Extracto
El cáncer de próstata (CaP) sometidos a la diferenciación neuroendocrina (NED) son clínicamente relevantes para el desarrollo de recaída resistente a la castración CaP. evidencias crecientes muestran que la autofagia implica en el desarrollo de tumores neuroendocrinos (NE), incluyendo CaP. Para aclarar el efecto de la autofagia en NED, se examinaron las células LNCaP CaP sensibles a los andrógenos. El tratamiento de células LNCaP con IL-6 dio lugar a una inducción de la autofagia. En ausencia de andrógenos, IL-6 provocó una activación aún más fuerte de la autofagia. Similar resultado se identificó en la inducción de la NED. La inhibición de la autofagia con cloroquina (CQ) disminuyó notablemente NED. Esta observación fue confirmada por beclin1 y ATG5 experimentos de silenciamiento. apoyar aún más el papel de la autofagia en NED, se encontró que LC3 fue hasta reguladas en el tejido CaP que habían recaído tras la terapia de privación de andrógenos en comparación con su contraparte tumor primario. tinción LC3 en el tejido CaP recaída mostró patrón puntiforme similar a la tinción de la cromogranina A (CGA), un marcador para las células NED. Por otra parte, la inhibición de la autofagia indujo la apoptosis de IL-6 células de CaP diferenciadas NE inducida. Por ello, la inhibición de la autofagia por desmontables de beclin1 o ATG5 sensibilizados NE diferenciado células LNCaP a etopósido, un fármaco de quimioterapia. Para identificar los mecanismos, se analizó la fosforilación de la IL-6 objetivos de abajo. Un incremento en fosfo-AMPK y una disminución de la fosfo-mTOR se encontraron, lo que implica que la IL-6 regula la autofagia través de la vía /mTOR AMPK. Lo más importante para este estudio es el descubrimiento de descanso, un represor transcripcional neuronal específico del gen que está implicado en la activación de la autofagia. REST se había reducido regulado en el tratamiento con IL-6. desmontables experimentos sugieren que el descanso es fundamental para la NED y la activación de la autofagia por la IL-6. En conjunto, nuestros estudios implican que la autofagia está implicado en la progresión del CaP y desempeña un papel citoprotector cuando NED se induce en células de CaP por tratamiento con IL-6. Estos resultados ponen de manifiesto el potencial de dirigir la autofagia como parte de un régimen terapéutico combinado para los tumores NE
Visto:. Chang P-C, Wang T-Y, Chang Y-T, Chu C-Y, Lee C-L, Hsu H-W, et al. (2014) La autofagia Camino se requiere para la IL-6 inducida diferenciación neuroendocrina y quimiorresistencia de las células del cáncer de próstata LNCaP. PLoS ONE 9 (2): e88556. doi: 10.1371 /journal.pone.0088556
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia |
Recibido: 18 Noviembre 2013; Aceptó 7 de enero de 2014; Publicado: 14 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por becas NSC (NSC 101-2320-B-010-047-MY3) y por subvenciones (MMH) MMH10194. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la principal causa de mortalidad por cáncer en los países occidentales y su incidencia está aumentando rápidamente en Asia [1]. la terapia de privación de andrógenos (ADT) se utiliza para CaP primario y metastásico dependiente de andrógenos [2]. Sin embargo, 80% a 90% de los pacientes con CaP desarrollan tumores resistentes a la castración dentro de los 3 años después de ADT éxito. El tratamiento terapéutico de CaP se ve obstaculizada por tal desarrollo de un estado refractario de hormonas, en el que la terapia hormonal falla, lo que resulta en la enfermedad de entrar en una etapa más agresiva y en última instancia fatal [3]. Una característica fascinante pero poco estudiada de la hormona refractaria CaP es su asociación con diferenciación neuroendocrina (NED) [4]. NED es un proceso que se observa durante ADT [5], [6]. Por lo general, las células de un tumor sometidos NED muestran características que son similares a NE células y estas células se denominan células neuroendocrinas similar (NE-like). NE células similares no son proliferativas, diferenciación terminal, y el receptor de andrógenos (AR) -negativo. Son muy difíciles de matar, ya que son refractarios a la terapia hormonal debido a que carecen de la AR; Además, son resistentes a la quimioterapia convencional, debido a que no se dividen [7]. Además, liberan un gran número de neurokines, quimiocinas, citocinas y factores de crecimiento; esto se traduce en un aumento de la proliferación de las células de CaP no NE vecinos; esto ocurre de una manera paracrina durante ADT. células NE-como es probable que sean las causas de la resistencia a la quimioterapia y hormonas del CaP resistente a la castración y la presencia de células NE-como se correlaciona con un mal pronóstico [7] - [9]. La capacidad de identificar los nuevos mecanismos subyacentes a la NED de células de CaP y de la resistencia terapéutico de las células NE-como proporcionará nuevas estrategias que pueden ser aplica a la prevención de la recaída resistente a la castración CaP o, alternativamente, para el desarrollo de combinado terapéutico regímenes de recaída CaP resistente a la castración.
células NE-como pueden ser identificados sobre la base de los cambios morfológicos y la expresión de marcadores neuronales. Varias vías han demostrado para inducir la NED en células de CaP usando
in vitro
sistemas de cultivo in; éstos incluyen la privación de andrógenos [10] y interlerukin-6 (IL-6) de tratamiento [11]. Esto último es particularmente importante ya que IL-6 niveles se incrementan significativamente en pacientes sometidos a ADT y los estudios clínicos han demostrado que los niveles séricos de IL-6 son con frecuencia más alta en pacientes con resistente a la castración y el CaP metastásico [12] - [14]. IL-6 es una citocina pleiotrópica importante para diversas respuestas inmunes, la supervivencia celular, la proliferación y la tumorigénesis [15], [16]. Canonical IL-6 vías de señalización incluyen (i) JAK-STAT3, (ii) PIK3-Akt y (iii) MEK-ERK. Los estudios han demostrado que la IL-6 media la detención del crecimiento e induce la NED en células de CaP a través de la activación de vías de señalización distintivos; éstos incluyen STAT3 [17] y PIK3-Etk /Bmx [18]. Recientemente, Delk
et al
mostró que la IL-6 secretada por las células del estroma de la médula ósea inducida por NED y la autofagia en el hueso células de CaP metastásico a través de una vía de STAT3-independiente [19]. Por lo tanto, IL-6 se ha sugerido para inducir NED y células de CaP facilitadas refractario convertirse. Esto hace que la IL-6 en un objetivo atractivo para la terapia. Sin embargo, debido a su pleiotropismo, apuntando a IL-6 es probable que resulte en las respuestas impredecibles. Una mejor comprensión de los eventos celulares asociados con la exposición de IL-6 puede ayudar a identificar el potencial de objetivo (s) efectiva para la prevención y /o tratamiento de CaP.
La autofagia, también llamado macroautofagia, es una importante degradación lisosomal regulado vía que las células eucariotas utilizan para degradar las proteínas y orgánulos de larga vida en respuesta a la inanición o la nutrición estrés metabólico. Esta vía autodigestión es esencial para el desarrollo normal y para mantener la homeostasis metabólica intracelular de células terminales diferenciadas tales como neuronas. También es una vía biológica central que funciona para proteger a los organismos contra varios patógenos y contra el cáncer; Por lo tanto, es capaz de promover la salud y la longevidad. Sin embargo, cuando la autofagia es secuestrado por las células cancerosas, emerge como una manera de proteger las células tumorales de la muerte, y por lo tanto es capaz de conferir resistencia a las drogas en las células cancerosas. La comprensión de los mecanismos moleculares asociados con la autofagia comenzó en 1993, cuando los genes relacionados con la autofagia (ATG) se identificaron por primera vez en
S. cerevisiae
[20]. La autofagia es un proceso de múltiples pasos y por lo tanto se puede dividir en varias etapas; (I) la inducción, (ii) nucleación vesícula, (iii) elongación de la vesícula y la terminación para formar el autophagosome, (iv) de acoplamiento y fusión con lisosomas para formar autolysosome, (v) la degradación, y (vi) la recuperación de [21]. Entre los principales reguladores de aguas arriba de la vía de la autofagia, la clase I PI3K (PI3KI) -Akt [22] y MEK1 /ERK [23], [24] moléculas enlazan tirosina quinasas receptoras de mTOR; estos actúan como reguladores negativos clave de la autofagia y, con ello reprimir la autofagia en la presencia de señales similares a la insulina y otros factores de crecimiento. Curiosamente, la función de la clase III PI3K (PI3KIII) es completamente opuesta a la de PI3KI cuando la regulación de la autofagia. Al interactuar con el componente de núcleo beclin1, PI3KIII acelera la autofagia mediante la promoción de la vesícula nucleación [25]. Uno mecanismos de menores implica moléculas LKB1-AMPK, que vinculan el estado de energía intracelular de las células a la regulación negativa de mTOR; esta vía actúa para activar la autofagia en la presencia de tensiones que aumentan la relación de AMP /ATP [26]. Otros mecanismos de menores incluyen p53, ER-estrés Ca
2 + de señalización, y STAT3 citoplasmática. El papel de p53 en la autofagia es paradójica y depende de su localización subcelular [27] - [29]. ER estrés que acompaña Ca
2 + señalización también está implicado en la regulación de la autofagia y esto se produce mediante la activación de AMPK vía CaMKKβ dependiente [30], [31]. Por último, STAT3 citoplásmica suprime la autofagia mediante la unión a la proteína quinasa R (PKR) y la inhibición de la fosforilación de eIF2α [32].
desarrollo de las células NE-como se apoya en una red de represores transcripcionales y activadores que controla la adquisición y mantenimiento de funciones neuronales. Represor elemento-1 silenciamiento factor de transcripción /neurona factor de silenciamiento restrictiva (REST /NRSF) se descubrió primero como un maestro represor transcripcional que es responsable de la restricción de la expresión génica neuronal en células no neuronales [33] - [36]. El represor se une a un joven de 21 pb elemento represor 1 elemento de silenciamiento /neurona restrictiva (RE1 /NRSE) y luego recluta un complejo de remodelación de la cromatina represiva, mSin3 y Co-RESTO. Esto ocurre a través de su dominio de dos represión (uno en el extremo amino y el otro en el terminal carboxilo) y el resultado es el silenciamiento epigenético de la transcripción del gen diana [37]. REST es altamente expresado en células madre embrionarias (CES), células neuronales progenitoras (NPC) y células no neuronales, donde la proteína suprime la expresión de genes específicos neuronales, manteniendo así la pluripotencia de los CES y los NPC mediante la inhibición de la diferenciación neuronal en no neuronal las células [33]. Curiosamente, REST se ha demostrado que inhiben la transcripción de genes de sinaptofisina (SYN) [38], [39], uno de los marcadores comunes de NED en células de CaP. Un informe muy reciente de Svensson
et al
también mostró que RESTO media acciones AR y modula la privación de andrógenos inducida NED en el CaP [40].
Con el fin de orientar la contribución de la NED a la la progresión del CaP en el estado refractario a las hormonas, el presente estudio tiene el objetivo de determinar si la IL-6 es capaz de un máximo de regular la autofagia en las células de CaP, que, a su vez, induce células NED. Esto evitará la apoptosis de células durante NED IL-6 inducida y como resultado permitirá la supervivencia celular NE-como en el CaP recaída. Para hacer frente a nuestra hipótesis, se determinó la capacidad de la IL-6 para inducir la autofagia y la NED en las células LNCaP sensibles a los andrógenos. Se encontró que la autofagia es inducida por IL-6 y desempeña un papel esencial en la IL-6 inducida NED. En concordancia con la activación de la autofagia durante NED, un mayor nivel de LC3 se pueden observar en el tejido CaP recaída y dicho tejido tiene un patrón de tinción similar para focos CGA, un marcador para las células NE-similares. Hemos investigado la autofagia como una señal de potencial que es capaz de proteger células de CaP de la apoptosis y la quimioterapia drogas tales como etopósido. En consonancia con el aumento del nivel de la autofagia, la activación de AMPK y la inhibición de mTOR se demostró que estar presente durante el tratamiento con IL-6 en ausencia de andrógenos. Lo más importante, nuestro estudio identificó la baja regulación de descanso, un silenciador neurona-restrictiva; esto se encontró que era crítico para la inducción de la autofagia NED y la activación de la IL-6.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y plásmidos
p>
Microscopía fluorescente se sembraron
p>
Western se prepararon Blot y anticuerpos
lisados de células totales (TCLS) de las células utilizando tampón de lisis NP-40 [0,5% NP-40 (Amresco, E109), 1 × PBS, 1 x inhibidores de la proteasa (Roche, 04693132001) ]. La concentración de proteína de cada muestra se midió utilizando Bio-Rad reactivo colorante de ensayo de proteínas y el protocolo del fabricante (Bio-Rad, 500-0006). Para inmunotransferencia, cantidades iguales de proteína se cargaron en y separados en un 6% 8% o 15% de gel, SDS-poliacrilamida según el caso. Las proteínas separadas se transfirieron a continuación del gel a 0,45 micras membranas de PVDF de tamaño de poro (GE Healthcare, RPN303F). A continuación, las membranas se bloquearon con tampón de bloqueo [5% de BSA en TBST 1 ×]. Los anticuerpos primarios para p-Akt (Ser473) (La señalización celular,#9271), Akt (Señalización celular,#9272), (Señalización celular,#2976) p-mTOR (Ser2248), mTOR (la señalización celular,#2983), p -STAT3 (Tyr705) (La señalización celular,#9145), STAT3 (señalización celular,#9139), (señalización celular,#9101) p-Erk (Thr202 /Tyr204), Erk (Santa Cruz Biotechnology, sc154), p-AMPK (Thr172) (La señalización celular,#2535), la AMPK (señalización celular,#2793), LC3B (señalización celular,#2775), beclin1 (señalización celular,#3738), ATG5 (señalización celular,#2630), tubulina III ( la señalización celular,#5666), receptor de andrógenos (Millipore, 06-680), REST (Millipore, 09-019), y GAPDH (GeneTex, GTX100118) se diluyeron en BSA al 5% en 1 x TBST. Las membranas fueron sondadas con los diferentes anticuerpos primarios, se trató luego con el anticuerpo secundario apropiado. Por último, las membranas se visualizaron utilizando un Pierce ECL Western Blotting Substrato (Thermo Scientific, 34080) y la imagen a través de un sistema de imágenes /Fluorescencia Luminiscencia (FUJIFILM, LAS-4000).
Inmunohistoquímica La tinción (IHC-tinción)
muestras embebidas en parafina de pacientes con tumor primario y recidivante resistente a la castración CaP que habían sido recogidos entre 1990 y 2010 en el hospital Memorial Mackay se incluyeron en este estudio. Ética fue aprobado por el Consejo del Instituto de la opinión Mackay Memorial Hospital. El consentimiento informado fue escrito. Las secciones de tejido se desparafinaron en xileno, se rehidrataron a través de etanol graduado (100, 90, 80, 70, 50%), se somete a recuperación de antígeno por microondas en 10 mM de tampón de citrato (pH 6,0) durante 10 min, bloqueado por la actividad peroxidasa endógena con 3 % H
2O
2 durante 10 minutos a temperatura ambiente, y después se bloquearon con diluyente de anticuerpo que contiene componentes de fondo-reductor (Dako, S302281). Por último, los portaobjetos se tiñeron durante la noche a 4 ° C con beclin1 (GeneTex, GTX61619), LC3 (Novus Productos Biológicos, NB110-57179), REST (Bethyl, IHC-00141), o CgA (Abcam, ab15160) anticuerpos específicos y se visualizaron siguiente protocolo estándar usando 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) como cromógeno (DAKO, K346430) en presencia de la contratinción con hematoxilina. La histología y tinción fue evaluado por un patólogo a ciegas utilizando una escala de cuatro niveles que representa negativo (0), débil (1), intermedio (2), y fuerte (3) señales
. El 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo
LNCaP, LNCaP-TR-shBeclin1, y las células LNCaP-TR-shAtg5 se sembraron en 96 pocillos placas, se cultivaron durante dos días y, a continuación, tratados como se indica. A continuación, la viabilidad celular se examinó por el ensayo de MTT (Sigma-Aldrich, M5655). MTT se añadió a una concentración final de 0,5 mg /ml y los cristales de formazan se solubilizaron en 10% SDS. La densidad óptica (OD) se cuantificó usando un espectrofotómetro de microplacas a una longitud de onda de 570 y 660 nm.
La caspasa-3/7 Ensayo ELISA
células LNCaP se sembraron en placas de 96 pocillos . El día siguiente, las células se trataron como se indica. /7 niveles de actividad de la caspasa 3-Después se midió utilizando una caspasa-3/7 kit Apo-ONE homogéneo de ensayo (Promega, TB295) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con la mezcla de tampón de sustrato y la reacción. La caspasa-3/7 actividades se midieron utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (Tecan Systems, Infinito 200).
transcripción inversa (RT) y PCR cuantitativa (qPCR)
ARN total fue aislado de la no inducida y Dox inducida por las células LNCaP-TR-shREST utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, 15596-018). El ARN total (2 g) fue transcrito inversa utilizando oligo-dT y superíndice
III RT (Invitrogen, 18080-085). Los niveles de mRNA de varios genes se determinaron luego por qPCR y normalizado contra GAPDH.
Resultados
IL-6 y privación de andrógenos inducen sinérgicamente la autofagia en células LNCaP
evidencia
El aumento tiene se muestra que la autofagia juega un papel importante en el apoyo a la diferenciación neuronal [42] - [44]. Un estudio más reciente también muestra que antophagy puede desempeñar un papel esencial en la IL-6 inducida NED de hueso células de CaP metastásico [19]. Los niveles séricos de IL-6 se han encontrado para aumentar en los pacientes sometidos a terapia de privación de andrógenos (ADT) [12], [14]. Privación de andrógenos [45] e IL-6 [18] También se han encontrado responsable del desarrollo NED y refractaria CaP a ADT. Para estudiar si la autofagia se activa junto con NED de células CaP durante el ADT, privación de andrógenos y la IL-6 tratamiento combinado se usan aquí. línea celular LNCaP, una línea celular de adenocarcinoma de próstata humano sensible a andrógenos rápidamente adquiere características NE, incluido el cese de la mitosis, la extensión de neuritas y una mayor expresión de marcadores neuronales tales como tubulina III, cuando son estimuladas, fue elegido para el estudio. células LNCaP que expresan establemente eGFP-LC3, es decir, células LNCaP-eGFP-LC3, se cultivaron en medio ordinario que contiene 10% de FBS, 2,5%
carbón /dextrano
tratados con FBS (
CDT
) ( la condición de privación de andrógenos), o 2.5% CDT más 100 ng /ml de IL-6. células Autophagosomic (células con GFP-LC3-II punteado) fueron recuento utilizando células LNCaP fijos después de 48 horas de tratamiento. Privación de andrógenos aumentó el número de células sometidas a la autofagia a 41% (Fig. 1). IL-6 solo aumentó el número de células autofágicas a 17% (Fig. 1). Curiosamente, el número de células sometidas a la autofagia inducida por IL-6 de acuerdo con la privación de andrógenos fue significativamente más a 87% (Fig. 1). La inducción de la NED por la privación de andrógenos y tratamiento de IL-6 se confirmó usando las células LNCaP. alargamiento de neuritas, un fenotipo típico de las células NED, se observó (Fig. 2A y 2B). Curiosamente, el grado de inducción de la autofagia fue altamente correlacionado con el grado de NED entre las células LNCaP. Esta correlación se confirmó adicionalmente mediante análisis de transferencia Western. tratamiento con IL-6 aumentó significativamente la expresión del marcador específico de neuronas, tubulina III y la conversión de LC3-I a LC3-II (Fig. 2C). Nuestros hallazgos sugieren que la activación de la autofagia podría ser necesaria para la IL-6 inducida por la NED en condiciones de privación de andrógenos
.
células LNCaP-eGFP-LC3 (A) eran la cultura en FBS al 10%, 2,5% de SFB o 2.5 % CDT complementado RPMI 1640 en ausencia (control) y presencia de 100 ng /ml de IL-6 durante 48 horas. Esto fue seguido de la fijación, la contratinción nuclear con DAPI (azul), y el análisis por microscopía de fluorescencia (FITC, 63 aumentos). (B) Para cada tratamiento, el porcentaje de células con punteada eGFP-LC3 se calculó usando la media de 15 campos microscópicos;
bares, Dakota del Sur.
(A) células LNCaP fueron tratados con 2,5% CDT o 2,5% CDT más 100 ng /ml de IL-6 durante 48 horas. El alargamiento de las neuritas inducida se evaluó mediante microscopía de campo claro (imágenes 40 aumentos). (B) El alargamiento de las neuritas se cuantificó utilizando el promedio de 3-5 campos microscópicos;
bares, Dakota del Sur. las células LNCaP (C) se trataron como se describe en (A). lisados de células totales (TCLS) se prepararon y luego a inmunotransferencia para detectar la tubulina III, receptor de andrógenos (AR) y LC3. GAPDH se utilizó como control de carga.
La autofagia inhibición suprime la NED en células LNCaP
Para determinar si la inducción de la autofagia es esencial para NED inducida por IL-6 en las condiciones de privación de andrógenos, inhibimos autofagia usando cloroquina (CQ), un inhibidor de la autofagia que bloquean el funcionamiento del lisosoma. Como se muestra en la Figura 3A, CQ (50 M) inducida por IL-6 inhibió fuertemente la NED en las células LNCaP y reducir ligeramente la diferenciación inducida por la privación de andrógenos. La cuantificación de la longitud de neuritas por MetaMorph mostró también hubo una inhibición significativa de este fenotipo (Fig. 3B). CQ puede tener efectos no específicos distintos de los que la inhibición de la vía de la autofagia. Para confirmar aún más la importancia de la vía de la autofagia para NED inducida por IL-6 en las condiciones de privación de andrógenos, se emplearon pequeños ARN de horquilla (shRNAs), shBeclin1 y shAtg5, para derribar la expresión de beclin1 (Atg6) y ATG5, dos genes Atg esencial para la iniciación de la autofagia y la formación autofagosoma, respectivamente. En primer lugar, se estableció una línea de caída inducible shBeclin1 celular y una línea celular inducible desmontables shAtg5 en las células LNCaP, a saber LNCaP-TR-shBeclin1 y -shAtg5. La inmunotransferencia mostró que ambos shRNAs fueron capaces de desmontables su objetivo con éxito (Fig. 4A y 5A). Curiosamente, beclin1 desmontables células muestra un grado significativamente menor de NED que las células de control (Fig. 4B y 4C) y se observó un resultado similar en células ATG5 desmontables (Fig. 5B y 5C). los datos de cuantificación mostró que tanto ATG5 y desmontables beclin1 tiene significativa la eficiencia de inhibición de la NED IL-6 inducida (Fig. 4C y 5C). En consonancia con la morfología celular, la inhibición de la NED derribando beclin1 y ATG5 fue identificado por análisis de transferencia de Western usando anticuerpo tubulina III (Fig. 4D y 5D). En conjunto, estos resultados demuestran que la vía de la autofagia es esencial para las células de CaP a someterse a la NED.
células LNCaP-eGFP-LC3 (A) fueron tratados con 2,5% CDT o 2,5% CDT más 100 ng /ml de IL 6, en ausencia y en presencia de 50 mM de cloroquina (CQ) durante 48 horas. Esto fue seguido de la fijación, la contratinción nuclear con DAPI (azul), y el análisis por microscopía de fluorescencia (FITC, 40 aumentos). (B) El alargamiento de las neuritas se cuantificó utilizando el promedio de 3-5 campos microscópicos;
bares, Dakota del Sur.
células (A) LNCaP-TR-shBeclin1 fueron tratados con 1 mg /ml de Dox durante 48 horas. TCLS se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia para detectar beclin1 usando GAPDH como control de carga. (B) células LNCaP-TR-shBeclin1 fueron tratados durante 48 horas con 1 mg /ml Dox el fin de inducir la precipitación de beclin1 y luego se trataron durante otras 48 horas con 2,5% CDT o 2,5% CDT más 100 ng /ml IL -6 para inducir células NED. La inhibición de la elongación de neuritas por caída beclin1 se evaluó mediante microscopía de campo claro (imágenes 40 aumentos). (C) El alargamiento de axones se cuantificó utilizando el promedio de 3-5 campos microscópicos;
bares, Dakota del Sur. (D) TCLS se obtuvieron a partir de células LNCaP-TR-shBeclin1 tratados como se describe en (A) y estos entonces se analizaron por inmunotransferencia utilizando los anticuerpos indicados.
células (A) LNCaP-TR-shAtg5 fueron tratados con 1 mg /ml Dox durante 48 horas. TCLS se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia para detectar ATG5 usando GAPDH como control de carga. (B) células LNCaP-TR-shAtg5 fueron tratados durante 48 horas con 1 mg /ml Dox para inducir desmontables de ATG5 y después se trataron durante otras 48 horas con 2,5% CDT o 2,5% CDT más 100 ng /ml de IL-6 para inducir NED celular. La inhibición de la elongación de neuritas por ATG5 caída se evaluó mediante microscopía de campo claro (imágenes 40 aumentos). (C) El alargamiento de axones se cuantificó utilizando el promedio de 3-5 campos microscópicos;
bares, Dakota del Sur. (D) TCLS obtuvieron a partir de células LNCaP-TR-shAtg5 tratados como se describe en (A) y estos entonces se analizaron por inmunotransferencia utilizando los anticuerpos indicados.
La autofagia de la Expresión Génica en primarias y recaída de CaP muestras
Los resultados anteriores sugieren que la autofagia puede ser activado junto con NED en células de CaP durante la recaída refractario a las hormonas. Para caracterizar la relación entre la autofagia y la NED en células de CaP, se analizó la expresión de la CGA, que es un marcador tumoral NE, y la expresión de LC3, unos relacionados con la autofagia genes, en trece pares de muestras de tejidos de CaP recidivas primarias y refractarios a las hormonas , los pares que se obtienen a partir de un mismo paciente. Representante inmunohistoquímica (IHC) resultados CGA y LC3 se muestran en la Figura 6. La tinción positiva CGA muestra un patrón de focos (figura 6, flechas cerrado.), que es una característica típica de las células NE en muestras de CaP en recaída; Sin embargo, este modelo no estaba presente en las muestras de CaP primarios. Curiosamente, una tinción focos de LC3 también se observó en muestras de CaP en recaída (Fig. 6, flechas abiertas). De los trece pares de muestras de CaP, 8 (62%) mostraron un incremento significativo en la expresión LC3 (inmunorreactividad media LC3 (IR) de tumor CaP primaria y recaída fue de 0,51 y 1,12, respectivamente; P & lt; 0,005) en el tejido CaP recaída comparar a su homólogo del tumor primario.
imágenes de tinción IHC Representante de dos pares de muestras de tejido, es decir, el CP primario y recidivante especímenes de la misma persona, se tiñeron utilizando anti-LC3, anti-CGA, y los anticuerpos anti-REST .
la autofagia inducida por la IL-6 protege a las células LNCaP NE diferenciada de la muerte celular
la autofagia es importante para el mantenimiento de la homeostasis de las células terminales diferenciadas [46]. La observación de que la autofagia se neuroprotector [47] y que la autofagia es inducida por IL-6 nos llevó a formular la hipótesis de que la autofagia puede servir como un mecanismo de protección para mantener la homeostasis y el aumento de la supervivencia de IL-6 inducida por células NE-como terminales diferenciadas . Si este es el caso, la muerte de células debe ser potenciada si se inhibe la autofagia. Con este fin, se realizó un ensayo de MTT para identificar el papel de la vía de la autofagia en IL-6 inducida por la detención del crecimiento y la resistencia a la muerte celular. De acuerdo con estudios anteriores, IL-6 inducida por el tratamiento de detención del crecimiento en células LNCaP (Fig. 7A). Cuando la autofagia fue inhibida por el tratamiento con CQ, esta indujo un aumento significativo en la muerte celular entre IL-6 células LNCaP tratadas (Fig. 7A). Se encontró que el aumento de la muerte celular que es debido en gran parte a la apoptosis mejorada, como se evidencia por la presencia de un aumento significativo de la caspasa-3/7 actividad a las 48 horas después de IL-6 más CQ tratamiento combinado (Fig. 7B). Estos resultados muestran por primera vez que la inhibición de la autofagia es capaz de superar la apoptosis-resistencia de las células diferenciadas NE indued-IL-6 e indican que la autofagia es la causa subyacente detrás de la quimiorresistencia de las células NE-similares.
células LNCaP (a) se cultivaron en 2,5% CDT complementado RPMI 1640 y luego tratados con IL-6 o vehículo de control 100 ng /ml en presencia o ausencia de 50 mM CQ. El número de células se analizaron usando un ensayo de viabilidad celular MTT en los puntos de tiempo indicados.
Puntos
, significa;
bares, Dakota del Sur. (B) las células LNCaP se trataron como se describe en (A) y después se ensayó la actividad de la caspasa-3/7 en los puntos de tiempo indicados. Cada punto de datos que se muestra es la media de tres experimentos independientes;
bares, Dakota del Sur.
El papel protector de la autofagia en la quimio-resistencia del NE diferenciado células de CaP a los fármacos quimioterapéuticos, tales como etopósido fue luego confirmada por los siguientes hallazgos. Como era de esperar, etopósido fue incapaz de matar a las células diferenciadas NE LNCaP inducida por IL-6. Curiosamente, etopósido indujo un aumento estadísticamente significativo en la muerte celular después de la precipitación de las células LNCaP diferenciada ya sea beclin1 o ATG5 en NE que habían sido inducidas por IL-6 en condiciones de privación de andrógenos (Fig. 8). Cuando se toma en conjunto, los resultados anteriores sugieren que la autofagia inducida por IL-6 es capaz de proteger las células LNCaP NE diferenciadas inducidas por IL-6 de la muerte celular apoptótica y que una inhibición de la autofagia es capaz de abrogar la resistencia a la apoptosis, así como la quimioterapia resistencia asociada con células de CaP NE-similares.
LNCaP-TR-shBeclin1 (a) y LNCaP-TR-shAtg5 células (B) fueron tratados con Dox durante 48 horas a inducida ya sea beclin1 o knockdown ATG5, respectivamente, o no se tratan.