Extracto
El ácido acetilsalicílico (aspirina) es muy eficaz para el tratamiento de pacientes con cáncer de colon después del diagnóstico; sin embargo, los mecanismos de acción de la aspirina en el cáncer de colon no están bien definidos. La aspirina y su apoptosis importante salicilato de metabolito de sodio inducida y la disminución de crecimiento celular del cáncer de colon y la sal sódica de la aspirina también inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos atímicos. la inhibición del crecimiento de células de cáncer de colon fue acompañada por la regulación por disminución de las proteínas Sp1, SP3 y SP4 y disminución de la expresión de productos de genes regulados-Sp incluyendo bcl-2, survivin, VEGF, VEGFR1, ciclina D1, c-MET y p65 (NFKB). Por otra parte, también mostramos por la interferencia de ARN que ß-catenina, un objetivo importante de la aspirina en algunos estudios, es un gen regulado por el Ing. La aspirina induce la escisión dependiente de caspasa nuclear de las proteínas Sp1, SP3 y SP4 y esta respuesta se relaciona con el secuestro de los iones de zinc ya que la adición de sulfato de zinc bloqueó la apoptosis y la represión de las proteínas Sp aspirina mediada. Los resultados demuestran un importante mecanismo subyacente de acción de la aspirina como un agente contra el cáncer y, en base al rápido metabolismo de la aspirina a salicilato en los seres humanos y de las altas relaciones de salicilato /aspirina en el suero, es probable que la actividad contra el cáncer de la aspirina se debe también al metabolito salicilato de
Visto:. Pathi S, Jutooru I, Chadalapaka G, Nair V, Lee SO, S Safe (2012) la aspirina inhibe la célula del cáncer de colon y el crecimiento tumoral y la proteína regula a la baja especificidad (e) Factores de transcripción . PLoS ONE 7 (10): e48208. doi: 10.1371 /journal.pone.0048208
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Agosto, 2012; Aceptado: September 24, 2012; Publicado: 26 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Pathi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud (R01 CA136571) y Texas AgriLife Research. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el ácido acetilsalicílico o aspirina es un fármaco no esteroide antiinflamatorio (AINE) ampliamente utilizado para el tratamiento del dolor, la fiebre y otras condiciones inflamatorias [1] y el papel de la aspirina y otros AINE en el cáncer ha sido ampliamente investigado [2], [3]. El uso de aspirina se asoció con el riesgo disminuido para colorrectal, de mama, de esófago, de pulmón, de estómago y cáncer de ovario, y la aspirina es tanto un quimiopreventivo y agente quimioterapéutico para el cáncer de mama y de colon [4] - [8]. Un informe reciente sobre los efectos quimiopreventivos de la aspirina mostró que la incidencia de cáncer de colon en Escocia se redujo significativamente en la población en general a la dosis diaria más baja de aspirina (75 mg) y se observó la disminución de la incidencia, incluso después de sólo 5 años de uso de la aspirina [7]. En otro estudio sobre los efectos quimioterapéuticos de la aspirina en pacientes con cáncer de colon, un riesgo relativo de 0,53 (para la mortalidad) se observó en los pacientes que no usaron el medicamento antes del diagnóstico y este valor se redujo a 0,39 para un subgrupo de pacientes que sobreexpresan la ciclooxigenasa 2 (COX-2) [5]
Varios estudios sobre las células de cáncer de colon y los modelos de tumor de colon han confirmado que la aspirina inhibe el crecimiento e induce la apoptosis en estos sistemas.; Sin embargo, los efectos específicos de la aspirina son algo variables en estos informes. Por ejemplo, la aspirina regula a la baja la expresión de bcl-2 [9], inhibe el factor de crecimiento endotelial vascular, presenta actividad antiangiogénica [10], [11], e inhibe la vía Wnt /β-catenina [12]. Dunlop y compañeros de trabajo también han demostrado que la regulación a la baja inducida por aspirina de I? B en el cáncer de colon células resulta en la acumulación nuclear mejorada del NFkB compleja (p65 /p50) y esto se ha relacionado con una vía de pro-apoptótica en células de cáncer de colon [13] - [15]
etil 2 -. [(2,3-bis (nitrooxi) propil) disulfanyl] benzoato de metilo (GT-094) es un fármaco sintético nitro-no esteroide anti-inflamatorio (nO-AINE) y como la aspirina, GT-094 también inhibe el crecimiento de células de cáncer de colon y del tumor [16], [17]. Estudios mecanísticos indican que la actividad anticancerígena de GT-094 se debe, en parte, a regulación a la baja ROS-dependiente de la proteína de especificidad (Sp) factores de transcripción Sp1, Sp3, SP4 y reglamentadas-Sp genes que incluyen-2 bcl, survivin, de crecimiento de hepatocitos receptor del factor de (c-MET), VEGF y su receptor VEGFR1 [17]. Otros fármacos como los AINE, tales como inhibidores de ácido tolfenámico y COX-2 también inhibir el crecimiento de células cancerosas y regular a la baja Sp factores de transcripción [18] - [26] y, en este estudio, hemos investigado los efectos de la aspirina sobre las proteínas SP y otro Sp- genes regulados incluyendo β-catenina. Nuestros resultados muestran que la aspirina y el salicilato de regular a la baja Sp1, Sp3, SP4 y varios productos de los genes regulados-Sp en células de cáncer de colon e identifica una vía importante para la actividad anticancerígena de la aspirina que es consistente con los estudios de interferencia de ARN (RNAi), en la que desmontables Sp1, sP3 y Sp4 en células de cáncer también inhibe el crecimiento e induce la apoptosis [24] - [26]. Desmontables de proteínas Sp también demostró que la β-catenina es un gen regulado-Sp en células de cáncer de colon. Los resultados de este estudio, junto con los informes anteriores sobre los mecanismos de la inhibición mediada por la aspirina del crecimiento celular del cáncer de colon, también facilitarán el desarrollo de terapias con aspirina y NSAID análogos en combinación con otros agentes utilizados para tratar el cáncer de colon. Las relaciones de salicilato /aspirina séricos elevados reportados observados en estudios en humanos utilizando la aspirina [27] sugieren que el salicilato puede ser un importante contribuyente a la actividad anticancerígena de la aspirina en pacientes con cáncer de colon.
Procedimientos Experimentales
Las líneas celulares, reactivos y anticuerpos
RKO, SW480, HT-29 y HCT-116 líneas celulares de carcinoma de colon humano se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). células RKO y SW480 se mantuvieron en Dulbecco modificado /Ham F-12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con rojo fenol suplementado con bicarbonato 0,22% de sodio, suero bovino fetal al 5%, y 10 ml /L de 100X de antibiótico /antimicótico solución (Sigma). células HT-29 y HCT-116 se mantuvieron en medio de McCoy 5A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) con rojo fenol suplementado con bicarbonato 0,22% de sodio, suero bovino fetal 10%, y 10 ml /L 100X anti-biótico solución anti-micótico (Sigma). Las células fueron cultivadas en 150 cm ambiente
2 placas de cultivo en un aire /CO
2 (95:5) a 37 ° C y se pasaron aproximadamente cada 3-5 días. Todos los anticuerpos se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), excepto poli escindido (ADP) ribosa polimerasa (PARP) y c-Met (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Sp1, survivin y VEGF-R2 (Millipore, Temecula, CA), VEGFR1 y p65 (Abcam Inc. Cambridge, MA), y los anticuerpos beta-actina (Sigma-Aldrich). β-catenina se adquirió de Epitomics, Inc., Burlingame, CA. El ácido y salicilato de sodio acetilsalicílico AINE se adquirieron de Sigma-Aldrich. N, N, N ', N'-tetraquis (2-piridil metil) etilendiamina (TPEN), glutatión (98%) (GSH) y la lactacistina se adquirieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Dithiothretol (DTT) (98%) se obtuvo de Boehringer Mannheim Corp, (Indianapolis, IN). Los inhibidores de caspasa 2, 8 y 9 y pancaspase inhibidor (Z-VAD-FMK) se adquirieron de Calbiochem (San Diego, CA). Leptomycin B era inhibidor de la exportación nuclear adquirido a Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA). Lipofectamine y Lipofectamine 2000 se adquirieron de Invitrogen. reactivo de luciferasa fue de Promega (Madison, WI). reactivo de beta-galactosidasa se obtuvo de Tropix (Bedford, MA). NFkB construcción de promotor se adquirió de Stratagene (Cedar Creek, TX). Los VEGF y survivina construcciones del promotor fueron proporcionados por los Dres. Gerhard Siemeister y Gunter Finkenzeller (Instituto de Medicina Molecular, Centro de Biología Tumoral, Freiburg, Alemania) y el Dr. M. Zhou (Universidad de Emory, Atlanta, GA), respectivamente. Sp1 y Sp3 promotor construcciones fueron amablemente proporcionados por los Dres. Carlos Cuidad y Veronique Noe (Universidad de Barcelona, Barcelona, España).
Ensayos de proliferación celular
RKO, SW480, se sembraron HT-29 y HCT-116 líneas celulares de cáncer de colon (3 x 10
4 por pocillo) usando DMEM: medio F-12 de Ham que contiene 2,5% tratado con carbón vegetal suero fetal bovino (FBS) en placas de 12 pocillos y se dejó que se adhirieran durante 24 hr. Las células se trataron entonces con vehículo o las concentraciones indicadas de la aspirina y el salicilato de sodio. Después de 24, 48 y 72 h de tratamiento, las células se contaron usando un contador de partículas Coulter Z1. Cada experimento se realizó por triplicado y los resultados se expresan como medias ± SE para cada determinación.
Anexina V tinción
La apoptosis, kit de detección de células necróticas y saludable se adquirió de Biotium, Inc. (Hayward , CA). RKO, SW480, HT-29 y células HCT-116 de cáncer de colon (7,5 × 10
4) se sembraron en Lab-Tek dos portaobjetos de vidrio cubierta con cámaras y dejó que se unieran durante la noche. Después del tratamiento con aspirina (10 mM) durante 24 horas, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) dos veces y se incubaron con FITC Anexina V, homodímero de etidio III y Hoechst 33342 en Anexina V tampón de unión durante 20 minutos según el fabricante de instrucciones del protocolo. Después, las células se lavaron dos veces con tampón de unión de Anexina V y se detectan para flouroscence con microscopio de fluorescencia digital.
ensayos de interferencia siRNA
SiRNAs para Sp1, Sp3, SP4, y Lamin se adquirieron de Sigma- Aldrich. Los complejos siRNA utilizados en este estudio se indican como sigue:
Lamin: SASI_Hs02_00367643
SP1: SASI_Hs02_00363664
Sp3 5'-ACG GCG CGC GGA GGU NVND ACU TT
Sp4 5'-ACG GUG ACA CAU UAG UGA GCT T
RKO y cáncer de colon SW480 líneas celulares fueron sembradas (6 × 10
4 por ml) en placas de 6 pocillos en DMEM: medio F-12 de ham suplementado con FBS despojado de carbón vegetal 2,5% sin antibióticos y se dejó que se adhirieran durante 1 d. Desmontables de Sp1, Sp3, SP4 individual o una combinación de los 3 proteínas llevó a cabo utilizando siRNA apropiado junto con iLamin como control se realizó usando el reactivo de transfección LipofectAMINE 2000 según las instrucciones del fabricante.
Transfección y ensayo de luciferasa
RKO y SW480 células de cáncer de colon (1 × 10
5 por pocillo) se sembraron en placas de 12 pocillos en medio F-12 DMEM /Ham suplementado con FBS despojado de carbón vegetal 2,5%. Después de 24 h, diversas cantidades de ADN [es decir, 0,4 g pGL3-Luc, 0,04 g β-galactosidasa, y 0,4 g pNFκB-Luc (4) -Luc] fueron transfectadas usando el reactivo Lipofectamine 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 5 h de la transfección, la mezcla de transfección se reemplazó con medio completo que contenía vehículo (DMSO) o el compuesto indicado en DMSO.
Para los estudios de interferencia de ARN, las células de cáncer de colon RKO y SW480 se cotransfectaron con siRNA para Sp1, Sp3, SP4 o Lamin junto con diversas cantidades de ADN para pGL3-Luc o 0,4 mg pNFκB-Luc. Después de 22 horas, las células se lisaron con 100 l de tampón de lisis 1X reportero, y extractos de células (30 ml) se utilizaron para ensayos de luciferasa y β-galactosidasa. Un luminómetro Lumicount se utilizó para cuantificar las actividades de luciferasa y β-galactosidasa, y las actividades de luciferasa se normalizaron a ß-galactosidasa actividad.
Western blots
RKO, SW480, HT-29 y HCT- 116 células de cáncer de colon se sembraron en DMEM: medio F-12 de Ham que contiene despojado carbón vegetal 2,5% de FBS y, después de 24 horas, las células se trataron con vehículo (DMSO) o los compuestos indicados. Las células se recogieron usando tampón de alta salinidad (HEPES 50 mM, 0,5 mol /L de NaCl, MgCl 1,5 mM
2, mM EGTA 1, 10% de glicerol, y 1% de Triton-X-100) y 10 ml /L de la proteasa cóctel inhibidor (Sigma-Aldrich). Después de la centrifugación de los lisados a 15.000
g
durante 15 min a 4 ° C, se recuperaron los sobrenadantes, y la proteína se cuantificó mediante el ensayo de proteínas de Bradford. lisados de proteínas (15 a 60 g) se incubaron durante 5-10 min a 100 ° C junto con tampón de carga 5X y entonces se separan por electroforesis en 7,5 a 12% en geles de poliacrilamida de sulfato de dodecil de sodio a 120 V durante 3 a 4 horas. Las proteínas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno por electrotransferencia en húmedo en un tampón que contiene Tris 25 mM, glicina 192 mM, y 20% de metanol durante 1,5 horas a 180 mA. Las membranas se bloquearon durante 45 min con 5% TBST-Blotto (10 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, pH 8,0, 0,05% de Triton X-100, y 5% de leche en polvo sin grasa) y se incubaron en fresco 5% TBST-Blotto con 1:500 anticuerpo primario durante la noche con agitación suave a 4 ° C. Después de lavar dos veces con TBST durante 10 min, la membrana se incubó con el anticuerpo secundario (1:5000) en 5% TBST-Blotto durante 3-4 hr por agitación suave. La membrana se lavó dos veces con TBST durante 10 min, se incubaron con 2 ml de sustrato de quimioluminiscencia (Millipore, Temecula, CA) durante 1 min, y se expuso a la estación de imagen Kodak 4000 mm Pro (Carestream Health, Rochester, NY).
estudios de xenoinjertos en ratones sin timo
Femenino ratones desnudos atímicos se adquirieron de Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care y de acuerdo con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos actuales. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por la Universidad de Texas A & amp; M University Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) (AUP#2012-131). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. Para producir los tumores, se recogieron las células RKO a partir de cultivos subconfluentes mediante una exposición breve a 0,25% de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético 0,02%. La tripsinización se detuvo con medio que contiene suero bovino fetal 10%, y las células se lavaron una vez en medio libre de suero y se resuspendieron en medio libre de suero. Sólo suspensiones que consiste en células individuales con 90% de viabilidad se usaron para las inyecciones. Un xenoinjerto fue establecida por la inyección subcutánea de las células (3 × 10
6) en los flancos de ratones individuales. Los tumores se dejaron crecer durante 6 d hasta que estuvieron palpable. Los ratones fueron aleatorizados en dos grupos de 6 ratones por grupo y se dosifican por sonda oral en aceite de maíz 200 mg /kg /día (se neutraliza con una concentración equimolar de NaOH) de la aspirina sobre todos los días durante 14 d. Los ratones se pesaron, y el tamaño del tumor se midió cada segundo día con pinzas para permitir el cálculo de los volúmenes tumorales: V = LW
2/2, en la que L y W son la longitud y anchura, respectivamente. Después de 14 d, se sacrificaron los animales; los pesos corporales y tumorales finales se determinaron y se representaron. Al final del experimento, se recogieron los principales órganos viscerales y tumores y se analizaron para la expresión de proteínas Sp y la inducción de apoptosis usando transferencias de Western y tinción TUNEL, respectivamente.
El análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias se determinó mediante análisis de varianza y la prueba t de Student, y se observaron los niveles de probabilidad. Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras. IC
50 valores se calcularon mediante análisis de regresión no lineal y se expresa en M, en los intervalos de confianza del 95%.
Resultados
La aspirina inhibe el crecimiento e induce la apoptosis en células de cáncer de colon
En este estudio, diferentes concentraciones (2,5 a 10 mM) de la aspirina inhibió el crecimiento de SW480, RKO, HT29 y las células HCT116 en un período de 3 días (Figs. 1A y 1B), y IC
50 valores para la inhibición del crecimiento inducida por aspirina estaban en el intervalo de 2,5 a 5 mM en todas las 4 líneas celulares. Se utilizó la dosis alta (10 mM) de la aspirina para determinar los efectos proapoptóticos de este compuesto después del tratamiento de solamente 24 horas y los resultados muestran que la aspirina aumento de la tinción con anexina V en todas las líneas celulares de cáncer de colon 4 (Fig. 1C). Los efectos proapoptóticos de la aspirina (5 y 10 mM) se investigaron adicionalmente en células de cáncer de colon mediante la determinación de cambios en la expresión en las proteínas de supervivencia Bcl-2 y la survivina y la inducción de la escisión de PARP dependiente de caspasa. La aspirina induce una regulación a la baja de la concentración y dependiente del tiempo de la survivina y Bcl-2 e inducidos de la escisión de PARP, un marcador de la apoptosis (Figs. 1D y 1E).
La inhibición de la SW480 y RKO (A) y HT29 y HCT116 (B) la proliferación celular. Las células se trataron con DMSO o aspirina 2,5 a 10 mM durante 3 días, y el número de células se determinaron como se describe en los Procedimientos Experimentales. La inducción de la tinción con anexina V (C) y las respuestas de apoptosis en las células HCT116 (E) RKO y SW480 (D) y HT29 y. se determinó Anexina V tinción como se describe en los Procedimientos Experimentales. La expresión de proteínas apoptóticas de escisión de PARP se determinó por análisis de transferencia Western de lisados de células enteras como se describe en los Procedimientos Experimentales. Los resultados en (A) y (B) son medias ± SE para la determinación 3 replicados para cada grupo de tratamiento, y significativa (p & lt; 0,05) la inhibición se indica (*) guía empresas
La aspirina y el salicilato downregulates SP1. , SP3, SP4 y regulados por genes Sp
Los estudios anteriores de la interferencia de ARN (ARNi) muestran que tanto la survivina y Bcl-2 están regulados por Sp1, SP3 y SP4 células del cáncer [17], [22], [24] - [26]. Por lo tanto, las células RKO, SW480, HT29 y HCT116 se trataron con 5 y 10 mM aspirina para 24 o 48 hr y análisis de transferencia Western mostró que hubo una disminución de la concentración y dependiente del tiempo en proteínas Sp1, SP3 y SP4 en todo 4 célula líneas (Figs. 2A y 2B). Por otra parte, el tratamiento de RKO, SW480, HT-29 y HCT116 células de cáncer de colon con 5 o 10 aspirina mM durante 24 o 48 hr también disminución de la expresión de varios productos de genes regulados por Sp1, Sp3 y Sp4 [24] - [29] y estos incluyen VEGF, VEGFR1, ciclina D1 y c-MET proteínas (Figs. 2C y 2D), y los efectos de la aspirina sobre su expresión fueron tanto de la concentración y dependiente del tiempo.
regulación a la baja de las proteínas Sp en RKO y SW480 (A) y HT29 y HCT116 (B) y productos de los genes regulados-Sp en las células HCT116 (D) RKO y SW480 (C) y HT29 y. Las células fueron tratadas con 5 o 10 mM aspirina para 24 o 48 horas, y los lisados de células enteras fueron analizados por análisis de transferencia Western como se describe en los Procedimientos Experimentales. Los resultados son típicos de los experimentos duplicados. (E) La aspirina disminuye la actividad del gen indicador. Las células fueron transfectadas con pSp1For4, pSp3For5, pVEGF y pSurvivin y se trataron con DMSO o aspirina (5 o 10 mM). Se determinó la actividad de luciferasa como se describe en los Procedimientos Experimentales. Los resultados se expresan como medias ± SE (3 repeticiones) y significativa (p & lt; 0,05). Se indica la inhibición (*) guía empresas
También se investigó los efectos de la aspirina 5 y 10 mM sobre la actividad luciferasa en RKO y las células SW480 transfectadas con construcciones que contienen ricas en GC inserciones del promotor de la Sp1 (pSp1For4, -751 a -20), Sp3 (pSp3For5, -417 a -38), VEGF (pVEGF, -2018 a +50), y survivina ( pSurvivin, -269 a la +49) genes (Fig. 2E). Con la excepción de la construcción de VEGF, 5 y aspirina 10 mM disminuyó significativamente la actividad de luciferasa y estos resultados se correlacionaron con la disminución de expresión de la correspondiente Sp1, Sp3, VEGF y las proteínas de survivina en RKO y las células SW480. El aumento de la actividad de luciferasa en células RKO tratadas con aspirina 5 mM y se transfectaron con pVEGF puede ser debido a la relativamente lenta regulación a la baja de esta proteína, que sólo se observó después de 48 horas a la concentración de 10 mM, lo que sugiere que otras vías inducidas por aspirina también puede ser la activación de VEGF.
la aspirina se metaboliza rápidamente a salicilato [27], y también se investigó los efectos de salicilato sobre el crecimiento celular del cáncer de colon, las proteínas SP y genes regulados-Sp (Fig. 3). Salicilato (sal de sodio) (2,5 a 10 mM) inhibió el crecimiento también de las 4 líneas de células (Figs. 3A y 3B), y los efectos inhibidores del crecimiento eran similares a la observada para la aspirina (Figs. 2A y 2B). La inhibición del crecimiento fue acompañada por la regulación a la baja dependiente del tiempo de Sp1, Sp3, SP4 y productos de los genes regulados por la SP (bcl-2, ciclina D1, survivin y VEGF) en RKO y SW480 (Fig. 3C) y HCT116 y HT29 (Fig. 3D) células. Este patrón de respuestas para el salicilato de sodio fue comparable a la observada para la aspirina (. Figs 1 y 2) y efectos similares se observaron también para salicilato de metilo (datos no mostrados), que también se metaboliza rápidamente a salicilato.
Inhibición de RKO y SW480 (A) y HCT116 y HT29 (B) el crecimiento celular. Las células se trataron con salicilato de sodio 2,5-10 mM durante hasta 3 días, y el número de células se determinaron como se describe en los Procedimientos Experimentales. regulación a la baja de la proteína en las células HT29 (D) RKO y SW480 (C) y HCT116 y. Las células fueron tratadas con 5 ó 10 mM salicilato de 24 o 48 horas, y los lisados de células enteras fueron analizados por transferencias Western como se describe en los Procedimientos Experimentales.
supresión inducida por aspirina de NFkB y β-catenina se debe, en parte, a Sp-regulación a la baja
ha previamente ha informado de que la aspirina mejora la acumulación nuclear NFkB [13] - [15] y esto se procedió a investigar en RKO y las células SW480 tratadas con 5 y 10 mM aspirina durante 48 horas. Los niveles de los niveles de p65 y p50 citosólicas disminuyeron, mientras que los niveles de p65 y p50 nuclear eran relativamente sin cambios después del tratamiento con aspirina (figuras 4A y 4B.), Y estos resultados difieren con los estudios previos [13] - [15]. Por otra parte, los niveles generales de proteínas nucleares fueron & lt; 10% de las proteínas citosólicas y esto se confirmó por análisis de transferencia Western de lisados de células enteras a partir de células tratadas con aspirina 5 o 10 mM que mostraron que ambas proteínas p65 y p50 se redujeron en ambas líneas celulares dentro de 48 horas después del tratamiento con aspirina (Figs. 4A y 4B). La aspirina también disminuye la actividad de luciferasa en las células SW480 y RKO transfectadas con una construcción de pNFκB-luc (Fig. 4C) y estos resultados fueron consistentes con la regulación a la baja observada de ambas proteínas p65 y p50 (Figs. 4A y 4B). Estudios anteriores indicaron que la aspirina disminución de la expresión β-catenina en células de cáncer de colon [12] y nuestros resultados confirmaron que la aspirina mM 5-10 también disminuye la expresión β-catenina en células de cáncer de colon RKO y SW480 (Fig. 4D).
Disminución p65 /p50 en RKO (a) y las células SW480 (B). Las células fueron tratadas durante 48 horas con 5 o 10 mM, y de células enteras, extractos nucleares y citosólicas se analizaron por análisis de transferencia Western como se describe en los Procedimientos Experimentales. Los niveles de las proteínas p65 y p50 (en relación con ß-actina) en lisados de células enteras se cuantificaron a partir de 3 experimentos replicados y se redujo significativamente por la aspirina. (C) La aspirina disminuye NFkB-luc. El constructo se transfectó en células RKO y SW480 tratado con DMSO o aspirina, y la actividad luciferasa se determina como se describe en los Procedimientos Experimentales. Los resultados son medias ± SE (3 repeticiones) y significativa (p & lt; 0,05) la inhibición se indica (*). (D) La regulación por disminución de β-catenina. Las células se trataron con aspirina 5 o 10 mM durante 48 horas, y los lisados de células enteras fueron analizados por transferencias de Western como se describe en los Procedimientos Experimentales.
Desde NFkB (p65) y los promotores β-catenina contienen Sp sitios de unión ricos en GC [28], [29], se utilizó ARNi para determinar el papel de SP1, SP3 y SP4 regulación de p65, p50 y β-catenina en las células de cáncer de colon. células RKO y SW480 se transfectaron con pequeños ARN inhibidores dirigidos Sp1 (ISP1), Sp3 (ISP3), y SP4 (ISP4) solo y en combinación (ISP1 /3/4). La Figura 5A muestra que cada oligonucleótido individuo disminución de la expresión de su objetivo individual (Sp1, Sp3 y SP4) y ISP1 /3/4 derribado las tres proteínas. ISP1 también disminuyó la expresión de SP4 (pero no SP3) y esto es consistente con estudios anteriores que muestran las interacciones entre los factores de reglamentación entre Sp transcripción debido a sus promotores ricas en GC [22], [25]. La Figura 5B ilustra las diferencias dependientes del contexto de células en los efectos de ISP1, ISP3 y ISP4 sobre la expresión de p65 en RKO y células SW480 donde Sp1, Sp3 y desmontables Sp4 dieron lugar a pequeños cambios en p65 en células RKO y Sp1 y a una caída Sp4 menor medida disminución de la p65 en células SW480. ISP1 /3/4 (oligonucleótidos combinados) disminución de la expresión de p65 en ambas líneas celulares, mientras que se observaron efectos mínimos para p50. Por lo tanto, la regulación por disminución inducida por aspirina de p50 (Figs. 4A y 4B) era Sp-independiente. La Figura 5C muestra que ISP1 /3/4 también disminuyó la actividad de luciferasa en RKO (90%) y SW480 (40%) de las células transfectadas con el constructo de NFkB-luc, y los diferentes efectos de Sp caída en estas células sugieren un papel más dominante para sp regulación dependiente de NFkB en la RKO que las células SW480. desmontables sp (combinado) también disminuyó la proteína β-catenina en RKO y las células SW480 y los resultados de la precipitación de las proteínas Sp individuales sugieren que Sp1 y Sp4 son los factores de transcripción dominantes requeridas para la expresión constitutiva de β-catenina en las células RKO, mientras que desmontables de Sp1 , SP3 y Sp4 disminuyen los niveles de β-catenina en las células SW480 de proteínas (Fig. 5D). Curiosamente, los estudios de ARNi muestra que se induce la escisión de PARP (apoptosis) principalmente después de desmontables de Sp3 tanto en RKO y células SW480 (Fig. 5E).
Desmontables de Sp1, Sp3, SP4 y Sp1 /3/4 (a) y p65 /p50 (B) en células de cáncer de colon. Las células fueron transfectadas con diversos oligonucleótidos, y los lisados de células enteras fueron analizados por análisis de transferencia Western como se describe en los Procedimientos Experimentales. (C) Derribo de Sp1 /3/4 (combinado) inhibe NFkB-luc. Las células fueron transfectadas con iLamin (control) y ISP1 /3/4 (oligonucleótidos combinados) y NFkB-luc, y se determinó la actividad de luciferasa como se describe en los Procedimientos Experimentales. Los resultados se expresan como medias ± SE (3 repeticiones), y significativamente (p & lt; 0,05) disminución de la actividad se indica (*). knockdown Sp disminuye β-catenina (D) e induce la escisión de PARP (E). Las células fueron transfectadas con diversos oligonucleótidos, y los lisados de células enteras fueron analizados por transferencias Western como se describe en los Procedimientos Experimentales.
Mecanismo de regulación a la baja inducida por aspirina de Sp1, Sp3 y Sp4
Varias vías se han descrito para la degradación Sp mejorado en líneas celulares de cáncer y estos incluyen la activación de proteasomas, caspasas y ROS [17] - [20], [22] - [26], y también una vía que implica la exportación nuclear de Sp1 seguido de la degradación proteolítica en el citosol [30]. El análisis de transferencia Western de las fracciones nucleares y de citosol de RKO y células SW480 muestra que Sp1, Sp3 y Sp4 se localizan en el núcleo y el tratamiento con aspirina disminuido Sp1, Sp3 y los niveles de proteína SP4 en el núcleo sin ninguna translocación evidente para el citosol (Fig. 6A). Resultados similares se observaron después de co-tratamiento con aspirina y el inhibidor de la exportación nuclear leptomycin B (combinado), lo que indica que no se requiere la exportación nuclear de Sp1, Sp3 o SP4 para regulación a la baja inducida por aspirina de SP1, SP3 y SP4. Otros agentes como el nitro-AINE GT-094 y ácido betulínico disminuyeron proteínas Sp en RKO y células SW480 través de la inducción de ROS dependiente de Sp represor transcripcional ZBTB10 y esta respuesta fue atenuada por los antioxidantes, tales como GSH o TDT [17], [31 ]; Sin embargo, los resultados en la Figura 6B muestran que estos antioxidantes no bloquean la regulación por disminución inducida por aspirina de proteínas Sp. Los resultados de estudios preliminares muestran que la regulación por disminución inducida por aspirina de proteínas Sp tampoco fue bloqueado por los inhibidores del proteasoma (datos no presentados), pero se vio afectada por el cotratamiento con el inhibidor de pancaspase Z-VAD-fmk. Figuras 6C y 6D muestran que la regulación a la baja inducida por aspirina Sp en células RKO y SW480 se inhibió después de co-tratamiento con el inhibidor de pancaspase (Z-VAD-FMK), caspasa-2 (Z-VDVAD-FMK), y la caspasa-8 (Z- Efectos inhibidores pero sólo parcialmente bloqueado con el inhibidor de la caspasa 9 (Z-LEHD-FMK) IETD-fmk).
(a) de leptomycin B. las células se trataron con aspirina 10 mM en presencia o ausencia de leptomycin B durante 48 horas, y los lisados de células enteras fueron analizados por Western blot como se describe en los Procedimientos experimentales. Efectos de los antioxidantes (B) y los inhibidores de caspasas (C, D) sobre inducida por aspirina Sp regulación a la baja de proteína. Las células fueron tratadas con DMSO, la aspirina sola o en combinación con antioxidantes o inhibidores de caspasa, y después de 48 hr, lisados de células enteras fueron analizados por transferencias de Western como se describe en los Procedimientos Experimentales.
Favier y compañeros de trabajo [ ,,,0],32], [33] informó anteriormente en células HeLa quelación del zinc por el quelante de iones metálicos permeable TPEN activado múltiples caspasas (3, 8 y 9-) y la disminución de la expresión de las proteínas Sp1, SP3 y SP4 que contienen iones de zinc en su sitios catalíticos. El tratamiento de la RKO y SW480 células con 25 o 50 M TPEN de 18 hr de escisión de PARP inducida y la activación (escisión) de caspasas 8, 9, 3 y 7 (Fig. 7A). El papel crítico de agotamiento de zinc en la mediación de esta respuesta y regulación a la baja de las proteínas Sp se confirmó mediante tratamiento de las células de cáncer de colon con TPEN solo o en combinación con 50 M ZnSO
4 (Fig. 7B). TPEN disminución de la expresión de SP1, SP3 y SP4 y la adición de ZnSO
4 revirtió completamente la regulación a la baja TPEN dependiente de las proteínas Sp1, SP3 y SP4. Como TPEN, la aspirina también indujo la escisión de PARP y la activación (escisión) de caspasas 8, 9, 3 y 7 (Fig. 7C). Inducida por aspirina escisión PARP también fue inhibida por sulfato de zinc (Fig 7D.); Por otra parte, el tratamiento de RKO y SW480 células con aspirina sola o en combinación con 50 M ZnSO
4 muestran que ZnSO
4 también disminuyó regulación a la baja de aspirina mediada de Sp1, Sp3 y SP4 (Fig. 7E), lo que confirma que aspirina, como TPEN, induce la escisión dependiente de caspasa de las proteínas Sp que es debido a zinc ion agotamiento.
(a) TPEN induce la activación (escisión) de las caspasas. Las células se trataron con TPEN 25 o 50 M durante 18 horas, y los lisados de células enteras fueron analizados por transferencias de Western como se describe en los Procedimientos Experimentales. (B) TPEN disminuye Sp expresión de proteínas y sulfato de zinc bloquea los efectos de la regulación a la baja TPEN sobre Sp. Las células fueron tratadas con 50 mM ZnSO
4 durante 18 horas, y los lisados de células enteras fueron analizados mediante transferencias Western. (C) La aspirina activa las caspasas. Las células se trataron con aspirina durante 48 horas, y los lisados de células enteras fueron analizados por transferencias de Western como se describe en los Procedimientos Experimentales. PARP división inducida por aspirina (D) es bloqueado por ZnSO
4. Las células fueron tratadas durante 48 horas con la aspirina sola o en combinación con ZnSO
4 y PARP de escisión se analizó por transferencias de Western de lisados de células enteras.