos por los que estos compuestos inducen la expresión DR5 siguen siendo desconocidos. Aquí mostramos que la apigenina flavonoides de la dieta se une e inhibe la translocasa-2 de nucleótidos de adenina (ANT2), lo que resulta en la mejora de Apo2L apoptosis /TRAIL inducida por la regulación positiva de DR5. Apigenina y genisteína, que son los principales flavonoides, mejorada Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer. La apigenina indujo la expresión de DR5, pero la genisteína no lo hizo. Usando nuestro método de identificación de los objetivos directos de los flavonoides, se compararon las proteínas de unión de apigenina con los de genisteína. Descubrimos que ANT2 era un objetivo de la apigenina, pero no genisteína. Del mismo modo que la apigenina, desmontables de ANT2 mejorada Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL por aumentando la expresión de DR5 a nivel post-transcripcional. Por otra parte, el silenciamiento de ANT2 atenuó el aumento de la Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL por la apigenina. Estos resultados sugieren que la apigenina regula al alza DR5 y mejora Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL mediante la unión y la inhibición de ANT2. Proponemos que los inhibidores ANT2 pueden contribuir a la terapia Apo2L /TRAIL
Visto:. Oishi M, Iizumi Y, Taniguchi T, W Goi, Miki T, Sakai T (2013) Las células del cáncer de próstata apigenina sensibiliza a Apo2L /TRAIL al dirigirse a los nucleótidos de adenina translocasa-2. PLoS ONE 8 (2): e55922. doi: 10.1371 /journal.pone.0055922
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Octubre, 2012; Aceptó 3 de enero de 2013; Publicado: 19 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Oishi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (puesta en marcha, 21890223) y (a, 20533178) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es el segundo cáncer diagnosticado y la sexta causa principal de muerte relacionada con el cáncer masculino en el mundo [1]. Aunque la terapia de privación de andrógenos es eficaz en el tratamiento de cáncer de próstata avanzado, la mayoría de los pacientes presentan resistencia a este tratamiento [2]. Se informó de que docetaxel más prednisona fue eficaz para el cáncer de próstata refractario a las hormonas [3]. Sin embargo, el resultado de este tratamiento es aún insuficiente [4]. Por lo tanto, se necesitan nuevas estrategias para tratar el cáncer de próstata hormono-refractario.
necrosis ligando Apo2 (Apo2L) /tumoral ligando inductor de apoptosis (TRAIL) es una citoquina que pertenece a la familia del factor de necrosis tumoral relacionada con el factor. Apo2L /TRAIL se une al receptor de muerte 4 (DR4) y del receptor de muerte 5 (DR5) y selectivamente induce la apoptosis en diversos tumores malignos, pero no en las células normales [5], [6]. Recientemente, se han desarrollado varios Apo2L /TRAIL recombinante humana y los anticuerpos anti-DR5 agonistas, y fase clínica I /II se han realizado ensayos en pacientes con muchos tipos de tumores malignos [7]. Sin embargo, un número de tumores presentan resistencia a Apo2L /TRAIL y la superación de esta resistencia es esencial para la quimioterapia mediante la vía de Apo2L /TRAIL [8]. Nosotros y otros han proyectado compuestos de la dieta sensibilización de las células cancerosas para Apo2L /TRAIL y identificado varios polifenoles como inductores DR5 [9] - [14]. Sin embargo, los mecanismos por los que estos polifenoles regulan al alza DR5 son desconocidos.
translocases nucleótido de adenina (hormigas) son transportadores importantes en la membrana mitocondrial interna y juegan un papel en el intercambio entre ADP y ATP [15]. Las hormigas tienen cuatro isoformas en los seres humanos y cada isoforma muestra una distribución tisular diferente. ANT2 se sobreexpresa en muchas células tumorales malignas y tiene propiedades anti-apoptóticos [16], [17]. Por ejemplo, desmontables de ANT2 se ha demostrado para mejorar la apoptosis por lonidamina, un agente antitumoral que ataca la mitocondria [17], e inducir la apoptosis en células de cáncer de mama humano con la inhibición del crecimiento del tumor
in vivo
[18]. Además, desmontables de ANT2 sensibiliza a las células de cáncer de mama a Apo2L /TRAIL a través de la regulación positiva de DR5 [19]. En consecuencia, ANT2 se considera que es un objetivo prometedor contra el cáncer [20], [21].
Para dilucidar los mecanismos precisos a través del cual los flavonoides inducir la expresión de DR5, se utilizó perlas magnéticas FG, que reveló recientemente el objetivo de la talidomida y el mecanismo de la talidomida teratogénesis [22], [23]. Se identificaron ANT2 como una proteína de unión de la apigenina flavonoide dietética que upregulated DR5. Al igual que con el tratamiento de la apigenina, desmontables de ANT2 mejorada Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL upregulating DR5. Por otra parte, desmontables de ANT2 atenuó el aumento de la Apo2L /apoptosis mediada por TRAIL por la apigenina. En el presente estudio, primero mostramos que ANT2 es un objetivo de la apigenina, que regula al alza DR5 y sensibiliza a las células tumorales malignas de Apo2L /TRAIL.
Materiales y Métodos
Cell Culture
línea celular de cáncer de próstata humano DU145 se obtuvo como una línea celular del NCI-60 del Instituto Nacional del cáncer (MD, EE.UU.) Developmental Therapeutics Program (DTP NCI). línea celular de cáncer de próstata humano LNCaP se obtuvo de American Type Culture Collection. Hemos confirmado que estas líneas celulares de cáncer de próstata son negativas para micoplasma usando el kit de detección de Mycoplasma ™ MycoAlert (Lonza, Rockland, ME, EE.UU.). células DU145 se mantuvieron en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal, 2 mmol /L de glutamina, 50 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO
2. células LNCaP se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 4 mmol /L de glutamina, 50 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO
2.
Reactivos
La apigenina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón) y la genisteína (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EE.UU.) fueron adquiridos y se disolvió en DMSO. Apo2L /TRAIL recombinante humana se adquirió de Pepro Tech (Londres, Reino Unido)
RNAi
La siguiente siRNAs (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizaron:. SiANT2#1, 5 ' -AGAACAUUGGACCAUGCACCCUUGA-3 '; siANT2#2, 5'-UGUAUUGCUUAUCUGCAGUGAUCUG-3 ', y la cautela RNAi control negativo GC alto. Sólo se muestran las cadenas de sentido. células DU145 o LNCaP fueron transfectadas con siRNAs utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen).
Detección de la apoptosis
células
DU145 o LNCaP se trataron con diversas concentraciones de cada flavonoide de 24 hr o transfectadas con siRNAs. A continuación se añadió Apo2L /TRAIL recombinante humano (50 ng /ml) a las células. Después de 24 h, se recogieron las células y se suspendieron en PBS que contenía 0,1% de Triton X-100, /yoduro de propidio 50 mg ml, y 100 mg /ml de RNasa A (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). El porcentaje de ADN hypodiploid (sub-G1) se cuantificó mediante FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.). Los datos fueron analizados utilizando el software Cell Quest (Becton, Dickinson and Company).
Análisis de Western Blot
DU145 o LNCaP células fueron tratadas con diferentes concentraciones de cada flavonoide o transfectadas con siRNAs. Las células se lisaron con tampón RIPA (50 mmol /L Tris-HCl [pH 8,0], 150 mmol /L de NaCl, 1% NP-40, ácido desoxicólico al 0,5%, 0,1% SDS, 1 mmol /L de DTT, 0,5 mmol /a continuación, se centrifugaron L PMSF) a 4 ° C durante 30 min y. Los sobrenadantes se recogieron y se separaron por 10,0% de SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), utilizando el método húmedo. Las membranas se empaparon en 5% de leche en TBS a 4 ° C durante la noche y se incubaron con anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 60 min. Los anticuerpos primarios fueron un anti-DR5 anticuerpo policlonal de conejo (ProSci, Poway, CA, EE.UU.) a una dilución 1:500 en 5% de leche en TBS y un anticuerpo monoclonal de ratón anti-β-actina (Sigma) a una dilución 1:2,000 en 5 % de leche en TBS. Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante a una dilución 1:2,000 en TBS-Tween 20 durante 60 min a temperatura ambiente. Las bandas de proteínas se visualizaron en BioMax XAR película (Carestream Health, Inc., Rochester, NY, EE.UU.) utilizando Chemi-Lumi Un L (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón).
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR análisis
células
DU145 o LNCaP se trataron con diversas concentraciones de cada flavonoide o transfectadas con siRNAs. El ARN total se extrajo de las células con Sepasol-RNA I super (Nacalai Tesque). El ADN complementario se sintetizó a partir de ARN total usando de alta capacidad de cDNA de transcripción inversa Kits (Applied Biosystems, Melbourne, Australia). El ADN complementario se amplificó utilizando sondas TaqMan para ANT2, DR5, y GAPDH (Applied Biosystems), y un sistema ABI 7300-PCR en tiempo real (Applied Biosystems).
Preparación de perlas-flavonoides fijo
perlas FG magnéticas con un enlazador epoxi se adquirieron de Tamagawa Seiki (Nagano, Japón). Se llevó a cabo la fijación de la apigenina y genisteína sobre las perlas como se describe (Iizumi et al., datos no publicados). En breve, las perlas se mezclan con apigenina en DMF que contiene carbonato de potasio a 37 ° C durante 24 horas en cuanto a la genisteína a 60 ° C durante 24 horas, se lavaron dos veces con DMF y luego dos veces con agua desionizada. Las perlas resultantes se almacenaron a 4 ° C.
purificación e identificación de flavonoides-proteínas de unión
perlas de flavonoides fijo o perlas vacías se incubaron con extractos de células DU145 entera a 4 ° C durante 4 hora Las proteínas de unión se eluyeron con colorante Laemmli, se sometieron a SDS-PAGE, y se detectaron por tinción con plata. Las proteínas de unión se sometieron a digestión en gel usando Sequencing Grade tripsina modificada (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Los fragmentos de péptidos fueron analizados por un espectrómetro de masas Autoflex II (Burker Daltonics, Billerica, MA, EE.UU.).
Resultados
La apigenina Mejora Apo2L /TRAIL inducida por apoptosis a través de Regulación al alza de DR5 en el Post Nivel -transcriptional
Entre los flavonoides más comunes, apigenina es conocida para aumentar Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL a través de la regulación positiva de DR5, mientras que la genisteína aumenta Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL sin regulación positiva de DR5 [9], [24 ], [25]. En el presente estudio, la combinación de estos flavonoides y 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL notablemente la apoptosis inducida, mientras que cada flavonoide por sí solo no en células DU145 de cáncer de próstata humano (Fig. 1A, S1, y S2). Apigenina indujo la expresión de proteína DR5 pero no la genisteína (Fig. 1B) hizo, mientras que la apigenina no upregulate DR5 mRNA (Fig. 1C y S3). Estos resultados sugieren que la apigenina mejora Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL por post-transcriptionally DR5 upregulating.
A, las células DU145 se trataron con diversas concentraciones de cada flavonoide durante 24 horas, seguido de tratamiento con o sin 50 ng /ml Apo2L /TRAIL. Después de 24 horas, la población sub-G1 de las células se midió por citometría de flujo. B, las células DU145 se trataron con las concentraciones indicadas de cada flavonoide de 24 hr y cosechada. Los lisados se analizaron mediante transferencia Western con un anticuerpo anti-DR5. β-actina se utilizó como control de carga. C, DR5 ARNm se cuantificó en tiempo real de RT-PCR y normalizado por GAPDH. Columnas, significan; bares, SD (n = 3). **
P
. & Lt; 0,01 en relación al control
ANT2 se identifica como una proteína de unión de apigenina, pero no genisteína
Para dilucidar el mecanismo por el cual apigenina induce la expresión de DR5, exploramos las proteínas de unión a la apigenina, pero no genisteína, usando perlas de FG con un enlazador epoxi. La apigenina y genisteína se fijaron en estas cuentas (Fig. 2A). Las proteínas de unión de la apigenina y genisteína se purificaron a partir de los extractos de células enteras DU145 y se identificaron por análisis MALDI-TOF MS. La adenina nucleótido translocasa-2 (ANT2) se identificó como una proteína de unión de la apigenina, pero no genisteína. Por otro lado, la proteína ribosomal S9 (RPS9) se identificó como una proteína de unión de estos flavonoides (Fig. 2B). Estos resultados indican que ANT2 es una proteína de unión de la apigenina, que induce la expresión de DR5.
A, la fijación de la apigenina y genisteína sobre perlas magnéticas FG. B, Apigenin- y proteínas de unión de genisteína-se purificaron a partir de extractos de células enteras de células DU145 con cada uno de flavonoides fijo o no (-) FG perlas y se analizaron por tinción con plata. Las proteínas de unión se identificaron mediante un espectrómetro de masas.
Desmontables de ANT2 Mejora Apo2L /TRAIL inducida por apoptosis a través de Regulación al alza de DR5 a nivel post-transcripcional
Se ha informado de que desmontables de ANT2 mejora Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL a través de la regulación positiva de DR5 en células de cáncer de mama humano [19]. Por lo tanto, se investigó si desmontables de ANT2 mejorada Apo2L apoptosis /inducida por TRAIL en células DU145 de cáncer de próstata humano. ANT2 siRNAs reprimió potentemente la expresión de mRNA ANT2 (Fig. 3A y S4). Como se muestra en la Fig. 3B y S5, ANT2 siRNAs aparentemente aumentaron Apo2L /apoptosis mediada por TRAIL. A continuación examinó si ANT2 caída indujo la expresión de DR5. expresión DR5 fue inducida por ANT2 siRNAs en células DU145 (Fig. 3C), mientras que DR5 mRNA no fue inducida (Fig. 3D y S6). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que desmontables de ANT2, así como la apigenina, mejora Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL por el post-transcripcionalmente DR5 upregulating.
DU145 células fueron transfectadas con siRNAs dos ANT2 diferentes (# 1 y siANT2#2) o un no-siRNA dirigidos (siCtrl) y se incubaron durante 48 horas. A, ANT2 ARNm se cuantificó en tiempo real de RT-PCR y normalizado por GAPDH. B, las células se trataron con o sin 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. Después de 24 horas, la población sub-G1 de las células se midió con citometría de flujo. C, niveles de proteína de DR5 y β-actina se analizaron por transferencia Western. D, los niveles de ARNm de DR5 se midió por tiempo real de RT-PCR y normalizado por GAPDH. Columnas, significan; bares, SD (n = 3). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 en relación con el control de
Desmontables de ANT2 Atenúa Apo2L /TRAIL inducida por apoptosis potenciada por la apigenina
para dilucidar el papel de ANT2 en la mejora de la sensibilidad a Apo2L /TRAIL por la apigenina, hemos examinado si la caída de ANT2 influenciado esta mejora como se realizó anteriormente como a otras proteínas diana [26], [27]. Apigenina (20 mmol /L) reforzada 50 ng /ml de Apo2L /apoptosis mediada por TRAIL en las células DU145 introducidas por ARNsi de control, pero no en las células DU145 introducidas por ANT2 siRNA (Fig. 4A y S7). El silenciamiento de ANT2 bajó el aumento de la expresión de DR5 en un 20 mmol /L de apigenina (Fig. 4B). Estos resultados indican que se requiere la inhibición ANT2 para apigenina para mejorar la expresión de DR5 y Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL.
células DU145 se transfectaron con siANT2#1 o siCtrl. Después de 48 h, las células se incubaron con 20 mmol /L apigenina durante 24 horas. A, las células fueron tratadas con o sin 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. Después de 24 horas, la población sub-G1 de las células se midió por citometría de flujo. La diferencia en las poblaciones sub-G1 con y sin Apo2L /TRAIL se define como la actividad de Apo2L /TRAIL. La actividad Apo2L /TRAIL en las muestras sin apigenina se normalizó a 1. B, niveles de proteína de DR5 y β-actina se analizaron por transferencia Western. Columnas, significan; bares, SD (n = 3). **
P
. & Lt; 0,01 en relación al control
A continuación se investigó el papel de ANT2 en otra línea celular de cáncer, el cáncer de próstata humano LNCaP dependientes de hormonas. ANT2 mRNA fue silenciado efectivamente por ANT2 siRNAs (Fig. 5A y S8), y desmontables de ANT2 también indujo la expresión de DR5 (Fig. 5B) y mejorado 50 ng /ml de Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL (Fig. 5C y S9). Además, desmontables de ANT2 atenuó el aumento de la sensibilidad a Apo2L /TRAIL y DR5 expresión en un 20 mmol /L de apigenina (Fig. 5D, E y S10).
células LNCaP fueron transfectadas con siANT2 o siCtrl y eran se incubaron durante 48 hr. A, ANT2 ARNm se cuantificó en tiempo real de RT-PCR y normalizado por GAPDH. B, niveles de proteína de DR5 y β-actina se analizaron por transferencia Western. C, las células se incubaron con o sin 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. Después de 24 horas, la población sub-G1 de las células se midió con citometría de flujo. D, las células se incubaron con 20 mmol /L apigenina durante 24 horas, seguido de tratamiento con o sin 50 ng /ml de Apo2L /TRAIL. La actividad Apo2L /TRAIL en las muestras sin apigenina se normalizó a 1. E, las células se incubaron con 20 mmol /L apigenina durante 24 horas. Los niveles de proteína de DR5 y β-actina se analizaron por transferencia Western. Columnas, significan; bares, SD (n = 3). *
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P Hotel & lt; 0,01 en relación con el control de
Discusión
En el presente estudio, hemos. identificado ANT2 como una proteína de unión de apigenina que upregulated DR5 usando perlas magnéticas FG (Fig. 2). Desmontables de ANT2 mejorada Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL upregulating DR5 (Fig. 3), similar al tratamiento con apigenina (Fig. 1). Por otra parte, desmontables de ANT2 atenuó el aumento de la expresión de DR5 y Apo2L /TRAIL apoptosis inducida por la apigenina (Fig. 4 y 5). Estos resultados sugieren que se une e inhibe la apigenina ANT2, que induce la expresión de DR5 y potencia Apo2L /TRAIL sensibilidad (Fig. 6). El presente estudio también sugiere que la apigenina induce post-transcripcionalmente DR5 mediante la inhibición de ANT2 (fig. 1B y C). Suponemos que varios agentes, que han sido reportados a regular al alza DR5 a nivel transcripcional [10] - [13], también puede inducir la expresión de DR5 a nivel post-transcripcional mediante la inhibición de ANT2
La apigenina se une e inhibe. ANT2. La inhibición de la ANT2 aumenta la sensibilidad de Apo2L /TRAIL a través de la regulación positiva de DR5.
Se ha informado de que desmontables de ANT2 eleva los niveles de ROS [17] y se activa la JNK y p53 [19], en consonancia con la apigenina también aumenta los niveles de ROS [25], [28] y activa JNK [29] y p53 [30]. Además, el presente estudio mostró que la apigenina obligado a ANT2 y upregulated DR5 similar a desmontables de ANT2. Estos resultados sugieren fuertemente que la apigenina inhibe funcionalmente ANT2.
Varios polifenoles, como la apigenina, se han reportado para mejorar la sensibilidad de Apo2L /TRAIL a través de diversas vías [25], [31]. Sin embargo, los mecanismos detallados a través del cual cada polifenol aumenta Apo2L sensibilidad /TRAIL siguen siendo desconocidos. Nuestro método de identificación de los objetivos de los polifenoles puede ser útil para elucidar estos mecanismos.
dilucidado el mecanismo a través del cual la apigenina upregulated DR5 mediante la comparación de las proteínas de unión de apigenina que upregulated DR5 y genisteína que no lo hicieron (Fig. 2) . La estrategia que compara las proteínas de unión directa de diversos agentes es beneficioso. Por ejemplo, se ha aclarado que los ligandos de proteínas VDAC inducen selectivamente la muerte celular por apoptosis no en las células tumorales que albergan mutaciones en los oncogenes
HRAS
,
KRAS
, o
BRAF
mediante la comparación de las proteínas de unión de erastin A6 y erastin B2, un análogo erastin que carece de su actividad [32]. La comparación de las proteínas de unión de diferentes agentes puede revelar las proteínas que causan los principales o los efectos adversos de estos agentes. Por otra parte, el control farmacológico de estas proteínas de unión se puede desarrollar la quimioterapia actual.
Hasta la fecha, varios anticuerpos anti-DR5 agonistas y Apo2L /TRAIL recombinante humana se han desarrollado y están bajo ensayos clínicos, mientras que algunos tipos de cáncer han mostrado resistencia a estos agentes [7]. En el presente estudio, desmontables de ANT2 sensibiliza las células cancerosas para Apo2L /TRAIL upregulating DR5. Este estudio también sugiere que la apigenina puede ser un inhibidor ANT2. En consecuencia, los inhibidores de la apigenina y novedoso ANT2 pueden aumentar los efectos de estos agentes mediante la superación de la resistencia a la Apo2L /TRAIL.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Los histogramas de la figura 1A como a apigenina.
doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s001 gratis (TIF)
figura S2.
Los histogramas de la figura 1A como a genisteína.
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Figura S3. Empresas El curvas de amplificación de la figura 1C.
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figura S4.
Las curvas de amplificación de la figura 3A.
doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s004 gratis (TIF)
Figura S5. Empresas El histogramas de la Figura 3B.
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Figura S6.
Las curvas de amplificación de la figura 3D.
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Figura S7. Empresas El histogramas de la Figura 4A.
doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s007 gratis (TIF)
Figura S8.
Las curvas de amplificación de la Figura 5A.
doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s008 gratis (TIF)
Figura S9. Empresas El histogramas de la Figura 5C.
doi: 10.1371 /journal.pone.0055922.s009 gratis (TIF)
Figura S10. Empresas El histogramas de la Figura 5D.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0055922.s010 gratis (TIF)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos a M. Horinaka e Y. Sowa para la discusión útil