Extracto
Introducción
La ataxia telangiectasia mutada y Rad3 Relacionados (ATR) proteína quinasa es un sensor de clave de ADN de cadena sencilla asociada con horquillas de replicación atascadas y productos intermedios generados durante la reparación de la reparación del ADN. XRCC1 es una enzima fundamental en la reparación de roturas de cadena sencilla y la reparación por escisión de base. compleja XRCC1-LIG3 es también un importante contribuyente a la etapa de ligación de la respuesta por escisión de nucleótidos de reparación.
Métodos
En el presente estudio, se investigó la letalidad sintética en XRCC1 deficiente y XRCC1 dominio del hámster chino ováricas (CHO) y células humanas de cáncer de ovario utilizando inhibidores de ATR (NU6027). Además, también se investigó la capacidad de los inhibidores de ATR para potenciar la citotoxicidad cisplatino en XRCC1 deficiente y XRCC1 competentes CHO y las células cancerosas humanas. ensayos por clonación, ensayos cometa alcalino, γH2AX inmunocitoquímica, FACS para el ciclo celular, así como el análisis de citometría de flujo V-FITC anexina se realizaron.
Resultados
inhibición de ATR es sintéticamente letal en las células deficientes como XRCC1 demuestra el aumento de la citotoxicidad, la acumulación de roturas de doble hebra de ADN, G2 detención del ciclo celular /M y aumento de la apoptosis. En comparación con el cisplatino solo, la combinación de cisplatino y el inhibidor de ATR resultados en la citotoxicidad mejorada en células deficientes XRCC1 comparación con las células de dominio XRCC1.
Conclusiones
Nuestros datos proporciona evidencia de que la inhibición de ATR es adecuado para la letalidad sintética aplicación y chemopotentiation cisplatino en las células de cáncer de ovario deficientes XRCC1
Visto:. Sultana R, Abdel-Fatah, T, C Perry, P Moseley, Albarakti N, Mohan V, et al. (2013) La ataxia telangiectasia mutada y Rad3 Relacionados (ATR) de proteína quinasa inhibición es sintéticamente letal en células deficientes en XRCC1 cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (2): e57098. doi: 10.1371 /journal.pone.0057098
Editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de noviembre de 2012; Aceptado 17 de enero de 2013; Publicado: 25 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Sultana et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Orientación de la reparación del ADN para la letalidad sintética es un nuevo y excitante. estrategia para la terapia personalizada en cáncer de ovario. la reparación del ADN es esencial para el procesamiento de daño del ADN inducido por la quimioterapia, tales como agentes platinating (carboplatino, cisplatino) [1]. Intra-Strand aductos de ADN de reticulación inducidas por agentes platinating, si sin reparar, en última instancia resultan en la muerte celular [2], [3]. ADN enlaces cruzados intra-capítulo se reparan predominantemente por la reparación por escisión de nucleótidos (NER) en las células [4], [5]. Platinating agentes también pueden generar radicales libres de oxígeno que inducen daños de base oxidativo que son procesados por la reparación por escisión de bases del ADN (BER) de la vía en las células [6], [7].
El XRCC1 (cruz de reparación de rayos X - complementando 1) la proteína del gen es un factor crítico en la BER y solo filamento vía de reparación de la rotura (SSBR). compleja XRCC1-LIG3 es también un importante contribuyente a la etapa de ligación de la respuesta de reparación por escisión de nucleótidos (NER). XRCC1, una proteína de 70-kDa, no tiene actividad enzimática conocida (revisado en [8], [9], [10]). funciones XRCC1 como una proteína andamio molecular y coordina la reparación del ADN mediante la interacción con varios componentes de BER /SSBR como PARP-1 [poli (ADP-ribosa) polimerasas 1], glycosylases ADN, AP endonucleasa (APE1) y otros (revisado en [ ,,,0],8], [9], [10]). deficiencia de XRCC1 en las células conduce a la acumulación de ADN individuales roturas de la cadena (SSB), inducir mutaciones y resultar en niveles elevados de intercambios de cromátidas hermanas. deficiencia de XRCC1 en líneas celulares como resultado de hipersensibilidad a la radiación y la quimioterapia [9] ionizante. En los estudios de asociación humanos, polimorfismos de la línea germinal en XRCC1 pueden influir en el riesgo de cáncer [11], [12] y la respuesta a la quimioterapia influencia basada en platino [13], [14], [15], [16]. En el cáncer de ovario humano recientemente hemos demostrado que los tumores con frecuencia más de expresar XRCC1 (48%) y significativamente asociada con la etapa superior (p = 0,006), tumores de tipo seroso (p = 0,008), sub-óptima de-aumento de volumen (p = 0,004 ), un aumento de dos veces de riesgo de muerte (p = 0,007) y la progresión (p & lt; 0,0001) [17]. En el análisis multivariante, la expresión XRCC1 se asoció independientemente con la supervivencia en pacientes con cáncer de ovario [HR 2.3, p = 0,002]. tumores negativos XRCC1 se asociaron con la sensibilidad de platino (p & lt; 0,0001). Pre-clínico también confirmamos que las células negativas XRCC1 son hipersensibles a cisplatino en comparación con las células positivas XRCC1 [17]. Hipersensibilidad al cisplatino en células negativas XRCC1 se asoció con la acumulación de roturas de cadena de ADN y G2 /M detención del ciclo celular [17]. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que XRCC1 es un biomarcador prometedor en el cáncer de ovario.
Ataxia telangiectasia mutada y Rad3 relacionadas (ATR) de la proteína quinasa es un sensor de clave de ADN de cadena sencilla asociada con horquillas de replicación atascadas, así como genera durante BER y el capítulo doble ruptura de reparación como intermedios de reparación del ADN. ATR activada fosforila a su vez una serie de sustratos que intervienen en la regulación del ciclo celular, la replicación del ADN, la reparación del ADN y la apoptosis (revisado en [18], [19], [20], [21], [22]). En estudios preclínicos, la inhibición ATR puede resultar en la terapia de sensibilización citotóxica [22], [23], [24]. inhibidores de moléculas pequeñas de ATR están actualmente en desarrollo para la aplicación terapéutica en el cáncer [20], [21], [22].
La capacidad de los inhibidores de PARP para inducir letalidad sintética en BRCA deficiente en los cánceres de ovario [25], [26], [27] sugiere que los factores adicionales dentro de BER /SSBR pueden ser adecuados para tales enfoques personalizados. XRCC1 es un factor crítico en BER, SSBR y NER. ATR es un sensor clave de la SSB. En el presente estudio hemos investigado y confirmado letalidad sintética en las células deficientes XRCC1 tratados con inhibidores de ATR. Por otra parte, en comparación con el cisplatino solo, la combinación de los resultados del tratamiento con cisplatino y el inhibidor de ATR en el aumento de la citotoxicidad en células deficientes en comparación con XRCC1 Las células capaces de XRCC1.
Materiales y Métodos
Compuestos químicos y Reactivos
inhibidores de moléculas pequeñas ATR NU6027 y VE-821 se adquirieron de Tocris Bioscience, Reino Unido y Tinib-Tools, República Checa, respectivamente. Los compuestos se disolvieron en 100% de DMSO y se almacenaron a -20 ° C. Se obtuvo cisplatino (1 mg /ml) del Departamento de Farmacia, Hospitales Universitarios de Nottingham, Reino Unido
Líneas celulares y cultivo
células previamente bien caracterizado de ovario de hámster chino (CHO).; CHO9 (tipo salvaje), EM-C11 (XRCC1-mutante: la sustitución C389Y que conduce a la inestabilidad XRCC1protein), EM-C12 (XRCC1-mutante: la sustitución E98K lo que reduciría su integridad proteína XRCC1) [28] fueron proporcionados por el profesor Malgorzata Z. Zdzienicka , Departamento de Genética Molecular Celular de la Universidad Nicolaus-Copérnico en Torun, Bydgoszcz 85-094, Polonia. Las células se cultivaron en Ham F-10 medios de comunicación (PAA, Reino Unido) [suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (PAA, Reino Unido) y 1% de penicilina /estreptomicina]. EM9-V (mutante XRCC1) y las células EM9 transfectadas establemente con un vector de expresión humana XRCC1 (células EM9-XH) [29] fueron proporcionados por el profesor Keith Caldicott, daños y Genoma Centro de estabilidad, Universidad de Sussex, Reino Unido. Las células se cultivaron en medio DMEM (PAA, Reino Unido) [suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (PAA, Reino Unido) y 1% de penicilina /estreptomicina]. células de cáncer de ovario OVCAR-3 y OVCAR-4 se cultivaron en medio RPMI (PAA, UK) [suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (PAA, Reino Unido) y 1% de penicilina /estreptomicina].
XRCC1 desmontables Uso de siRNAs
Tres XRCC1 siRNA construye (secuencias enumeradas en la Tabla 1) y uno negativo revueltos control y siRNA para deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) (control positivo) fueron utilizados en estos estudios. Las construcciones de siRNA se adquirieron de Life Technologies Ambion, Reino Unido. El protocolo de transfección fue como se describe anteriormente por Fan et.al [30]. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos (2 ml /pocillo de medio sin antibióticos). Al 50% de confluencia, la transfección se logró utilizando Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, siRNA (100 pmol) y Lipofectamine (5 l) fueron cada uno por separado se mezcla con 250 l Opti MEM1 (GIBCO /Invitrogen) sin FBS. Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, las soluciones de siRNA y Lipofectamine se combinaron y se incubaron durante otros 20 minutos a temperatura ambiente. a continuación, esta mezcla se añadieron a células cultivadas en placas, se cultivaron a 37 ° C durante la noche y el medio se sustituyó después con medio fresco más penicilina /estreptomicina (1%). Cuando las células alcanzaron 100% de confluencia, que se trataron con tripsina y, posteriormente, transferidos a 75 cm
2 frascos para el crecimiento y /o tratamiento continuado. Derribo XRCC1 se evaluó mediante Western Blot en diversos puntos temporales después de la transfección (días 3, 5 y 7).
Análisis Western Blot
Las muestras de proteína se prepararon por lisis de células en tampón RIPA (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 1% Nonidet P-40, desoxicolato sódico al 0,5%, EDTA 1 mM, 0,1% SDS) que contiene inhibidor de proteasa (Sigma) y el inhibidor de fosfatasa cóctel 2 y 3 (Sigma) y luego llevado a western blot analiza como se describe anteriormente [29]. El anticuerpo primario era un ratón anti -XRCC1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) y de conejo anti-ATR (Novus Productos Biológicos, EE.UU.). HRP conjugado anticuerpo secundario era un anti-ratón de conejo y de cabra anti-conejo, respectivamente (Dako, Glostrup, Dinamarca).
Clonigénicas Ensayo de Supervivencia
Doscientas células por pocillo fueron sembradas en seis pocillos platos. Las células se dejaron adherir durante 4 horas. NU6027 o VE-821 se añadieron a las concentraciones indicadas y las placas se dejaron en la incubadora durante 10 días para las células CHO. Para siRNA transfectadas OVCAR-3 y OVCAR-4 células, tres días después de la transfección, NU6027 o VE-821 se añadió a las concentraciones indicadas y las placas se dejaron en la incubadora durante 14 días. Para los estudios de cisplatino y combinación de inhibidores de ATR, las células se trataron inicialmente con cisplatino durante 16 horas y después se lavaron suavemente dos veces con 1X tampón fosfato salino y se incubaron en medio fresco con o sin NU6027 (4 mM para las células CHO y 6 M durante OVCAR-3 células ) durante 10 días (células CH) o 14 días (células de cáncer humano). Después de la incubación, se desechó el medio, fijo (con metanol y la mezcla de ácido acético) se tiñeron con violeta cristal y se contaron. Sobrevivir Fracción = [No. de colonias formadas /(n. de células sembradas eficiencia de plaqueo x)]. Todos los ensayos por clonación se realizaron por triplicado.
alcalina Comet Assay
Este ensayo se llevó a cabo como se describe anteriormente [31]. Brevemente, las células subconfluentes fueron expuestas a NU6027 (4 M). A las 24 horas, se extrajeron las células y se realizaron ensayos cometa alcalino. tampón de electroforesis alcalino consistía en NaOH 200 mM, EDTA 1 mM y pH 13. Las diapositivas fueron teñidas con SYBR® verde (1:10,000 dilución) (Molecular Probes) durante 10 minutos y las imágenes se visualizaron bajo un filtro de rodamina con una Olympus BX40 microscopio. Los cometas fueron analizados utilizando el software de análisis de imágenes Comet Assay III (Perceptive Instruments, Suffolk, Reino Unido). Se evaluaron un total de 200 imágenes del cometa de momento de la cola de oliva.
γH2AX inmunocitoquímica
Las células fueron tratadas durante 48 horas con NU6027 (4 mM para las células CHO y 6 micras de células OVCAR-3) y el ensayo se realizó como se describe anteriormente [31]. Para los estudios de cisplatino y de combinación NU6027, inicialmente se trataron las células durante 16 horas con cisplatino (1,5 mM para las células CHO y 1 M durante OVCAR-3 o células OVCAR-4) y después se lavaron suavemente dos veces con 1X tampón fosfato salino y se incubaron en fresco medios con o sin NU6027 (4 mM para las células CHO y 6 mM para las células OVCAR-3 o OVCAR-4) y el ensayo se realizó como arriba. Las frecuencias de las células que contienen focos γH2AX se determinaron en 100 células por portaobjetos en tres experimentos separados. Los núcleos que contienen más de seis focos γH2AX se consideraron positivos.
Los análisis de citometría de flujo (FACS) para la progresión del ciclo celular
Las células fueron tratadas durante 24 horas con NU6027 (4 micras para las células CHO y 6 micras para OVCAR-3 o OVCAR-4 células). Las células fueron posteriormente recogidas por tripsinización y centrifugación (1000 rpm durante 5 minutos) y FACS análisis se realizaron como se describe [31].
detección de apoptosis por FITC-anexina V análisis de citometría de flujo
células previamente fueron tratados durante 48 horas con NU6027 (4 mM para las células CHO y 6 mM para las células OVCAR-3 o OVCAR-4). Las células fueron posteriormente recogidas por tripsinización y centrifugación (1000 rpm durante 5 minutos) y se lavaron dos veces con PBS frío y luego se resuspendieron las células en tampón de unión 1X a una concentración de 1 x 10
6 células /ml. A continuación, 100 l de la solución (1 × 10
5 células) se transfirió a un tubo de cultivo de 5 ml y se añadieron 5 l de FITC anexina V y PI 5 l. Las células fueron luego suavemente vórtice y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente (25 ° C) en la oscuridad. Después de la incubación, se añadieron 400 l de tampón de unión a cada tubo y se analizaron por citometría de flujo dentro de 1 hora. Para los estudios de cisplatino y de combinación NU6027, las células se trataron inicialmente durante 16 horas con cisplatino (1,5 mM para las células CHO y 1 M durante OVCAR-3 o células OVCAR-4) y después se lavaron suavemente dos veces con 1X tampón fosfato salino y se incubaron en fresco se llevó a cabo con o sin medios de comunicación NU6027 (4 mM para las células CHO y 6 mM para las células OVCAR-3 o OVCAR-4) y el ensayo como se describe anteriormente. Los datos fueron analizados utilizando el software FlowJo7.6.1.
Evaluación de la Interacción de Drogas (índice de combinación)
Para investigar la actividad sinérgica y aditivo, se calculó índice de combinación como se describe anteriormente [30]. Las curvas de dosis-respuesta para cisplatino o NU6027 solo se generaron primero. entonces el efecto del tratamiento combinado se analizó para la combinación de fármaco A (cisplatino) y B (NU6027), aplicando la siguiente ecuación: Ac /Ae + Bc /Be = D, en donde Ac y Bc corresponden a las concentraciones de fármacos utilizados en el tratamiento de combinación, y Ae y Be corresponde a las concentraciones de fármacos capaces de, por sí mismos, producir la misma magnitud del efecto. Si D (índice de combinación) es & lt; 1 el efecto de la combinación es sinérgico, mientras que si D = 1 o D es & gt; 1, el efecto es aditivo o antagonista, respectivamente [32]
Resultados
.
letalidad sintética
Para evaluar la letalidad sintética pre-clínico, un panel de XRCC1 deficiente y XRCC1 dominio del ovario de hámster chino y las líneas celulares de cáncer de ovario humano fueron tratados con inhibidores de molécula pequeña de ATR (NU6027 y VE-821 ).
ovario de hámster chino (CHO).
CHO9 (tipo salvaje), EM-C11 (XRCC1 deficiente) y EM-C12 (XRCC1 deficiente) se investigaron en ensayos de supervivencia por clonación. Inicialmente se evaluó XRCC1 y el estado de la expresión en células de ATR CHO9, EM-C11 y C12-EM. Western blot en la Figura 1A demuestra que EM-C11 y C12-EM no tienen expresión de la proteína XRCC1 medible en comparación con CHO9. EM-C11, C12 y EM-CHO9 son competentes en la expresión de ATR. La Figura 1B muestra que las células EM-C11 y EM-C12 son sensibles al tratamiento NU6027 comparación con las células CHO9. Del mismo modo, las células EM-C11 y EM-C12 son también sensibles a la VE-821 en comparación con células CHO9 (Figura 1C). Para investigar si la sensibilidad de XRCC1 células deficientes a los inhibidores de ATR se puede corregir mediante la expresión de la proteína XRCC1 de tipo salvaje en células CHO deficientes en XRCC1, hemos realizado ensayos clonogénicos en EM9-V (mutante XRCC1) y EM9-XH (células transfectadas de forma estable con un vector de expresión XRCC1 humano). Figura 1D demuestra que las células EM9-V son sensibles a NU6027 en comparación con EM9-XH.
ensayos de supervivencia para células clonogénicos CH tratados con NU6027 (B) y VE-821 (C) a las concentraciones indicadas (véase métodos para detalles). D. ensayos clonigénicas supervivencia de las células EM9-V y EM9-XH tratados con NU6027. ensayo de E. alcalina COMET en las células tratadas con CH NU6027. EM-C11 y C12-EM demostraron un momento mayor media de la cola en comparación con las células CHO9. F. células EM-C11 y C12-EM se acumulan significativamente mayores focos γH2AX comparación con las células CHO9 por tratamiento NU6027. Los datos representan valores medios ± SEM (n = 6). Los resultados se analizaron mediante t de Student. * P & lt;.
0,05
A continuación, realizó el análisis funcional en las células. ATR inhibición conduce a la acumulación de ADN de una sola hebra de rotura (SSB). Por lo tanto se realizó ensayo alcalina COMET. Figura 1E resume los resultados para las células CHO9, EM-C11 y C12-EM tratados con 4 M de NU6027. En comparación con las muestras de pre-tratamiento, después de 24 horas de exposición a los inhibidores de ATR, las células EM-C11 y C12-EM demuestran un momento de la cola media significativamente mayor en comparación con CHO9 (p & lt; 0,01). Los datos confirman la acumulación SSB consecuencia de la inhibición de ATR en células deficientes XRCC1.
ADN de doble filamento se rompe (DSBs) induce la fosforilación de H2AX en la serina 139 (γH2AX). La acumulación de γH2AX focos en el núcleo es un marcador de DSBs. Por lo tanto, γH2AX inmunocitoquímica se realizó en EM-C11, EM-C12 y las células CHO9 trató con 4 μΜ de NU6027. Los núcleos que contienen más de seis focos γH2AX se consideraron positivos. γH2AX inmunocitoquímica confirmó que XRCC1 deficiente EM-C11 y C12-EM células acumulan focos más γH2AX a las 48 horas (p = 0,02 yp = 0,05) en comparación con las células CHO9 (Figuras 1D).
La acumulación de las DSB puede retrasar la progresión del ciclo celular. FACS análisis se lleva a cabo, por tanto, en el EM-C11, C12 y EM-CHO9 células tratadas con NU6027 (4 M). la progresión del ciclo celular se evaluó y se comparó con muestras de control. A las 24 horas, EM-C11 y C12-EM, se mostró a ser detenido en la fase G2 /M del ciclo celular (p = 0,01 yp = 0,03) en comparación con las células CHO9 (Figura 2A y 2B).
B. La cuantificación de las diversas fases del ciclo celular se muestra para CH célula tratada con NU6027. Los datos representan valores medios ± SEM (n = 6). Los resultados se analizaron mediante t de Student. * P & lt; 0,05. ensayo V apoptosis C. FITC-anexina se muestra aquí. La proporción de células en apoptosis primera fase es mayor en las células deficientes XRCC1 tratados con NU6027 comparación con las células de tipo salvaje.
Acumulación de DSBs, si no reparados, induce la apoptosis en las células. Por lo tanto, se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo V FITC-anexina para cuantificar la apoptosis en las células tratadas con 4 M de NU6027 y células apoptóticas cuantificados a las 48 horas. En las células EM-C11 la proporción de células en la apoptosis temprana aumentó a 7,5% después del tratamiento de 48 horas con NU6027 en comparación con 1,73% en las células no tratadas. Del mismo modo en las células EM-C12, porcentaje de células apoptóticas tempranas aumentó de 2,62% a 9,88%. Por otra parte en las células CHO9, no hubo ningún cambio en el porcentaje de células apoptóticas tempranas (3,22% en no tratado y 3,38% después de 48 horas de tratamiento NU6027 (Figura 2C).
Los datos presentados en hámster chino células sugiere que las células deficientes en XRCC1 son sensibles a los inhibidores de ATR. inhibición de ATR conduce a una mayor acumulación de OSD, G2 detención del ciclo celular /M y la apoptosis. esto sugiere una relación letalidad sintética entre XRCC1 y ATR. para confirmar estos datos aún se investigó en el ovario humano líneas celulares de cáncer.
células de cáncer de ovario humano.
Hemos generado XRCC1 desmontables líneas celulares de cáncer de ovario humano utilizando tres construcciones de siRNA (Tabla 1). Después de la transfección, lisados celulares fueron muestreados en los días 3, 5 y 7 para XRCC1 derribo por análisis de transferencia Western. Figura 3A confirma que los tres constructos (siRNA-1, siRNA-2, siRNA-3) inducen knockdown eficiente (más de 80%) de XRCC1 en OVCAR-3 células en día 3 en comparación con el control negativo y el control GAPDH revueltos positivo. En ensayos de supervivencia clonigénicas, el tratamiento NU6027 reduce la supervivencia en las células deficientes XRCC1 en comparación con células capaces de producir (Figura 3B). Resultados similares se observaron en las células OVCAR-4 (Figura S1 A). γH2AX inmunocitoquímica confirmó que las células deficientes XRCC1 acumulan focos más γH2AX a las 48 horas (p = 0,05, p = 0,01 y p = 0,007, respectivamente) en comparación con control mezclado (Figura 3C). Por otra parte, a las 24 horas, se demostró que las células deficientes XRCC1 a ser detenido en la fase G2 /M del ciclo celular (p = 0,05, p = 0,04 y p = 0,05) en comparación con las células CHO9 (Figura 3D). En las células deficientes XRCC1 la proporción de células en apoptosis aumentado considerablemente en comparación con los controles revueltos por tratamiento NU6027 (Figura 3E).
B. ensayos de supervivencia clonigénicas para siRNA transfectadas las células OVCAR-3 tratadas con NU6027 a las concentraciones indicadas se muestran aquí (véase métodos para más detalles). células deficientes C. XRCC1 acumulan significativamente mayores focos γH2AX comparación con las células de control revueltos por tratamiento NU6027. Los datos representan valores medios ± SEM (n = 6). Los resultados se analizaron mediante t de Student. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01. D. La cuantificación de las diversas fases del ciclo celular se muestra para siRNA transfectadas de células OVCAR-3 tratados con NU6027 se muestra aquí. Los datos representan valores medios ± SEM (n = 3). Los resultados se analizaron mediante t de Student. * P & lt; 0,05. E. FITC-anexina V ensayo de apoptosis para siRNA transfectadas células OVCAR-3 se muestra aquí. La proporción de células en apoptosis tardía fase es mayor en las células deficientes en XRCC1 tratados con NU6027 en comparación con células de control revueltos.
Tomados en conjunto, los datos de las células CHO y líneas de células humanos proporcionan pruebas convincentes de que los inhibidores de ATR inducir letalidad sintética en las células deficientes XRCC1.
El cisplatino Chemopotentiation
Hemos demostrado previamente que las células deficientes en XRCC1 son sensibles a cisplatino [17]. En el estudio actual, En primer lugar confirmó esta observación en las células EM-C12 XRCC1 deficiente EM-C11 y en comparación con CHO9 células de tipo salvaje (Figura 4A). A continuación, evaluaron estrategias de combinación. La citotoxicidad del cisplatino fue reforzada por NU6027 en XRCC1 células deficientes en comparación con CH Las células capaces de XRCC1. Con el fin de evaluar la interacción entre NU6027 y cisplatino, el índice de combinación se calculó como se describe anteriormente [32]. Las células se cultivaron en presencia de dosis crecientes de cisplatino (rango 0,5-3 M) en combinación con una concentración de NU6027 capaces de inducir una inhibición del crecimiento de 50%. NU6027 potenció el efecto citotóxico de cisplatino en células deficientes XRCC1 (Tabla 2). Si el índice de combinación (D) es & lt; 1 el efecto de la combinación es sinérgico, mientras que si D = 1 o D es & gt; 1, el efecto es aditivo o antagonista, respectivamente [32]. En el estudio actual, el índice de combinación fue uno en las células EM-C11 y C12-EM. Llegamos a la conclusión de que el aumento de cisplatino citotoxicidad por NU6027 en células CHO fue aditivo en lugar de sinérgico. a continuación, se procedió a realizar el análisis funcional en las células. Cisplatino solo tratamiento aumentó la acumulación de DSB en células deficientes en XRCC1 que se aumentó aún más por NU6027 (p = 0,01 yp = 0,02) (Figura 4B). La acumulación OSD visto en células deficientes XRCC1 también se asoció con la acumulación de células apoptóticas como se muestra en la Figura 4C
.
eje X designa el aumento de la concentración de sólo el cisplatino. NU6027 se fijó en 4 micras. B. XRCC1 células deficientes CH acumulan significativamente mayores focos γH2AX comparación con XRCC1 dominio células CH por tratamiento cisplatino solo o una combinación de cisplatino y NU6027. Los datos representan valores medios ± SEM (n = 6). Los resultados se analizaron mediante t de Student. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01. ensayo V apoptosis C. FITC-anexina se muestra aquí. La proporción de células en fase temprana, así como la apoptosis fase tardía es mayor en las células deficientes XRCC1 tratados con cisplatino solo o una combinación de cisplatino y NU6027 comparación con las células de tipo salvaje.
A continuación, estudios similares realizados en siRNA transfectadas las células OVCAR-3 o OVCAR-4 humana. Similar a los resultados observados en las células CH, deficientes en células XRCC1 OVCAR-3 o OVCAR-4 fueron sensibles a cisplatino. NU6027 aumentada su citotoxicidad del cisplatino en las células deficientes en XRCC1 OVCAR-3 en comparación con células capaces de XRCC1 (Figura 5A). Resultados similares se observaron en las células OVCAR-4 (Figura S1 B). estudios de índice de combinación (Tabla 2) demostraron que en la mayoría de las células era uno, a excepción de OVCAR-3 células tratadas con Si RNA_3 (D = 0.93) y OVCAR-4 células SiRNA_1 (d = 0,99). En conjunto, se concluye que las células de cáncer de ovario humano el efecto potenciador es probable que sea aditivo. Cisplatino solo tratamiento aumentó la acumulación de DSB en células que se incrementó aún más por NU6027 (p = 0,02, p = 0,007 yp = 004) (Figura 5B). La acumulación OSD visto en células deficientes XRCC1 se asoció con la acumulación de células apoptóticas sustanciales como se muestra en la Figura 5C.
B. células deficientes XRCC1 acumulan significativamente mayores focos γH2AX comparación con las células de dominio XRCC1 sobre el tratamiento con cisplatino solo o una combinación de cisplatino y NU6027. Los datos representan valores medios ± SEM (n = 6). Los resultados se analizaron mediante t de Student. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01. ensayo V apoptosis C. FITC-anexina se muestra aquí. La proporción de células en fase tardía de la apoptosis es mayor en las células deficientes XRCC1 tratados con cisplatino solo o una combinación de cisplatino y NU6027 comparación con las células de tipo salvaje.
Los datos que aquí se presentan no sólo proporciona evidencia adicional de que XRCC1 células deficientes son sensibles a la quimioterapia con cisplatino, pero también sugiere que la inhibición de ATR mejora aditiva cisplatino toxicidad en las células deficientes en comparación con XRCC1 Las células capaces de XRCC1.
Conclusiones
proteína quinasa ATR es un sensor clave de la sola ADN -cables asociado con horquillas de replicación en punto muerto y productos intermedios generados durante la reparación BER y la reparación de DSB. activación ATR regula varios procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la replicación del ADN, la reparación del ADN y la apoptosis. XRCC1 es esencial para la BER y SSBR y contribuye a la etapa de ligación de la respuesta NER. Tenemos la hipótesis de que la inhibición de ATR podría ser sintéticamente letal en las células deficientes XRCC1.
En el presente estudio hemos comprobado que los inhibidores de ATR son sintéticamente letal en las células deficientes XRCC1. Hemos concluido letalidad sintética por las siguientes razones. En primer lugar, las células CHO, así las células cancerosas humanas deficientes en XRCC1 fueron altamente sensibles a los inhibidores de ATR. En segundo lugar, los análisis funcionales demostraron que la inhibición ATR en células deficientes XRCC1 llevó a una acumulación de ADN DSBs, G2 /M detención del ciclo celular y el aumento de la apoptosis. Estos datos son consistentes con un estudio por Peasland et al [22] que demostraron que NU6027 es sintéticamente letal en las células tratadas con un inhibidor de PARP que bloquea BER. Por otra parte, los autores también demostraron que las células de hámster chino que carecen de XRCC1 EM9 son también sensibles a NU6027 [22]. Los datos, incluyendo el nuestro, por lo tanto, constituye una prueba irrefutable de que la inhibición de ATR es sintéticamente letal en las células deficientes BER. Se presenta un modelo de trabajo para la inhibición de ATR como estrategia letalidad sintética en las células deficientes XRCC1. En resumen, la inhibición de ATR conduce a la acumulación de SSB. Las células deficientes en XRCC1 son incapaces de procesar SSB cuales finalmente son convertidos a las DSB tóxicos en las horquillas de replicación. DSB abrumadoras no sólo pueden saturar la reparación de DSB, pero la inhibición ATR también se conoce para modular la reparación de DSB directamente [33], [34] que contribuyen a la letalidad sintética observada en las células.
También se encontró que las células deficientes XRCC1 son sensibles al cisplatino. La sensibilidad cisplatino en células deficientes XRCC1 observada en nuestro estudio es consistente con un estudio reciente en células HepG2 donde la sensibilidad cisplatino se demostró tras el agotamiento XRCC1 [35]. No se observó ninguna potenciación de la citotoxicidad cisplatino por el inhibidor de ATR en las células de tipo salvaje XRCC1. Esto está en contraste con los estudios preclínicos anteriores donde ATR inactivación (genéticamente o con inhibidores) ha demostrado una mayor sensibilidad al platino en un panel de líneas de células [22]. Sin embargo, una limitación de nuestro estudio es que nuestra investigación se restringió a sólo unos pocos tipos de células. Sin embargo, nuestros datos sugieren que los antecedentes genéticos (como el estado XRCC1) puede influir en la sensibilidad de platino. En conclusión, hemos demostrado una aplicación de letalidad sintética para los inhibidores de ATR en células deficientes XRCC1. inhibición de ATR también puede influir en la sensibilidad de platino en células deficientes XRCC1.