Extracto
Berberin, extraído de la medicina china a base de hierbas chinensis Coptis, se ha encontrado que tienen efectos anti El tumor actividades. Sin embargo, los mecanismos subyacentes no han sido completamente aclarada. Nuestro estudio demostró que inhibe la Berberin
in vitro
y
in vivo
el crecimiento, la migración /invasión de las células del CRC, a través de la atenuación de los niveles de expresión de la COX-2 /PGE
2, siguiente mediante la reducción de la fosforilación de JAK2 y STAT3, así como la expresión de MMP-2 /-9. Aclaramos además que un aumento de la COX-2 /PGE
2 expresión compensar la actividad represiva de Berberin en la señalización JAK2 /STAT3, y un inhibidor de JAK2 AZD1480 bloquea el efecto de la COX-2 /PGE
2 sobre MMP 2 /-9 expresión. En resumen, Berberin inhibida CRC invasión y metástasis a través de la baja regulación de la COX-2 /PGE
2- JAK2 /STAT3 vía de señalización
Visto:. Liu X, Q Ji, YE N, H Sui, Zhou L, Zhu H, et al. (2015) La berberina inhibe la invasión y metástasis de células de cáncer colorrectal a través de la COX-2 /PGE
2 Mediada JAK2 /STAT3 vía de señalización. PLoS ONE 10 (5): e0123478. doi: 10.1371 /journal.pone.0123478
Editor Académico: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: Diciembre 10, 2014; Aceptado: February 18, 2015; Publicado: May 8, 2015
Derechos de Autor © 2015 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81303103, 81473478, 81303102), Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (13ZR1461000, 14140901402) y el Programa de Shanghai Comisión Municipal de Educación (13CG47, 13YZ045). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las neoplasias humanas más comunes, ocupando la tercera para la incidencia de cáncer en el mundo [1]. En la actualidad, la cirugía es la mejor opción para el tratamiento de la CRC, pero la tasa de metástasis tumoral post-quirúrgica sigue siendo alta, a consecuencia de la invasión y migración de las células de CRC en el tumor y los tejidos circundantes órganos distales [2-3]. Por lo tanto, para bloquear la metástasis de células de CRC es una estrategia crucial de la terapia del cáncer.
Berberin, un alcaloide aislado de Coptischinensis tradicional medicina china, tiene propiedades anti-inflammary, efectos anti-infecciosos y se ha utilizado para tratar la diabetes y hipertensión [4-6]. Más recientemente, se ha encontrado Berberin tener actividad antitumoral, al afectar la MMP-2 /-9 expresión [7-8], pero el mecanismo molecular subyacente sigue siendo difícil de alcanzar.
Estudios previos han encontrado que, sobre- expresión de COX-2 se correlaciona con la tumorigénesis CRC, no sólo se promover la proliferación de células tumorales e inhibir la apoptosis, sino también mejorar la angiogénesis tumoral, la unión de las células tumorales así como la migración /invasión [9]. La prostaglandina E2 (PGE
2), el producto principal catalizada de la COX-2 a partir de ácido araquidónico, desempeña un papel clave en la tumorigénesis CRC [10]. JAK2 vía de señalización /STAT3 se activa de forma persistente en el CRC, hasta la regulación de los niveles de expresión de genes aguas abajo tales como la MMP-2 /-9 resulta en aumento de la migración de células de cáncer /invasión y la metástasis del tumor [11-12]. A pesar de la evidencia recolectada en la próstata, cáncer de pulmón y colangiocarcinoma atestiguan una estrecha asociación entre la COX-2 /PGE
2 y JAK2 señalización /STAT3 vías activadas [13-15], como la correlación y su importancia en el CCR todavía tienen que ser dilucidado . Nuestro estudio investigó el mecanismo del efecto inhibidor de Berberin en CRC invasión y metástasis, y reveló un papel significativo de JAK2 /STAT3 y COX-2 /PGE
2 de señalización en estos procesos.
Materiales y métodos
cultivo de células y reactivos
El cáncer colorrectal humano células SW620 y LoVo se adquirieron de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). células SW620 se cultivaron en L-15 células medianas y LoVo en medio F12K suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 g /ml de estreptomicina, 100 U /ml de penicilina, a 37 ° C, 5% de CO
2, y alto humedad. La berberina se adquirió de Aldrich-Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.), ADZ1480, un inhibidor de JAK2, desde Selleck (Houston, TX, EE.UU.). Para
in vitro
estudios, berberina se disolvió en dimetil sulfóxido (DMSO) y se congelaron en alícuotas a -80 ° C. Para
in vivo
experimentos, berberina se suspendió en agua suplementada con 0,5% de carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na) y se almacenaron a 4 ° C. Además, DMSO y CMC-Na se usaron como el control del vehículo en todo nuestro estudio. Los anticuerpos contra la COX-2, p-JAK2, JAK2, p-STAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9, β-actina, y la IgG anti-conejo HRP-cabra, HRP-cabra anti-IgG de ratón se adquirieron de Señalización celular (Beverly, MA, EE.UU.).
casos clínicos
muestras de carcinoma colorrectal humano y la no acertaron tumores se recogieron muestras de tejido de colon en el momento de la resección quirúrgica en el hospital Shuguang, Universidad de Shanghai de Medicina tradicional china. Todas las investigaciones con seres humanos han sido aprobados por el Comité de Ética del Hospital Shuguang, la Universidad de Shanghai de Medicina Tradicional China, y todas las investigaciones clínicas se han realizado de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. Todos los pacientes previstos "consentimiento informado por escrito" para participar en este estudio.
Ensayos de viabilidad celular
células CRC Humano (5 × 10
3) se sembraron en placas de 96 pocillos en 100 medios de cultivo mu l, después de la fijación, se trataron con Berberin en dosis de 0, 5, 10, 20, 40 y 80 mM. A los 24, 48, 72 horas después del tratamiento, la viabilidad celular se midió utilizando CCK-8 kit (Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se añadió CCK-8 reactivo en las células y se incubó durante 4 horas, la absorbancia (DO) se cuantificó por 490 nm con una longitud de onda de referencia de 630 nm. La viabilidad celular = (ODN-DO
0) /(ODC-DO
0) × 100%, DO
0:. en blanco, ODC control no tratado, ODN, Berberin tratados
xenoinjerto modelo de ratón
Hombre Balb /c ratones desnudos, la edad de 4-6 meses, se pesan 18 ± 2 g, fueron adquiridos de SLAC de animales de laboratorio Co, Ltd (Shanghai, china, licencia no. SCXK 2.012 a 0.002) y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos para los estudios. Todo el trabajo con animales se han realizado de acuerdo con el Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucional de la Universidad de Shanghai de Medicina Tradicional China, y toda la investigación fueron aprobados por la Comisión de Cuidado de Animales de Medicina Experimental de Shanghai y de acuerdo con la Disposición y la Recomendación General de Administración chinos Animales Experimentales Legislación. Como se ha descrito anteriormente [16], las células de CRC (1 × 10
6, en 0,2 ml de PBS) se inyectaron por vía subcutánea en los flancos de los ratones desnudos para iniciar el crecimiento del tumor. Cuando los tumores alcanzan un tamaño medio de 100 mm
3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en 5 grupos (6 ratones por grupo): Grupo 1 ratones: Control (CMC-Na); los grupos 2, 3, 4: Berberin gavaged vía oral, en 50, 100, 200 mg /kg /d, respectivamente; grupo 5: intraperitonealmente inyecta 5-FU, a 50 mg /kg /2d. El peso corporal de los animales y los dos diámetros perpendiculares (ayb) se registraron cada 2 días y el volumen tumoral (TV) se estimó como: TV = ab
2/2. Los ratones se sacrificaron después de 4 semanas de tratamiento y los tumores se extirparon y se pesaron. La tasa de inhibición del tumor se calculó como: (peso 1-medio del tumor de los ratones tratados /peso medio de los tumores de los ratones de control) x 100%. Mientras tanto, se recogió sangre para el análisis de la alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), creatinina (CT), nitrógeno de urea (ONU) utilizando el kit ELISA (Bogoo, Shanghai, China) según las instrucciones del fabricante.
CRC metástasis de pulmón modelo de ratón
metástasis pulmonares experimentales de CRC fueron inducidos por la inyección de una suspensión de una sola célula de las células de CRC (1 × 10
6 en 0,2 ml de PBS) en la vena lateral de la cola de nude ratones, que fueron asignados al azar en 5 grupos de tratamiento como se describe en los estudios de xenoinjertos [17]. Los ratones se sacrificaron después de 4 semanas de tratamiento, se extirparon los órganos de pulmón, fijado por formalina y embebidos en parafina para el análisis adicional.
Histología e inmunohistoquímica (IHC)
Los órganos y tumores se eliminado, fijado con formalina, embebido con parafina y se seccionaron [18]. IHC de la COX-2 y P-STAT3 se realizó en las secciones de 5 micras utilizando anticuerpos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). Las imágenes fueron analizados y cuantificados por el valor total de la densidad óptica (IOD) para la positividad IHC por Imagen pro-plus 6.0 del software.
Ensayos
migración celular y la invasión
A 24 pocillos Transwell placa (tamaño de poro de 8 mm, Corning, NY, EE.UU.) se utilizó para medir la capacidad migratoria e invasiva de cada línea celular, como ya hemos descrito [19]. Las células CRC fueron tratados por Berberin durante 48 horas antes de ser tripsinizaron y se sembraron en la cámara transwell superior (2.5 × 10
4) en 1% de los medios de cultivo de FBS, con la cámara inferior que contiene los medios de comunicación 600 l con 15% de SFB y 10μg /ml de fibronectina. Veinticuatro horas más tarde, las células migradas se fijaron en un 95% de alcohol, manchados por tinción con violeta cristal, se analizan mediante microscopio (Ti-E, Nikon, Tokio, Japón). Para el ensayo de invasión, 100 l diluidos de Matrigel (100μg /ml, BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) se añadió en primer lugar a la parte inferior de la cámara transwell, el siguiente procedimiento fue el mismo que el análisis de la migración, a excepción de las células invasoras que se analiza después de 48 horas. se realizaron
Western blot
lisis celular, extracción de proteínas y Western blot análisis como se describe anteriormente [20]. Las muestras de proteína (20 mg) se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10%, se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon en 5% no grasa tampón de leche en polvo (10 mmol /l de Tris, pH 7,5, 100 mmol /l de NaCl, 0,1% de Tween 20), antes de ser incubadas con anticuerpos primarios y secundarios posteriores, y auto fotografiados. Los datos obtenidos de los experimentos de Western blot se analizaron por Bio-Rad Quantity One 1D software de análisis (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
luciferasa reportero de ensayo
Utilizando el protocolo establecido [ ,,,0],21], pGL3-Basic-COX-2 promotor y un vector de control pRL-SV40 se transfectaron en células de CRC. Veinticuatro horas después de la transfección, se añadieron diversas dosis de Berberin sobre las células durante 48 horas adicionales. A continuación, las mediciones de la luciérnaga y
Renilla
actividades de luciferasa en los lisados celulares se llevaron a cabo utilizando el sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega, Madison, EE.UU.). Los datos se presentan como la relación de actividad de luciferasa de luciérnaga a
Renilla
actividad de la luciferasa en cada muestra realizado por triplicado ± SD.
ELISA
Después de ser tratado con diferentes concentraciones de Berberin durante 48 horas, las células fueron re-CRC sembraron en placas de 24 pocillos (5 x 10
4 en 0,5 ml de medio de cultivo). Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogieron los medios condicionados, se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min), y se miden para PGE
2 concentración usando un kit de ELISA (Bogoo, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
el exceso de expresión y la caída de las células de la COX-2 gen
CRC fueron transfectadas con el vector de control de los pIRES2 utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.) después de pIRES2-COX-2 o el las instrucciones del fabricante, y las células que sobreexpresan de forma estable del vector de la COX-2 o de control se seleccionó con neomicina (G418, 1 mg /ml). Para shRNA mediada gen desmontables, las células CRC eran Lipofectamine 2000 transfectadas por los plásmidos Pfu-GW-RNAi que contienen secuencias de siRNA COX-2-específicos: 1: 5-GCTGAATTTAACACCCTCTAT-3, 2: 5-GCAGATGAAATACCAGTCTTT-3, o la secuencia de scramble: las células transfectadas 5-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3, y se seleccionaron con neomicina. La eficiencia del gen desmontables se determinó por cuantitativa en tiempo real PCR y Western Blot.
La extracción de RNA y análisis cuantitativo en tiempo real
El ARN total fue extraído por medio de Trizol (Takara Bio Inc, Dalian, China) según las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó usando PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Takara Bio Inc, Dalian, China). Las siguientes secuencias se utilizaron cebadores para la amplificación por PCR: COX-2 humana hacia adelante: 5'-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 ', e inverso: 5'-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3'; la sonda TaqMan: 5'-FAM-TGGCAGGGTTGCTGGTGGTAG GA-3-TAMRA -3 '(brillo gene, Shanghai, china); GAPDH hacia adelante: 5'-CCACTCCTCCACCTTTGA C-3 'y revertir: 5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'; sonda TaqMan: 5'-FAM-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3 '(Gen Shine, Shanghai, China). PCR en tiempo real se realizó en el Applied Biosystems 7300 Sistema utilizando Premezcla Ex Taq (Takara Bio Inc, Dalian, China).
El análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (versión 18) software, se presentaron los datos como medias con desviación estándar (SD), y la comparación estadística se realizó mediante la prueba t de Student, análisis de ANOVA de una sola vía, prueba de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultado
1.Berberin inhibió el crecimiento celular y la migración /invasión de CRC in vitro e in vivo
Primero probamos el efecto inhibidor de Berberin en xenoinjertos de tumores establecidos de líneas celulares de CRC humanos SW260 y LoVo en ratones. Como se muestra en la figura 1A y 1B, Berberin indujo una tasa de inhibición del tumor de 25,83% y 30,66% en los tumores SW620 y LoVo, respectivamente. Además, Berberin ratones tratados no han alterado el peso corporal y las funciones del hígado y de los riñones mantenido normal (Fig S1 y el cuadro S1), lo que sugiere que no hay toxicidad del compuesto en las concentraciones indicadas. A continuación demostramos que Berberin reprimida
in vitro
crecimiento de las células de estas dos líneas celulares de CRC, con una IC50 de 54,41 M durante SW620 y 78,66 M durante LoVo, a las 48 h post-tratamiento (Figura 1C). Indicamos además que Berberin disminuyó la metástasis de pulmón de células CRC en un modelo de ratón inducida por la inyección en vena de cola, de una manera dependiente de la dosis del fármaco (Figura 1D).
in vitro
transwell estudios confirmaron que Berberin, a concentraciones de fármaco de 10, 20 y 40 mM, pueden efectivamente en peligro la capacidad de las células de CRC para migrar e invadir (Figura 1E).
A. Berberin inhibe el crecimiento de tumores de xenoinjertos CRC. Por vía subcutánea tumores implantados de línea celular SW620 y LoVo CRC fueron tratados con el control, 5-FU, y 3 dosis de Berberin durante 28 días. Los volúmenes tumorales de los diferentes grupos de ratones fueron grabadas y presentadas. tumores de xenoinjerto B. extirpados de los ratones tratados con fármacos y la duración indicados en A. C. Berberin disminuye CRC viabilidad celular
in vitro
. células SW620 y LoVo se trataron con concentraciones variables de Berberin para 24, 48 y 72 h. Se muestra el valor medio ± SE de 5 repeticiones. D. Berberin disminuye la metástasis de pulmón de células CRC en ratones. Los ratones que llevan SW620 y LoVo metástasis de pulmón de células fueron tratados con dosis Berberin variable indicada. Panel superior: representante manchó secciones de pulmón de ratón con el CRC focos metástasis de las células. Panel inferior: número de focos de pulmón CRC metástasis en el control y ratones tratados Berberin. E. Berberin inhibe la migración y la invasión de células de CRC. la migración celular y la invasión de los resultados del ensayo CRC líneas celulares SW620 y LoVo, tratados con Berberin o control. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. Los bares y barras de error representan las medias ± SE, y el
P
-valor se calculó utilizando un independiente
t-test
. **
P Hotel & lt; 0,01, control frente a tratarse;
##
P Hotel & lt; 0,01, control frente a tratado
2.Berberin baja regulado los niveles de expresión de COX-2 y PGE2 en las células CRC
.
a continuación se investigó los mecanismos subyacentes para la inhibición de la migración celular CRC /invasión de Berberin. Comenzamos encontrando que en las células SW620 y LoVo, los niveles de expresión de COX-2 y PGE
2 fueron atenuadas por Berberin en una forma dependiente de la dosis del fármaco (Fig 2A, 2B y 2D). Estos datos se corroboró mediante un ensayo reportero de luciferasa promotor COX-2, lo que indica que la actividad de COX-2 promotor fue reprimida por Berberin (Fig 2C). Para apoyar nuestra hipótesis, se realizó la COX-2 sobre-expresión y experimentos de eliminación, que muestra que el aumento de los niveles de la proteína COX-2 sobre marcado la capacidad migratoria /invasivo de las células CRC mientras que el gen COX-2 por KO del shRNA construir alcanzó el efecto contrario (Fig 2E). Por otra parte, la adición de PGE
2, el producto catalizado aguas abajo de la COX-2, también aumentaba el grado de migración y la invasión en las células de CRC (Figura 2F).
A. y B. extractos de células SW620 y LoVo tratados con Berberin a las concentraciones indicadas para se analizaron 48 h para la COX-2. células C. SW620 y LoVo fueron transfectadas con un constructo indicador de la COX-2 y un TK-
Renilla
construir (para control de transfección /carga) durante 24 h, se trata con las dosis indicadas de Berberin durante otras 48 h, y se lisaron y se somete a la luciérnaga y Renilla
mediciones de la actividad luciferasa. Las barras muestran veces de inducción sobre el control sin tratamiento (media ± EE). D. Los niveles de PGE
2 en células SW620 y LoVo tratados por dosis indicadas de Berberin durante 48 h se midieron por ELISA (medias ± SE). CRC migración celular y la invasión se ven afectados por: E. La sobreexpresión o derribo del gen de la COX-2; F. PGE
2. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. Los bares y barras de error representan las medias ± SE, y el
P
-valor se calculó utilizando un independiente
t-test
. **
P Hotel & lt; 0,01, el control de la migración vs tratada;
##
P
. & Lt; 0,01, el control de la invasión vs tratado
3.Berberin inhibida JAK /STAT3 señalización en las células CRC
Con el fin de delinear el mecanismo de su efecto inhibidor de la migración de las células CRC /invasión, se interrogaba la influencia de Berberin en las vías de señalización celular. Encontramos Berberin redujo significativamente los niveles de fosforilación de las proteínas JAK y STAT3 (pJAK2 y pSTAT3) en las células de CRC (Figura 3A). En comparación, el uso de un inhibidor de JAK2 (AZD1480), de manera similar que abrogó el pJAK2 y pSTAT3, lo que resulta en los niveles de migración /invasión celular humedecidas de células CRC (figura 3B y 3C).
A. Los extractos de células SW620 y LoVo tratados con Berberin a las concentraciones indicadas durante 48 h fueron analizados para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 y beta-actina (como control de carga). B. JAK AZD1480 inhibidor de JAK2 bloques de señalización /STAT3. Los extractos de las células SW620 y LoVo tratados con AZD1480 (5 mM) fueron analizados para la expresión de pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3 y beta-actina. C. AZD1480 inhibe la migración y la invasión de células de CRC. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes. Los bares y barras de error representan las medias ± SE, y el
P
-valor se calculó utilizando un independiente
t-test
. **
P Hotel & lt; 0,01, el control de la migración vs tratada;
##
P Hotel & lt; 0,01, el control de la invasión vs tratado
niveles
4.Elevated de expresión de COX-2 y pSTAT3 correlacionados con la invasión tumoral y la metástasis en humanos primaria. análisis CRC
inmunohistoquímica (IHC) de las muestras de CRC primarios ilustra que los niveles de expresión de COX-2 y pSTAT3 fueron significativamente mayores en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos normales adyacentes (figura 4A y Tabla 1). Como puede verse en las Tablas 2 y 3, hay una fuerte correlación entre la presencia de COX-2 o pSTAT3 con el grado de diferenciación, la extensión de la invasión y la metástasis, y la estadificación de Duke. COX-2 y la positividad pSTAT3 en IHC no se correlacionó con la edad del paciente, el sexo y el tamaño del tumor. La supervivencia fue significativamente mayor en los pacientes que expresan la COX-2-bajos en comparación con los de la COX-2 de alto, pero ninguna asociación entre los niveles de pSTAT3 y el tiempo de supervivencia de los pacientes (Figura 4B).
A. se muestran ejemplos de las muestras de tumor de CRC teñidas para la COX-2 y pSTAT3. B. Los niveles de expresión de COX-2 y pSTAT3 no se correlacionan con la supervivencia de los pacientes de CRC.
5.COX-2 /PGE2 regulado señalización JAK2 /STAT3 CRC en células
a continuación sobreexpresada la proteína COX-2 en células SW620 y LoVo CRC por transfección, y se han encontrado niveles de pJAK2 y pSTAT3 aumento y disminución de los niveles de expresión de MMP-2, MMP-9, que están regulados transcripcionalmente aguas abajo de la señalización /STAT3 JAK2; Por otra parte, la construcción de shRNA mediada por la COX-2 gen desmontables tuvo el efecto opuesto (Fig 5A y 5B). La adición de PGE
2 ligando a las células CRC activa significativamente la JAK2 /STAT3 señalización y la expresión de MMP-2 /-9 (Fig 5C y 5D). Sobre la base de estos datos, la hipótesis de que ha activado la COX-2 PGE2 eje mayor JAK2 vía /
/STAT3 señalización, hasta regulados los niveles de expresión de MMP-2 /-9, lo que lleva a un aumento de potencial metastásico de células CRC.
A. y B. Extractos de células SW620 y LoVo transfectadas con la COX-2 sobre-expresión o construcción de shRNA fueron analizadas para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 y la beta-actina. C. y D. Los extractos de células SW620 y LoVo tratados con PGE
2 para las duraciones indicadas fueron analizadas para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP-2, MMP-9 y la beta-actina.
6.Berberin inhibe la invasión de células CRC y la metástasis a través de la represión de la COX-2 /PGE2 /JAK2 /STAT3 señalización eje
Con nuestros datos que muestran la inhibición de la COX-Berberin 2 /PGE
2 y la expresión de JAK2 /señalización STAT3, así como la COX-2 /PGE
regulación vía JAK2 /STAT3 2, la hipótesis de que el mecanismo de efecto inhibidor de Berberin en CRC invasividad y el potencial metastásico era su influencia negativa en el eje de señalización de la COX-2 /PGE
2-JAK2 /STAT3. Para probar esta teoría de la nuestra, tratamos las células CRC utilizando JAK2 inhibidor de AZD1480, y encontramos la expresión de MMP-2 /-9 era "desacoplado" de la COX-2 y PGE
2, es decir, ni la sobreexpresión de la COX-2 ni adición de ligando PGE
2 podría aumentar los niveles de proteína de MMP-2 /-9 (Fig 6A y 6C). A la inversa, con AZD1480 bloqueo de la señalización /STAT3 JAK2, Berberin no tuvo efecto sobre MMP-2 /-9 niveles de expresión (Fig 6B y 6D).
A. y B. extractos de células SW620 tratadas con AZD1480 durante 2 h, transfectadas con COX-2 sobre-expresión construyen durante 24 h, se trató con Berberin (40 M) durante 48 h, se analizaron para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP -2, MMP-9 y la beta-actina. C. y D. extractos de células SW620 tratadas con AZD1480 durante 2 h, se trató con Berberin (40 M) o PGE
2 (5 M) durante 48 h, se analizaron para pJAK2, JAK2, pSTAT3, STAT3, MMP 2, MMP-9 y la beta-actina.
Discusión
capacidad de invasión y metástasis, características de los tumores malignos, son las principales razones por las terapias contra el cáncer contra CRC fallan. Por lo tanto, la búsqueda de nuevos fármacos antitumorales metástasis de metas parezca plausible para aumentar la tasa de supervivencia de los pacientes con CCR. Siendo utilizado cada vez más en la clínica, la medicina tradicional china (MTC) ha demostrado ser una importante opción terapéutica alternativa para CRC, además de la cirugía y la quimioterapia [22]. Con la acumulación de evidencia que demuestra que la medicina tradicional china es muy eficaz el tratamiento de cánceres, es cada vez más importante y necesario para estudiar los mecanismos que subyacen a las actividades antitumorales de la medicina tradicional china y sus componentes. Berberin, un alcaloide aislado de TCM hierba Coptis chinensis, ha demostrado tener una eficacia anti-tumor en el tratamiento de CRC, de hígado, de mama, de próstata y de pulmón [23-27]. En nuestro estudio, hemos presentado
in vitro
y
in vivo
datos que delinean Berberin inducida por la inhibición de la CRC crecimiento celular, la migración /invasión y metástasis, por otra parte, hemos explorado el mecanismo que subraya.
estudios anteriores han demostrado que la COX-2, la enzima limitante de la velocidad que cataliza la conversión del ácido araquidónico en PGE
2, la sobre-expresa en los tejidos tumorales de varios tumores malignos, incluyendo CRC. A medida que el efector aguas abajo de la COX-2, PGE
2 promueve la angiogénesis tumoral, el crecimiento celular, la migración /invasión, y la evasión inmune. Por lo tanto, PGE
2 sigue siendo un factor clave de la tumorigénesis. La evidencia epidemiológica ha sugerido que a largo plazo, la rutina de toma de inhibidor de la COX-2 tales como AINE (medicamentos antiinflamatorios no esteroides) podrían reducir el 50% de la incidencia de CCR [28-29]. Nuestros resultados revelaron que Berberin inhibió los niveles de expresión de COX-2 y PGE
2 en células de CRC, de acuerdo con los datos de Singh et al encontrado en las células de melanoma tratadas con Berberin [30]. Por lo tanto, se Berberin ser tan eficaz como los AINE para reducir la incidencia de CCR? Este será un tema muy interesante para los futuros estudios, sobre todo en el mecanismo por el cual Berberin obras en las células de CRC.
vía de señalización JAK2 /STAT3 se activa de forma persistente en pulmón, cáncer de mama y en el CCR [31-32 ]. En condiciones fisiológicas normales, la vía de señalización de JAK2 /STAT3 se activa de forma transitoria. Los factores de crecimiento y citocinas se unen a sus receptores en la superficie celular para activar JAK2, que a su vez fosforila el residuo de tirosina 705 (Tyr705) de la proteína STAT3 para activarla (pSTAT3). pSTAT3 forma homodímeros o heterodiers, se transloca en el núcleo, transactiva los niveles de expresión de la ciclina D1, VEGF y MMP-2 /-9 genes [33 a 36], cuyos productos de proteínas están implicadas en la regulación del crecimiento de células tumorales, la apoptosis, la angiogénesis y la metástasis. Ya se muestra mediante los estudios de cáncer de la nasofaringe y la enfermedad diabética que Berberin bloqueado JAK2 /STAT3 señalización [37-38], y nuestros datos actual ha añadido otra pieza de evidencia afirmando el efecto inhibidor de Berberin sobre la activación /STAT3 JAK2, así como la expresión de sus genes diana aguas abajo de MMP-2 /-9 en el CCR -. esto probablemente es parte del mecanismo biológico de efecto antitumoral de Berberin
Desde nuestros datos propusieron que Berberin impactó tanto la COX-2 /PGE
2 y señalización /STAT3 vías JAK2, que investigarse más a fondo los niveles de proteína de la COX-2 y pSTAT3 en muestras de CRC primarias, e interrogado cualquier forma de asociación y vinculación normativa entre estos 2 jugadores importantes. En consonancia con la observación de otros investigadores de una estrecha asociación entre activada la COX-2 /PGE
2 y JAK2 en vías de próstata, cáncer de pulmón y colangiocarcinoma [13-15] señalización, descubrimos, en los tejidos humanos CRC /STAT3, una cantidad más alta de la COX-2 y pSTAT3, que significativamente correlacionados entre sí, y en general tanto se asociaron con un mayor grado de invasión tumoral y la metástasis. Siguiente nuestros estudios in vitro revelaron que la COX-2 /PGE
2 regulada la migración de células proceso CRC /invasión a través de la señalización de JAK2 /STAT3, y la sobre expresión de COX-2 y PGE
2 invierte la acción inhibidora de Berberin en JAK2 /activación de STAT3 y la movilidad de células de cáncer. Por otra parte, reveló que AZD1480, un bloqueador de JAK2 inhibidor /activación de STAT3 [39-40], desacoplado de la COX-2 /PGE 2 y Berberin
afecte a los niveles de expresión de MMP-2 /-9. Estos resultados nos iluminan de la COX-2 /PGE
2-JAK2 /STAT3 cascada de señalización como diana terapéutica para Berberin para mediar su efecto sobre la capacidad de invasión y metástasis de CCR. En resumen, Berberin reduce COX-2 /PGE
2 niveles, a su vez amortigua activación JAK2 /STAT3, lo que lleva a una disminución de la expresión de los genes diana MMP-2 /-9, resultando en menos de invasión y metástasis en CRC (Fig 7 ). Este informe nos ha proporcionado un importante conjunto de datos preclínicos para el futuro uso generalizado de Berberin en el tratamiento de CRC.
PGE2, el principal producto catalizado de la COX-2 a partir del ácido araquidónico, podría obligar al PE receptor en la membrana celular, activando de este modo la JAK2, seguido por el phorphorylating de STAT3 en el sitio Tyr705. El activado p-STAT3 forma la homo-o heterodímeros, que se translocan en el núcleo, se unen al gen diana aguas abajo MMP-2, MMP-9, y acelerar la progresión del tumor. La inhibición de la vía de la COX-2 /PGE2 JAK2 señalización mediada /STAT3, podría ser uno de los mecanismos del efecto inhibitorio de Berberin en la invasión y metástasis en el cáncer colorrectal.
información de apoyo
S1 Higo. Berberin inhibe el crecimiento celular y la metástasis CRC.
El peso corporal de los ratones, el control
vs
Berberin grupo. El tratamiento con Berberin tiene poco efecto sobre el peso corporal del ratón. No hubo diferencias significativas entre los animales tratados con Berberin en dosis de 200 mg /kg por día y los animales de control. Los datos que se muestran como medias ± SD. muestras de hígado B. representativas de los ratones de control y Berberin fueron procesados y tinción por el Excmo. Los resultados mostrados son representativos de tres experimentos independientes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123478.s001 gratis (TIF)
Tabla S1. Efecto de Berberin en las funciones hepáticas y renales (media ± SD)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123478.s002 gratis (DOC)