Extracto
La quimioterapia es una opción importante para el tratamiento de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón. Sin embargo, la resistencia del tumor a la quimioterapia citotóxica se ha vuelto más común. Se ha informado de que la autofagia es uno de los procesos que contribuyen a esta resistencia. En el presente estudio, se encontró que el fármaco anticanceroso 5-fluorouraci (5-FU) podría inducir la autofagia en las células A549. 5-FU tratamiento podría conducir a la conversión de LC3 I /II, la sobre regulación de Beclin-1, la baja regulación de p62 y la formación de orgánulos vesiculares ácidos (AVO) en células A549. Pre-tratamiento de las células cancerosas con 3-MA o siAtg7 podría mejorar la apoptosis inducida por 5-FU a través de la activación de las caspasas, y el inhibidor de caspasa z-VAD-fmk rescatado la reducción de la viabilidad celular. Además, la inhibición de la autofagia también estimuló la formación de ROS y la compactación de ROS por antioxidante NAC inhibió la actividad de la caspasa-3, impidió la liberación de cyt-c de la mitocondria y finalmente rescatado células cancerosas de la apoptosis mediada por 5-FU. Estos resultados sugieren que la respuesta provocada por autofagia-5-FU juega un papel protector contra la apoptosis celular y la inhibición de la autofagia podría sensibilizarlos a 5-FU inducida por apoptosis dependiente de caspasa a través de la estimulación de la formación de ROS.
Visto : Pan X, X Zhang, Sun H, Zhang J, M Yan, Zhang H (2013) inhibición autofagia Promueve 5-Fluorouraci-apoptosis inducida mediante la estimulación de la formación de ROS en el humano de células no pequeñas cáncer de pulmón A549 células. PLoS ONE 8 (2): e56679. doi: 10.1371 /journal.pone.0056679
Editor: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Japón
Recibido: 13 Octubre, 2012; Aceptado: January 12, 2013; Publicado: 18 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Pan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un proyecto de Programa de la provincia de Shandong para la Educación Superior Ciencia y Tecnología (J10LC66) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant Nos. 81102828, 81273037, 81202516). Los autores también quisieron mostrar su agradecimiento a la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong de China (Nº ZR2011HM011). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las neoplasias más comunes en el mundo y la principal causa de muerte por cáncer en muchos países. Se aproximan al 85% de los casos de cáncer de pulmón pertenecen al cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) [1], [2]. La quimioterapia es una opción importante en curar o controlar el cáncer de pulmón. 5-fluorouracilo (5-FU), que ejerce sus efectos contra el cáncer a través de la inhibición de la timidilato sintasa y la incorporación de sus metabolitos activos en el ARN y el ADN con el fin de influir en el metabolismo de uracilo y, eventualmente, conducir a la apoptosis en la célula de cáncer [3] . En las últimas décadas, las terapias de combinación basada en 5-FU son tratamientos estándar para muchos pacientes diagnosticados con diversos tumores malignos, incluyendo NSCLC [4] - [6]. Sin embargo, junto con su uso, resistencia a 5-FU se ha vuelto común y ha sido reconocido como una razón para el fracaso terapia de muchos tipos de cáncer [7], [8]. Por lo tanto, muchos intentos se han llevado a cabo con el fin de reducir la resistencia y aumentar su eficacia terapéutica. Aunque muchas de las terapias agresivas, tales como nuevos fármacos en combinación con 5-FU, se mejora la supervivencia de los pacientes, el efecto de estas terapias se mantiene lejos de ser satisfactoria en la actualidad. En consecuencia, es deseable encontrar oportunidades terapéuticas más apropiadas para el NSCLC. Aquí, se presenta la inducción de la autofagia de 5-FU en las células A549 NSCLC humanos.
Durante las últimas décadas, la inducción de apoptosis ha sido el objetivo más importante de desarrollo de fármacos contra el cáncer. Sin embargo, las células cancerosas activan múltiples vías para escapar de la apoptosis [1]. Recientemente, la autofagia ha sido ampliamente estudiado en la terapia del cáncer. Además de su función de limpieza en la eliminación de proteínas mal plegadas o agregados, despejando orgánulos dañados y la eliminación de patógenos intracelulares, la autofagia tiene múltiples funciones fisiológicas y fisiopatológicas en la terapia del cáncer. Muchos estudios se han centrado en la relación entre la autofagia y la patogénesis tumoral, el desarrollo y el tratamiento. Sin embargo, la autofagia parece jugar un papel paradójico en la supervivencia de células de cáncer y la muerte. En la quimioterapia, cuando las células se encuentran con algunos fármacos contra el cáncer, la autofagia se induce para proteger las células de cáncer contra la apoptosis para la supervivencia celular. Para ello la autofagia se reconoce como un proceso citoprotector [7], [9] - [11]; Mientras tanto, los estudios recientes han demostrado que la inhibición de la autofagia induce rebajado nivel de apoptosis, por lo tanto, la autofagia participa en la regulación por incremento de la apoptosis [12], [13]; Además, como la apoptosis, autofagia es también una vía alternativa de la muerte celular programada, denominada de tipo II programada muerte celular [14] - [16]. Presumiblemente, el papel de la autofagia puede depender del tipo de tumor y estímulos, la etapa de la tumorigénesis y la situación de apoptosis en células tumorales. modificación apropiada de la autofagia, la inhibición de la autofagia citoprotector para aumentar la apoptosis de las células tumorales en respuesta a agentes contra el cáncer podría mejorar los efectos de la quimioterapia [9]. Por lo tanto, además de la respuesta apoptótica, el estudio de la autofagia es una dirección prospectivo para el desarrollo de fármacos contra el cáncer.
especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel importante en una variedad de programas celulares durante fisiológica como así como las condiciones patológicas. Cuando se produce en cantidades moderadas, ROS actúan como moléculas de señalización en las vías de transducción de señales para regular el crecimiento celular, la diferenciación, la supervivencia, la inflamación y la respuesta inmune [17]. Por otra parte, cuando se produce en exceso, que comparten la capacidad de infligir el daño oxidativo a las moléculas biológicas vitales, como el ADN, lípidos y proteínas, lo que altera su funcionalidad y causa un deterioro de la integridad celular [18]. En los últimos años, la creciente evidencia indica que ROS están implicados en la inducción de la autofagia en la terapia del cáncer [19] - [21], lo que sugiere que ROS juega un papel crucial en la respuesta a la terapéutica del cáncer, la desregulación de la formación de ROS se asocia con el cáncer de iniciación, progresión y la resistencia a los medicamentos.
en este estudio, se investigó el mecanismo subyacente a los efectos anticancerígenos de 5-FU en el carcinoma de pulmón A549. Se encontró que el 5-FU autofagia inducida en células A549 y la inhibición de la autofagia podría dar lugar a la potenciación de la apoptosis mediada por 5-FU. Además, hemos demostrado el mecanismo de que la inhibición de la autofagia sensibilizado celular a la muerte celular apoptótica fue aumentando la formación de ROS que eventualmente facilitó la liberación de citocromo c de la mitocondria, que posteriormente aumento de la apoptosis dependiente de caspasa.
Materiales y Métodos
cultivo de células
las células NSCLC humanas A549 se obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Las células se cultivaron con medio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos (100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) a 37 ° C bajo una atmósfera humidificada de 95 % de aire y 5% de CO
2. Las células en la fase logarítmica de crecimiento se utilizaron en este estudio.
Reactivos y anticuerpos químicos
5-FU, 3-MA, 3- (4,5-dimetil-2-tiazolil) -2,5-diphnyl-2H-tetrazolio (MTT), 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolyl yoduro de carbocianina (JC-1) y 5- (y 6) diacetato de carboxi-2'7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) fueron todos adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Anti-LC3, anti-Beclin1, anti-p62, anti-citocromo c, anti-escindido caspase9, anti-escindido caspase8, anti-escindido anticuerpos PARP anti-escindidos caspase3 y fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.) . anticuerpo anti-actina y los segundos anticuerpos se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (CA, EE.UU.).
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT. Las células se sembraron en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos a una densidad de 1 × 10
4 células /ml con 100 l por pocillo, se incubaron durante 24 h y luego expuestas a las concentraciones indicadas de 5-FU durante los tiempos indicados . Después del tratamiento, se añadió solución de MTT 20 l (5 mg /ml) a cada pocillo y se incubó en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C durante 4 h. Los cristales se disolvieron en 100 l de sulfóxido de dimetilo /pocillo. La absorbancia de la solución se midió a 490 nm con un lector de placas de microtitulación (Bio-Tek ELx800). La viabilidad celular se calculó según la siguiente fórmula: Viabilidad celular (%) = A490 (muestra) /A490 (control) x 100. Al menos tres réplicas se realizaron para cada tratamiento.
inmunofluorescencia para LC3
El nivel de LC3 se examinó usando un ensayo de inmunofluorescencia de acuerdo con nuestro informe anterior [22]. Brevemente, las células A549 se sembraron en cubreobjetos de vidrio. Después del tratamiento con 5-FU (10 M) durante 48 h en presencia o ausencia de 3-MA (5 mmol /L), las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min. Después de la fijación, las células se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 durante 30 minutos y luego se bloquearon con 2% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las células se incubaron con anti-LC3 (1:400 diluido en tampón BSA) anticuerpo a 4 ° C durante la noche y después se hace reaccionar con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y conjugado con IgG de cabra anti-conejo (1:100 diluido en tampón BSA) durante 1 hora a 37 ° C. El núcleo se tiñeron con 1 mol /L DAPI (Sigma-Aldrich) durante 5 min. A continuación, se detectaron puntos lagrimales LC3 y el núcleo teñido bajo un microscopio de fluorescencia y se fusionaron (Olympus, Japón).
Detección de orgánulos vesiculares ácidos (AVO)
Para cuantificar el desarrollo de AVO, las células A549 se se sembraron en placas de 24 pocillos de microtitulación de fondo plano a una densidad de 1 × 10
4 células /ml con 1 ml por pocillo y se incubaron durante 24 h. Después del tratamiento con 10 mM 5-FU durante 48 h en presencia o ausencia de 3-MA (5 mmol /L), las células se tiñeron con naranja de acridina 1 M a 37 ° C en la oscuridad durante 15 min, después se lavaron dos veces con PBS. Imágenes de tinción AO fueron visualizadas inmediatamente usando microscopio de fluorescencia. Para cuantificar el número de vesículas ácidas en las células tratadas, otras células se sembraron en placas de 6 pocillos. Después de la tinción con AO en PBS a 37 ° C durante 15 min, se recogieron las células, se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en 200 l de PBS, después se analizaron por citometría de flujo ensayo. Green (500-550 nm, canal FL1) y rojo (& gt; 650 nm, canal FL3) de fluorescencia, que se ilumina con azul (488 nm) de excitación de luz, se midió usando un citómetro de flujo con software de análisis de CellQuest (Becton Dickinson)
detección de apoptosis por citometría de flujo
la detección se realizó mediante el kit AnnexinV-FITC apoptosis detección (BD Biosciences, San Diego, EE.UU.). Breifly, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h y luego se expuso a 10 mM 5-FU durante 48 h en presencia o ausencia de 3-MA (5 mmol /L). Después del tratamiento, aproximadamente 1 × 10
se cosecharon 6 células, se lavaron dos veces en PBS, y después se tiñeron con Anexina V-FITC y PI de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia resultante se detecta mediante citometría de flujo con el software de análisis CellQuest.
mitocondrial potencial de membrana (MMP) Análisis
Los valores de potencial de membrana mitocondrial se determinó por citometría de flujo utilizando JC-1 tinción según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se recogieron las células tratadas, se lavaron con PBS, y se incubaron con 10 M de JC-1 durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Las células positivas fueron detectados por citómetro de flujo con el software de análisis CellQuest.
Medición de especies reactivas de oxígeno (ROS)
niveles de ROS se determinaron utilizando el marcador fluorescente 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA). En resumen, se tripsinizaron las células tratadas, se lavaron y se incubaron con 10 mM DCFH-DA durante 30 min en la oscuridad, y la intensidad de fluorescencia fue seguido por citómetro de flujo con el software de análisis CellQuest.
Medición de citocromo c Lanzamiento
La fracción de mitocondrias y fracción de citosol se preparó por centrifugación como diferentes Jie Li, MD descrito [3]. Brevemente, se recogieron las células tratadas y se lavaron dos veces con PBS, a continuación, se resuspendieron en un tampón de sacarosa (sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM, 50 mM Tris-HCl pH 7,5 suplementado con PMSF 1 mM, 1 mg /ml de leupeptina, 1 g /ml de pepstatina a, 5 mg /ml de aprotinina, y DTT 5 mM) en hielo durante 30 min. Las células se homogeneizaron y después se centrifugaron a 1000 g durante 10 min a 4 ° C para eliminar los núcleos y las células intactas. La fracción mitocondrias se sedimentó por centrifugación a 10.000 g durante 20 min a 4 ° C. El sobrenadante se centrifuga a 100.000 g durante 60 minutos a 4 ° C para obtener la fracción citosol.
Actividad de la caspasa ensayo
La actividad de las caspasas-3 se midió utilizando comercialmente disponible caspasa ensayo colorimétrico kits (Beyotime, china). En pocas palabras, después de que el tratamiento con agentes indicados, se recogieron las células A459 y se lavaron con PBS mediante centrifugación a 600 g durante 5 min a 4 ° C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis y se dejaron en hielo durante 15 min. Los lisados se centrifugaron a 160.000 g durante 10 min a 4 ° C y se recogió el sobrenadante para el ensayo de la actividad de caspasa 3 en el tampón de lisis que contiene Ac-DEVD-pNA de acuerdo con las instrucciones de los kits. La concentración de pNA fue medida a 405 nm con un lector de placa de microtitulación, que se usa como un indicativo de la actividad de caspasa 3.
Western El análisis de transferencia
células A549, se incubaron con las condiciones respectivas, eran cosechadas y lisadas. Una cantidad igual de proteína se separaron mediante SDS-PAGE (5-15%) y se transfirió a membranas de PVDF. Las membranas borrados se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 h y después se incubaron con los anticuerpos primarios (dilución deseados 1:1000) la noche a 4 ° C. A continuación, las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada usando anticuerpos secundarios IgG de rábano picante y conjugado con peroxidasa. Para cuantificar la igualdad de carga, la membrana se volvió a sondear con anticuerpo β-actina.
Examen de autophagosome por TEM
células A549 fueron fijadas en glutaraldehído al 2,5% a 4 ° C durante la noche, y después se fijaron con 1% El OsO
4 durante 1,5 h. Luego, las células se tiñeron con 70% de etanol saturado con acetato de uranilo, seguido de deshidratación gradiente con etanol-acetona, y finalmente embebidos en resina epoxi para la sección. Los cortes ultrafinos se tiñeron doblemente por acetato de uranilo y citrato de plomo y se analizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM)
ARN de interferencia de ATG7
ARN ATG7 interferencia se llevó a cabo mediante la transfección de las células A549 con el Atg7- dirigido siRNA y el siRNA control universal (Invitrogen; 100 pmol /pocillo). oligo-ARNs cortos fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 24 h de la transfección, las células fueron tratadas con 5-FU para un adicional de 48 h. Entonces se recogieron las células y lisados de células se sometieron a inmunotransferencia de ATG7, LC3 y PARP. Las células también se procesaron para la viabilidad celular y el análisis de la apoptosis.
El análisis estadístico
Los resultados se expresan como la media ± desviación estándar (n≥3). El análisis estadístico entre los dos grupos se calculó utilizando la prueba t de Student, y varios grupos se realizó mediante el programa estadístico SPSS 10.0.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
5-FU inhibe la proliferación celular en las células A549
Con el fin de investigar de 5-fluorouracilo inhibición del crecimiento celular potencial en las células A549, el efecto del tratamiento con 5-FU en las células se examinó con un ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 1A, 5-FU (0-200 mM) produjo una reducción dependiente de la dosis y tiempo- en el crecimiento celular A549. La IC50 para 48 h de tratamiento con 5-FU en las células A549 fue 10,32 ± 0,69 M. Basándose en el resultado, se usó 10 mM de 5-FU durante 48 h en células A549 para experimentos adicionales. Además, los cambios morfológicos también indicaron que el tratamiento con 5-FU disminución de la densidad celular. Curiosamente, 5-FU tratados con células no surgieron personajes apoptóticas muy obvio, pero muchas vacuolas en el citoplasma (Fig. 1B). Esto nos llevó a examinar si la autofagia inducida por 5-FU también se incluyó en las células de cáncer de pulmón.
(A) La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT tras el tratamiento con diferentes concentraciones de 5-FU para 24 h y 48 h . IC50 se calculó por el programa de software IC50. se observó (B) Los cambios morfológicos después de tratar las células con 10 mmol /L 5-FU durante 48 h mediante un microscopio invertido (Olympus, Japón). Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
5-FU induce la autofagia en las células A549
A continuación, microscopía electrónica de transmisión se utiliza para comprobar la formación de autofagosomas de 5- FU células tratadas. Como se muestra en la Figura 2A, el tratamiento con 5-FU para 6-48 h causado la acumulación de vacuolas autofágicas, que exhibe características autofagosoma y /o autolysosomal, mientras que sólo se observaron unas pocas vacuolas en las células de control. -Autofagia específica marcadores LC3, Beclin-1 y p62 también se utilizaron para examinar los niveles autofágicas y el flujo autophagic en este proceso mediante análisis de inmunotransferencia. Como se muestra en la Fig. 2B, la sobre regulación de Beclin-1, la baja regulación de p62 y la conversión de LC3 I /II demostró el aumento de formación de autofagosomas de una manera dependiente del tiempo en células A549.
Se trataron células A549 con 10 mmol /L 5-FU para el tiempo diferente, como se indica, a continuación, se detectaron las autofagosomas y los niveles de autofagia. (A) La formación de autofagosomas en las células tratadas fueron controlados por TEM. (B) LC3, Beclin-1 y p62 fueron examinados por Western blot. β-actina era un control de carga. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
A continuación, el fin de demostrar aún más la autofagia inducida por 5-FU, se introdujo 3-MA, que es un inhibidor de la autofagia populares [3 ]. 5 mM 3-MA se añadió a las células A549 durante 1 h antes de la 5-FU exposición. Las células se dividieron en cuatro grupos: control (sin tratamiento), 3-MA (trató con 3-MA), 5-FU (tratados con 5-FU), y la combinación de (tratados con ambos de 5-FU y 3-MA) . citometría de flujo se realizó después de la tinción de células con naranja de acridina para la cuantificación de objetos AVO. Los resultados mostraron que el número de vesículas ácidas en grupo 5-FU aumentó obviamente, que fue inhibida por 3-MA, confirmando la inducción de la autofagia (Fig. 3A y C). Resultados similares se obtuvieron también en el examen microscópico de fluorescencia. Como se muestra en la Fig. 3B, las células A549 tratadas con 5-FU durante 48 h visualiza un gran número de vesículas fluorescentes en el citoplasma, mientras que se observaron en el grupo control, el grupo 3-MA y el grupo de combinación sólo unos pocos de vesículas fluorescentes. Además, también se llevaron a cabo inmunofluorescencia LC3 y de inmunotransferencia. La microscopia de fluorescencia reveló la distribución puntiforme de LC3 mayor fluorescencia en el grupo de 5-FU (Fig. 3D). Western blot también indicó que la expresión de LC3 en el grupo de combinación revirtió en parte al estado original, al mismo tiempo, lo que refleja el efecto inhibidor eficaz de 3-MA (Fig. 3E). Estos resultados demostraron que la autofagia se indujo en las células A549-tratados con 5-FU. Por lo tanto, decidimos investigar si la inhibición de la autofagia afecta a la sensibilidad de las células A549 a tratamiento con 5-FU.
Las células fueron pretratadas con 5 mmol /L de 3-MA durante 1 hora antes de la exposición a 10 mmol /L 5-FU durante 48 h, a continuación, acridina naranja se utiliza para teñir objetos AVO, las células activadas por fluorescencia se analizaron por citometría de flujo (a). Después del tratamiento, las células se tiñeron con naranja de acridina para la observación AVO. Las células se visualizaron con un microscopio de fluorescencia filtro rojo (B). A la cuantificación de las células en desarrollo AVO en las células A549, el porcentaje de objetos AVO desarrollado se calculó basándose en los resultados de fluorescencia de células activadas por la clasificación de ensayo (C). microscopio fluorescente por la tinción de inmunofluorescencia para LC3 en las células A549-tratado (D). El análisis de transferencia Western se llevó a cabo para detectar los niveles de proteína LC3. Las transferencias se re-probaron con anti-β-actina como control de carga (E). Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
inhibición de la autofagia mejora inducida por 5-FU muerte celular por apoptosis
En primer lugar, examinar si la inhibición de la autofagia sensibiliza a las células A549 a 5-FU inducida por la muerte celular, el efecto del tratamiento se examinó con el ensayo de MTT (Fig. 4A). En el grupo de combinación, la viabilidad de las células A549 se redujo más rápido que en el grupo de 5-FU, el grupo de combinación condujo 65,75% de las células a la muerte, un aumento de aproximadamente 39,28% en que en el grupo de 5-FU. Aunque la viabilidad de las células en el grupo 3-MA también disminuyó, la medida no fue significativa. Estos resultados indicaron que 3-MA mejora la muerte celular inducida por 5-FU en las células A549. A continuación, para validar la observación de que la inhibición de la autofagia afecta a la sensibilidad de células a 5-FU, anexina V-FITC y se realizó tinción con PI. análisis cytometic de flujo mostró que el número de AV y las células AV /PI-positivas aumentó significativamente en el grupo de tratamiento combinado de 5-FU solo grupo de tratamiento (Fig. 4B). Para confirmar aún más esto, los ejecutores, caspasa-8, caspasa-9, se examinaron a continuación, caspasa-3 y PARP. En 5 tratados con-FU grupos, estaban todos escinde en sus formas activas específicas, y la actividad en las células tratadas con 5-FU con la autofagia inhibido fue significativamente mayor que en las células tratadas con 5-FU solo (Fig. 4C).
Las células fueron pretratadas con 5 mmol /L de 3-MA durante 1 hora antes de la exposición a 10 mmol /L 5-FU durante 48 h. (A) La viabilidad celular se midió con un ensayo MTT. Los datos representan las medias de cuatro experimentos independientes. (B) la tasa de mortalidad celular se analizó por el ensayo de Anexina V mediante citometría de flujo como se describe en los Materiales y métodos. (C) Los lisados celulares se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos para la caspasa-9, caspasa-8, caspasa-3, PARP, y β-actina. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
El papel de la autofagia en la citotoxicidad mediada por 5-FU se estudió adicionalmente por derribar la expresión ATG7 utilizando siRNA. Como se muestra en la Fig. 5, la expresión de ATG7 fue suprimido notablemente en células A549 transfectadas con siRNA ATG7 pero no aquellos con Control de siRNA (Fig. 5A). En consecuencia, las células transfectadas con siRNA ATG7 mostraron un nivel de acumulación de LC3-II más bajos y mayor nivel de clPARP después de 5-FU tratamiento (Fig. 5A). Además, el efecto citotóxico del 5-FU se incrementó significativamente por bloqueo de la expresión ATG7 y el inhibidor de pancaspase z-VAD-fmk rescató a la muerte celular (Fig. 5B). Del mismo modo, el grado de la apoptosis inducida por 5-FU también se mejoró cuando derribando la expresión ATG7 y z-VAD-fmk redujo la apoptosis de las células de forma significativa (Fig. 5C). Como se resume en la Fig. 5, desmontables de ATG7 también aceleran la apoptosis inducida por 5-FU. Estos resultados fueron consistentes con el uso de 3-MA, que demuestran que la autofagia inducida por 5-FU juega un papel protector de las células tumorales contra la apoptosis, y el bloqueo de la autofagia posteriormente aumentó la apoptosis a través de la activación de las caspasas en las células A549.
las células fueron transfectadas con siRNA ATG7 y las orientadas por el ARNsi de control durante 24 h antes de la exposición a 10 mmol /L 5-FU durante 48 h. (A) Los lisados celulares se prepararon y se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos a LC3, ATG7, PARP, y b-actina. viabilidad (B) de la célula se midió utilizando el ensayo MTT. la muerte celular (C) apoptótica se analizó por el ensayo de Anexina V /PI. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Los cambios de mitocondrial potencial de membrana y la liberación del citocromo c de la mitocondria
Estudios anteriores demostraron que la activación de las caspasas fue impulsado por el cyt -c través intrínseca vía mitocondrial de apoptosis [23], [24]. Por lo tanto, el impacto de la autofagia inhibido, sobre la liberación mediada por 5-FU de cyt-c de la mitocondria en el citosol se investigó mediante fraccionamiento de la célula. Los resultados obtenidos revelaron que la inhibición de la autofagia en 5-FU tratados con células conducido a un aumento drástico en la acumulación de citocromo c en el citosol (Fig. 6A). El efecto sobre las mitocondrias también fue confirmado por una caída en el potencial de membrana mitocondrial. Como se muestra en la Fig. 6B, la inhibición de la autofagia en 5-FU tratados con células induce una disminución evidente del potencial de membrana mitocondrial. Estos datos sugieren que la pérdida de potencial de membrana mitocondrial puede ser necesario para 5-FU combinado liberación 3-MA inducida cyt-c en el citosol, que más tarde se desencadena la activación y la escisión de las caspasas y dio como resultado la apoptosis de células
.
Las células se tratado como en la figura. Se aislaron 3. (A) Las mitocondrias y las fracciones de citosol como se describe en los materiales y métodos, y después se sometieron a inmunotransferencia para la detección de citocromo c. (B) El cambio MMP se evaluó por JC-1 tinción por citometría de flujo como se describe en los Materiales y métodos. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
La inhibición de la autofagia estimula la formación de ROS, que se requiere para la apoptosis mediada por 5-FU en células A549
Recientemente, varios informes proporcionado evidencia de la participación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la inducción de la autofagia y apoptosis y demostrado la importancia de las ROS en la liberación de cyt-c de la mitocondria [25], [26]. Por lo tanto, hemos decidido analizar si la inhibición de la autofagia podría estimular la generación de ROS en células A549-tratados con 5-FU. Las células tratadas se tiñeron con clorometil-2 ', 7'-diacetato de diclorofluoresceína (CM-H2-DCFDA), un colorante de fluorescencia de células permeable que reacciona a un amplio espectro de ROS. Como se muestra en la Figura 7A, los niveles de ROS se aumentaron obviamente en las células tratadas con 5-FU combinado con 3-MA en comparación con 5-FU solo por citometría de flujo, y tal aumento fue atenuada de manera eficiente cuando las células se trataron previamente con 10 mM N- acetil cisteína (NAC) durante 1 h. Puesto que el nivel de ROS fue elevado en las células con la autofagia suprimida, se analizaron, además, si la inhibición de ROS influenciada la muerte celular mediada por 5-FU. Para este propósito, la formación de ROS fue inhibido por NAC y la apoptosis se midió por citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 7B, la sensibilización de las células a la apoptosis celular inducida por 5-FU fue completamente bloqueado por la prevención de la formación de ROS. Por último, se investigó si la inhibición de ROS influyó en la actividad de la caspasa y la liberación de cyt-c. De hecho, la compactación de los ROS inhibió la actividad de la caspasa-3, impidió la liberación de cyt-c de la mitocondria, y rescató a células A549 de la apoptosis mediada por 5-FU (Fig. 7C y D). Estos resultados indican claramente que la generación de ROS juega un papel importante en la regulación de la muerte celular en respuesta a 5-FU.
Las células se trataron previamente con NAC 10 mM durante 1 h antes de 10 mmol /L 5-FU ( 48 h) tratamiento en presencia o ausencia de 3-MA. (A) Se detectó la generación de ROS mediante DCFDA por un citómetro de flujo. Los datos se procesaron con el software CellQuest y se analizaron por densitometría. muerte (B) celular se midió mediante tinción con anexina V /PI. (C) Ensayo de actividad de caspasa-3 se realizó como se describe en los Materiales y Métodos. (D) El nivel cyt-C en la fracción de citosol se detectó por inmunotransferencia. Todos los datos son representativos de al menos tres experimentos independientes.
Discusión
En el cáncer de pulmón, la quimioterapia se utiliza ampliamente para curar y prolongar la supervivencia postoperatoria en pacientes. 5-fluorouracilo (5-FU) se utiliza eficazmente como un medicamento en el tratamiento de una variedad de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de pulmón. El principal mecanismo que subyace a su actividad antitumoral se ha atribuido a la interferencia de la síntesis de ADN y ARN. En las últimas décadas, la inducción de apoptosis por 5-FU ha sido el objetivo más importante de la terapia del cáncer [27] - [29]. Recientemente, la autofagia se ha observado ampliamente en 5-FU tratamiento [3], [7], [30] - [32]. En nuestro estudio, encontramos que el 5-FU podría inhibir la proliferación de células A549, obviamente, (Fig. 1A), que incluía la autofagia celular y la muerte celular por apoptosis (Fig. 2,3,4 y 5). Nuestros resultados también mostraron que tanto LC3-II y Beclin1, que han sido considerados el marcador de la autofagia [33], se aumentó significativamente después de tratamiento con 5-FU en las células A549 acompañadas de la regulación por disminución de la expresión de p62 (Fig. 2B). Mientras tanto, el aumento de formación de autofagosomas y /o autolysosomal con el tiempo detectado por TEM (Fig. 2A) y el aumento de la formación de la característica de objetos AVO en citoplasmática proporcionan otras dos pruebas (Fig. 3A-C). Todos estos resultados indican que la autofagia fue inducida por 5-FU.
autofagia es un sistema de degradación mayor intracelular que se encuentra de forma ubicua en las células eucariotas, que es responsable de la degradación de la mayoría de las proteínas de larga vida y algunos orgánulos. componentes citoplasmáticos, incluyendo orgánulos, son secuestradas en autofagosomas-dobles membraned y luego se fusionan con los lisosomas para formar autolisosomas donde sus contenidos son degradados. Los productos degradados son reciclados al citoplasma para su reutilización [34]. La autofagia es estimulada en respuesta a factores de estrés externos y necesidades internas para mantener el metabolismo celular, así como la supervivencia. Sin embargo, la autofagia también puede resultar en la muerte celular llamado "muerte celular autofágica" (celular programada Tipo Muerte II) a través de exceso de auto-digestión y degradación de los constituyentes celulares esenciales en ciertas circunstancias [18], [35]. Recientemente, un creciente cuerpo de evidencia indica el papel de la autofagia en la propagación del cáncer y en respuesta a la terapia. Sin embargo, en la quimioterapia del cáncer, la autofagia parece jugar un papel en conflicto, probablemente promover o inhibir la apoptosis, en la supervivencia celular del cáncer y la muerte [9]. Con el fin de investigar la contribución de la autofagia en el proceso de la apoptosis de células A549 inducida por 5-FU, se utilizó inhibidor de la autofagia 3-MA, un inhibidor específico del proceso de autofagia en etapa temprana, en este estudio. Como era de esperar, 3-MA inhibe la autofagia inducida por 5-FU (Fig. 3). inhibición autofagia aumento de la apoptosis celular inducida por 5-FU a través de la activación de caspasas en células A549 (Fig. 4). Para aclarar aún más el papel de la autofagia en la muerte celular A549 inducida por 5-FU, se utilizó ATG7 siRNA para derribar ATG7 y evaluamos el papel de la autofagia de forma más directa. En consonancia con los resultados utilizando 3-MA, la transfección de ARNsi ATG7 inhibido eficazmente la acumulación de LC3-II, aumento de la producción clPARP y mejorado la muerte celular apoptótica inducida por 5-FU en las células A549 (Fig. 5). 6 y Fig.