Extracto
microbiota colónica fermentar la fibra dietética no absorbida para producir enormes cantidades de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) que benefician al huésped a través de una miríada de metabólica, trófico, y los efectos quimiopreventivos. Los efectos quimiopreventivos del butirato de SCFA son, en parte, mediada a través de la inducción de la expresión del gen p21. En este estudio, se evaluó el papel de los microARN (miARN) en la inducción de butirato de expresión de p21. Los perfiles de expresión de miRNAs en células HCT-116 y en los cánceres de colon esporádicos humanos fueron evaluados por microarrays y PCR cuantitativa. Regulación de la expresión de genes p21 por miR-106b se evaluó mediante 3 'UTR ensayos de reportero de la luciferasa y la transfección de imita específicos miARN. Butirato cambió la expresión de 44 miRNAs en células HCT-116, muchos de los cuales se expresan de manera aberrante en tejidos de cáncer de colon. Los miembros de la familia miR-106b se redujeron en el primero y el aumento en el segundo. expresión de la proteína p21 butirato inducida fue humedecido por tratamiento con un miR-106b sinóptico. p21 construcciones 3'UTR-reportero mutadas expresadas en las células HCT-116 confirmados directa miR-106b de orientación. Butirato disminución de la proliferación HCT-116, un efecto invertido con la adición de la miR-106b sinóptico. Se concluye que la AGCC microbio derivado de regular la expresión génica de acogida implicado en la homeostasis intestinal, así como la carcinogénesis a través de la modulación de miRNAs
Visto:. Hu S, Dong TS, SR Dalal, Wu F, M Bissonnette, Kwon JH, et al. (2011) La cadena corta derivado de ácido graso Microbio butirato Objetivos de expresión génica de los genes miARN p21-dependiente de cáncer de colon humano. PLoS ONE 6 (1): e16221. doi: 10.1371 /journal.pone.0016221
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 23 Agosto, 2010; Aceptado: 16 de diciembre de 2010; Publicado: 20 de enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Hu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Proyecto humano microbioma (DK083993, HG004858), R37 DK47722 (EBC), K08 DK078046 (JHK), la Digestive Disease Investigación Core Center DK-42086 de la Universidad de Chicago, y el tracto gastro-intestinal Fundación de Investigaciones Associates 'Junta (SRD). Los alumnos fueron apoyados por una concesión de beca de investigación de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America (SH), T35 DK62719 (TSD) y T32 DK07074 (SRD). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La mayoría de los cánceres de colon esporádicos humanos desarrollan gradualmente a medida que la acumulación de alteraciones en la expresión génica transformar epitelio del colon normal a adenocarcinoma. Este proceso implica una interacción entre factores genéticos y ambientales, este último apoyado por la asociación epidemiológica entre el aumento de la incidencia de los cánceres colorrectales y factores como el aumento de la longevidad, la exposición a agentes carcinógenos, y las dietas en los países altamente industrializados [1]. Entre los factores de riesgo alimentarios propuestos es bajo contenido en fibra, lo que puede reducir la biodisponibilidad de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC), que se forman por fermentación anaeróbica microbiana de fibra dietética [2]. AGCC tales como acetato, propionato, y butirato son producidos en cantidades prodigiosas y son los aniones más abundantes en el líquido luminal del colon y las heces [3]. Estos productos microbianos no sólo proporcionan una importante fuente de energía para el epitelio del colon, pero también tienen efectos tróficos extensos que incluyen la regulación de los genes del huésped implicados en mantenimiento de la homeostasis intestinal [4].
En indiferenciada, de proliferación maligna células, butirato inhibe la proliferación e induce la diferenciación a través de una variedad de mecanismos que incluyen alteraciones en la metilación del ADN, la inhibición selectiva de la fosforilación de la histona y la desacetilación de histonas (HDAC), y la modulación de la quinasa intracelular de señalización [5] - [7]. En una línea humana de células epiteliales de colon (HT29), se identificaron 221 genes de respuesta de butirato implicados en la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [6]. Entre los genes alterados por el tratamiento butirato fueron muchos involucrados en la regulación del ciclo celular, tal como la p21 de la ciclina dependiente inhibidor de quinasa, GADD45A, y PTEN [6].
En condiciones normales, la proliferación está estrechamente regulada por la acción de ciclinas, quinasas dependientes de ciclina (CDKs), y los inhibidores de CDK que regulan las transiciones de G1 a la fase S y G2 a la mitosis y actúan como puntos de control para prevenir la replicación si el ADN está dañado [8]. En respuesta a las señales que indican daño en el DNA, p21 y p27 se unen a los complejos ciclina-CDK e inducir la detención del ciclo celular [8], [9]. Sin embargo, en el cáncer, se pierde este proceso regulado de la división celular y el crecimiento. Por ejemplo, la pérdida de la función de la p21 dependiente de inhibidor de la quinasa de punto de control G1 ciclina se ha relacionado con la carcinogénesis y p21 pérdida se observa en 79% de los tumores de cáncer de colon mediante inmunohistoquímica [10], [11].
Induce
butirato p21 transcripción de genes a través de una vía independiente de p53 implica la inhibición no competitiva de HDAC [12] - [14]. Sin embargo, la posibilidad de que algunas de las acciones del butirato sobre la expresión génica de p21 podría ser mediada a través de mecanismos de traslación miARN-dependiente no ha sido explorado con anterioridad. inhibidores de HDAC han sido recientemente estudiado como un nuevo grupo de herramientas de tratamiento epigenéticos contra el cáncer, y un inhibidor de HDAC, ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA), es aprobado por la FDA para el tratamiento de linfoma cutáneo de células T [15]. Además, los inhibidores de HDAC han sido implicados en la regulación de los genes miARN en múltiples tipos de tumores malignos. El tratamiento de la línea celular de cáncer de mama SKBr3 con el inhibidor de HDAC LAQ824 ácido hidroxámico dio lugar a cambios significativos en ~ 40% de miRNAs expresados de la célula [16]. SAHA el tratamiento del carcinoma de pulmón A549 línea celular humana dio lugar a alteraciones significativas en la expresión de 64 miRNAs [17]. La influencia del inhibidor de HDAC y butirato producto microbiano sobre la expresión de los genes miARN en tejidos de cáncer de colon no se ha investigado.
miRNAs están $ ~ $ 22 nucleótidos, ARN, que juegan un papel importante en la regulación de la proliferación celular, la apoptosis no codificante, y la diferenciación [18]. Mayor que 1000 miRNAs humanos se han identificado, y la mayoría se cree que apuntar cientos de genes [19]. La desregulación de la expresión de los genes miARN puede contribuir a la carcinogénesis aumentando la expresión del protooncogén o hacia abajo-regulan los supresores de tumores [20]. Por ejemplo, miRNAs regulan muchas proteínas clave en las vías de señalización de cáncer colorrectal, por ejemplo, la familia miR-106b reduce la expresión de p21 y afecta a la progresión del ciclo celular [21] - [23]. Entre el miR-106b predijo objetivos, el silenciamiento de p21 con siRNA Fenocopias más de cerca posible aumento de miR-106b de la función [22].
En este estudio, la hipótesis de que los efectos anticancerígenos del microbio derivan AGCC butirato puede ser mediada, en parte, a través de cambios en la expresión de los genes miARN. Realizamos estudios de microarrays miARN en células humanas de cáncer de colon HCT-116 tratadas con butirato y encontramos alteraciones significativas en los perfiles de miARN, incluyendo la disminución de expresión de la familia miR-106b. el análisis de microarrays miARN de los cánceres de colon humano de tipo esporádico encontró incremento en la expresión de la familia miR-106b. Butirato se encontró para inducir la expresión de p21, que se asoció con una disminución significativa en la proliferación celular. La adición de un miR-106b imitador revirtió el aumento de la expresión de p21 y la disminución de la proliferación celular inducida por el butirato. Estos hallazgos han descubierto un mecanismo único de interacción microbiana con la expresión de genes de acogida que implica alteraciones de los perfiles de miARN para frenar el ciclo celular e inhibir la proliferación de células de cáncer de colon.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
biopsias de colon humanos quirúrgicas fueron obtenidos de pacientes con cáncer de colon en la Universidad de Chicago Medical Center bajo un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional. el consentimiento informado por escrito antes de la recogida de muestras de tejido. Todas las investigaciones clínicas que usan los sujetos humanos se llevaron a cabo de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki.
Cell Cultura y
Humanos células HCT-116 de cáncer de colon se adquirieron de ATCC. Las células se cultivaron a 37 ° C en alto nivel de glucosa medio DMEM (Invitrogen) que contiene 10% (vol /vol) de suero bovino fetal, 50 mg /ml L-glutamato, 50 mg /ml de estreptomicina y 50 U /ml de penicilina. Las células fueron tratadas con butirato de 1-2 mM durante 24 a 48 horas antes de la cosecha para cada ensayo individual. Las células se lavaron dos veces y se rasparon en enfriado con hielo salina tamponada con fosfato (PBS), se sedimentaron (14.000 g x 20 seg), entonces se lisaron para el ARN y la proteína de extracción.
biopsias de colon humanos
Surgical biopsias de colon humanas de tejido tumoral y normal circundante que aparece mucosa del colon (al menos 5 cm de distancia de la frontera del tumor) se obtuvieron por un cirujano colorrectal. Después de la separación, las biopsias se colocaron inmediatamente en hielo y se enjuagaron en PBS enfriado en hielo antes de la lisis celular para la extracción de RNA.
miARN microarray
ARN total fue extraído de células HCT-116 y del colon humana muestras de tejido utilizando el kit de aislamiento de mirVana ™ miARN (Ambion) de acuerdo con el protocolo del fabricante. células HCT-116 miARN se analizó mediante el microarray v.11.0 miRCURY LNA ™ (Exiqon) que contiene sondas de captura dirigidas a todos los miRNAs para humanos, ratón, rata o registrada en la versión miRBase 13 en el Instituto Sanger. Todas las muestras se combinaron para crear una referencia común. Uno g de RNA total de cada muestra y la referencia común agrupado se marcaron utilizando el kit de marcaje de alimentación de la matriz miRCURY ™ LNA (Exiqon, Dinamarca). El HY3 ™ marcado con las muestras y un hy5 ™ marcada con referencia muestra de ARN se mezclaron por pares y se hibridó con los arrays de LNA miRCURY ™. Los microarrays diapositivas fueron escaneados utilizando el Sistema Agilent G2565BA escáner de microarrays (Agilent Technologies, Inc., EE.UU.) y el análisis de imágenes se realizó utilizando el software ImaGene 8,0 (BioDiscovery, Inc., EE.UU.). Las señales cuantificadas se corrigieron fondo (Normexp con valor de desplazamiento de 10) y se normalizaron utilizando el Lowess mundial (localmente ponderada Smoothing Diagrama de dispersión) algoritmo de regresión [24]. Los datos se expresan como el log2 transformada normalizada relación HY3 /hY5.
En una manera similar, miRNAs de tejido de colon humano se analizaron usando mirVana miRNA Bioarrays v.2 (Ambion), que utiliza la versión 8.0 de la secuencia miRBase base de datos. Las muestras se marcaron con el kit de marcaje de mirVana miARN y se hibridaron a las Bioarrays miARN por las instrucciones del fabricante. Las matrices fueron escaneados utilizando el GenePix4000B en el Genómica Funcional de la Universidad de Chicago. Un total de 12 perfiles de miARN se generaron a partir de 6 muestras de tejido del colon pareadas.
-PCR en tiempo real para los miRNAs
El ARN total fue extraído de células HCT-116 sedimentadas por Trizol (Invitrogen, Grand Island , NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN complementario se sintetizó a partir de muestras de ARN total extraído de HCT-116 células o tejidos de colon humano utilizando el Kit nCode ™ miARN First-Strand cDNA Synthesis (Invitrogen). PCR en tiempo real se realizó con un iCycler (Bio-Rad) utilizando el supermix iQSYBR Green PCR (Bio-Rad) con cebadores específicos de genes miARN y un cebador qPCR universal de acuerdo con el protocolo del fabricante para el Kit de nCode (Tabla S1). Se utilizó el protocolo de cuantificación de ciclo de dos etapas (45 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y luego 60 ° C durante 15 segundos). El valor Ct se define como el ciclo en el cual la fluorescencia cruza un umbral fijo por encima de la línea de base. Un pequeño ARN nucleolar, RNU48, se midió como control endógeno [25]. Para obtener una cuantificación relativa, cambios veces se midieron usando el método ΔΔCt. Para cada muestra, se midió el valor de Ct de cada miARN y se compara con RNU48 como Ct, (Ct = Ct
miRNA - Ct
RNU48). El pliegue del cambio de miARN en muestras experimentales con respecto a las muestras de control se determinó por 2
-ΔΔCT, donde ΔΔCt = Ct
Desconocido -ΔCt
de control [26]
.
Propiedades -Tiempo PCR para p21 mRNA
ARN total fue extraído de sedimentadas HCT-116 células con Trizol. El ADN complementario se sintetizó utilizando superíndices III (Invitrogen) y un cebador hexonucleotide azar. Los cebadores sentido y antisentido para p21 (CDKN1A, NM_000389.3) son: 5'-TCACTGTCTTGTACCCTTGTGCTT-3 'y 5'-AGAAATCTGTCATGCTGGTCTGCC-3'; para GAPDH: 5'-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3 'y 5'-AGATGGTGATGGGCTTCCC-3'. PCR en tiempo real se realizó con un iCycler usando supermix iQSYBR Green PCR (Bio-Rad). Para cada muestra, se midió el valor Ct de mRNA p21 y en comparación con el control endógeno GAPDH como Ct, (Ct = Ct
p21 - Ct
GAPDH). El pliegue del cambio de miARN en muestras experimentales con respecto a las muestras de control se determinó por 2
-ΔΔCT.
Western Blot
Se homogeneizaron sedimentaron las células HCT-116 en Tris 10 mM, pH 7,4 , mM MgCl 5
2, completo cóctel inhibidor de proteasa (Roche Molecular Biochemicals), 50 U /ml de ADNasa (Amersham), y 50 U /ml de ARNasa (Ambion). La proteína se cuantificó usando el método del ácido bicinconínico. La proteína se solubolized en solución de parada 3X Laemmli por calentamiento a 65 ° C durante 10 minutos.
Veinte muestras de proteínas de microgramos se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en Tris 25 mM, pH 8,8 ; glicina 192 mM; 15% de metanol vol /vol. Las membranas se bloquearon con 5% peso /volumen de leche seca no grasa en tampón Tween-tris salino (TTBS). Los anticuerpos primarios, específicos para p21 (BD Bioscience), Hsc70 (SPA815; Stressgen) y β-actina (Señalización Celular), se añadieron y se incubaron durante la noche a 4 ° C. Las membranas se lavaron con TTBS, se incubaron con anticuerpos secundarios de especies apropiadas de rábano picante conjugada con peroxidasa (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante 1 hora a temperatura ambiente, y se desarrollaron usando un sistema de quimioluminiscencia mejorada (Supersignal; Pierce, Rockford, IL).
La cuantificación de las imágenes se realizó mediante el escaneo de densitometría utilizando el software NIH Image J 1.54 (Institutos nacionales de Salud, Bethesda, Maryland).
se midió Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular usando el reactivo de WST-1 (Roche Applied Science) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células HCT-116 se cultivaron en una placa de fondo plano de 96 pocillos. Después de alcanzar 50% de confluencia, los pocillos se trataron con la concentración indicada de butirato durante 24 hrs. Las placas se leyeron en un lector de microplacas a 450 nm antes y 45 minutos después de añadir el reactivo WST-1. La longitud de onda de referencia fue 650 nm. las tasas de proliferación celular se calcularon de acuerdo con el protocolo del fabricante.
transfección de células con genes miARN
transit-LT1 (Mirus, WI) el reactivo de transfección se utilizó para transfectar células HCT-116 con un miR ingeniería 106b (Ambion Pre-mir MiRNA precursores moléculas) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un control miARN (MIR-C), con un contenido de GC idéntica pero sin homología de secuencia con el miR-106b, se utilizó como control. Las células fueron transfectadas durante 48 horas antes de la cosecha.
Ensayos de luciferasa
Modificado pGL3 construye con el 3'UTR p21 aguas abajo de la secuencia codificante de la luciferasa de luciérnaga fueron un generoso regalo del Dr. V. Narry Kim, del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Seúl [27]. Seis horas después del tratamiento con butirato, las células HCT-116 fueron transfectadas transitoriamente con constructos pGL3 modificados y plásmidos pRL-TK (Renilla luciferasa dirigido por el promotor de timidina quinasa, E2241, Promega) usando el reactivo de transfección TransIT LT-1. Se recogieron las células por agitación en 500 l de tampón de lisis (Promega). Firefly y
Renilla
actividades de luciferasa en el lisado se determinaron por triplicado con un sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). la actividad de la luciferasa de luciérnaga se normalizó a
Renilla
actividad luciferasa.
Análisis estadístico
Los resultados se presentan como media ± SEM para el número indicado de experimentos. Los resultados de múltiples experimentos se analizaron mediante la prueba t de Student o ANOVA utilizando la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.
Para los arrays miARN, un T-test de dos colas calculada entre los grupos de la muestra y de referencia identificados miRNAs con p -valores inferiores a 0,05. Estos miRNAs fueron escogidos entonces para estudios posteriores con RT-PCR.
Resultados
El butirato altera la expresión de los genes miARN en células humanas de cáncer de colon HCT-116, incluidos los miembros de la familia miR-106b
Para estudiar los efectos de butirato en la expresión de los genes miARN en células de cáncer de colon, los perfiles de expresión de miRNAs en células HCT-116 butirato tratadas se midieron usando un microarray. células HCT-116 tratadas con vehículo se analizaron como un control. Cuarenta y cuatro miRNAs demostraron cambios significativos en la expresión en respuesta al tratamiento butirato. Los cambios en la expresión de 13 de los 26 miRNAs que disminuyeron y 5 de los 18 miRNAs que aumentaron fueron confirmados utilizando en tiempo real, PCR cuantitativa (Figura S1). Treinta y uno de los 44 miRNAs con cambios en la expresión se muestran en el mapa de calor en el panel izquierdo de la figura 1A. Varios miembros de la miR-17-92a, miR-18b-106a, y cúmulos de miR-25-106b se redujeron significativamente en respuesta a butirato.
A) perfiles de microarrays miARN se realizaron en el ARN extraído de HCT- 116 células tratadas con vehículo o butirato de 1 mM y los tejidos de colon humano de pacientes con cáncer de colon esporádico y el tejido de aspecto normal adyacente. Los datos se normalizaron usando el algoritmo global de regresión Lowess y se expresa como logaritmo en base 2 ratios transformadas de la señal de la muestra a la señal de reserva de referencia control. mapas de calor están representados. El color rojo en el mapa de calor representa el aumento de expresión en comparación con el control de referencia agrupada, y verde representa disminución de la expresión en comparación con el control agrupado. Los cambios en la expresión de la 17-de miR - 106b familia fueron confirmadas por PCR en tiempo real en B) las células HCT-116 y C) los tejidos de colon humano. Los resultados son medias ± SE, n = 4. * indica p & lt;. 0,05 para la muestra en comparación con el control
También se evaluaron los niveles de expresión de estos miRNAs en los cánceres de colon esporádicos humanos y de los alrededores de colon normales que aparecen por microarrays y se muestran en el panel derecho de la Figura 1A. Los miRNAs disminuyeron en las células HCT-116 butirato tratados fueron aumentado dramáticamente en los tejidos tumorales en comparación con los controles normales. miRs-17, -20, -20b, -93, -106a y -106b eran todos disminuyeron en respuesta al tratamiento butirato. Estos miRNAs comparten la misma secuencia de la región de semillas y por lo tanto se dirigen a los mismos sitios de unión en la 3'UTRs de ARNm diana. El uso de PCR en tiempo real, se confirmó que el butirato reducido regulado estos miRNAs en células HCT-116 (Figura 1B). También confirmó que estos miRNAs fueron altamente expresado-over en muestras de cáncer de colon humano (Figura 1C), lo que sugiere que algunos de los efectos anticancerígenos de butirato están mediados por la supresión de los miRNAs que están regulados al alza en el cáncer de colon.
MIR -106b inhibe la expresión de la proteína p21 butirato inducida
estudios previos mostraron que la 3 'UTR de p21, que regula la proliferación de células de cáncer, contiene dos sitios de unión para el miR-17 - 106b secuencia de semillas (Figura 2A) y es inhibida por estos miRNAs en varios tipos de cáncer [revisado en 13 a 15, 22]. Nosotros, por lo tanto, analizamos los efectos de butirato y un miR-106b imitan el ARNm y los niveles de proteína p21 en las células HCT-116. Como se muestra en la Figura 2B y 2C, butirato de aumento de la expresión de proteína p21 cuatro veces después de 24 horas de tratamiento. Un imitador miR-106b exógeno humedecido expresión de la proteína p21 butirato inducida en comparación con las células tratadas con butirato de controlar solo mientras que las moléculas miARN no tuvo ningún efecto sobre la expresión de p21
.
A) Representación esquemática de las regiones comunes de semillas en el miR-17 - familia 106b que se dirigen a la 3'UTR p21 en dos sitios. células HCT-116 se trataron con butirato de (2 mM) o vehículo y se transfectaron con miR-106b imitan o control de miARN (miR-C) durante 24 horas antes de la cosecha. B) se muestran transferencias de Western para p21, β-actina y Hsc70, y son representativos de 4 experimentos individuales, todas con resultados similares. C) Densitometría resultados de transferencias Western de p21 normalizado a ß-actina. D) la abundancia de ARNm de p21 se analizó por PCR en tiempo real. Los resultados son medias ± SE, n = 4. * indica p & lt; 0,05 en comparación con el basal.#Indica p & lt; 0,05 comparado con el control
Para determinar el efecto del butirato y miRNAs en la expresión génica de p21, los niveles de ARNm de p21 celular fueron medidos por PCR en tiempo real (Figura 2D).. Butirato indujo un aumento de 3,6 veces en abundancy mRNA p21. Por el contrario, el imitador de miR-106b no tuvo ningún efecto sobre la expresión del ARNm de p21.
El 3'UTR de p21 media la regulación de la traducción por butirato y miR-106b
Para investigar el efecto de miR 106b en la regulación de traducción de la expresión de p21, HCT-116 células fueron transfectadas transitoriamente con vectores indicadores de luciferasa modificados que contienen 3'UTRs ya sea la naturaleza 3'UTR tipo p21 o p21 que contienen las mutaciones en uno o ambos de la miR-106b sitios de unión (Figura 3A). la expresión de luciferasa de la luciérnaga se utilizó para evaluar la regulación cis a través de la p21 3 'UTR. El vector pRL-TK que expresa luciferasa de Renilla estaba co-transfectadas para controlar la eficiencia de transfección. En condiciones basales, las mutaciones en los miR-106b regiones objetivo individuales en el 3'UTR de p21 en los nucleótidos 468-474 y los nucleótidos 1148 a 1154 resultaron en un aumento del 28% y el 26% en la actividad de la luciferasa, respectivamente (Figura 3B). Además, las mutaciones en las dos regiones diana miR-106b resultaron en un aumento del 57% en la actividad luciferasa, lo que sugiere que ambos sitios de unión median la inhibición de la expresión de los genes miARN p21 basal en las células cancerosas.
A) Representación esquemática de las construcciones de reportero de luciferasa que contiene el p21 mRNA 3'UTR, que incluye dos sitios de unión para la familia miR-17-106b. Las mutaciones se generaron en estos sitios diana de miR-106b. Las células HCT-116 fueron transitoriamente co-transfectadas con los vectores de luciferasa de luciérnaga pGL3 que contiene el tipo salvaje o mutado 3'UTR p21 y PRL-TK Renilla luciferasa de control de vectores. Las células fueron también tratados con butirato (2 mM) o vehículo y moléculas miARN miR-106b imitar o controlar (MIR-C). Las células se recogieron para la medición de la luminiscencia de 48 horas después de la transfección. B) la expresión de luciferasa basal del reportero construye con el tipo salvaje o mutado 3'UTR p21. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con p21 3'UTR C) La expresión de luciferasa en las células después de butirato y tratamiento miRNA. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con el control. Los resultados son medias ± SE, n = 4.
El butirato estimula la actividad de luciferasa 85% sobre el control de las células HCT-116 transfectadas con la luciferasa que contiene p21 3 'UTR del vector (Figura 3C). efectos del butirato sobre la expresión de luciferasa fueron contrarrestados por la adición de imita el miR-106b exógenas, pero no controlan moléculas de miRNA (MIR-C). Además, la actividad de luciferasa de las células HCT-116 transfectadas con el vector quimérico que contiene dos sitios diana mutantes miR-106b no se alteró con butirato de tratamiento o con butirato en presencia de exógena miR-106b.
efecto del butirato sobre la proliferación celular es inhibida por el miR-106b
Desde p21 inhibe la progresión del ciclo celular, se analizó el papel de miR-106b en los efectos antiproliferativos de butirato. HCT-116 células fueron tratadas con varias diluciones de butirato durante 24 horas y se realizó un ensayo de proliferación WST-1. Como se muestra en la Figura 4A, dependiente de la dosis butirato inhibe la proliferación celular. Las concentraciones de butirato antiproliferativos estaban en el rango fisiológico de 0,5 a 20 mM [28], [29]. Las células transfectadas con exógeno miR-106b o control durante 24 horas antes de la exposición butirato de 2 mM fueron también analizados (Figura 4B). La inhibición butirato inducida de la proliferación celular se invirtió mediante la adición de moléculas de imitar miR-106b de una manera dependiente de la dosis (Figura 4B). En contraste, el control de moléculas miARN miR-(C) no mostraron ningún efecto sobre la inhibición de butirato inducida por la proliferación celular.
HCT-116 tasa de proliferación celular se midió con el kit de proliferación WST-1. A) las células HCT-116 se trataron con la concentración indicada de butirato o vehículo durante 24 horas antes de la medición WST-1. * Indica p & lt; 0,05, en comparación con B basal) células HCT-116 se transfectaron con el miR-106b imitar o controlar miRNA (miR-C) con las concentraciones indicadas inmediatamente antes del tratamiento con butirato de 2 mM. Las células tratadas solamente con butirato se analizaron como control. * Indica p & lt; 0,05 en comparación con butirato solo. Los resultados son medias ± SE, n = 5.
Discusión
En este estudio, identificamos, por primera vez, una función reguladora importante para el crecimiento miRNAs epiteliales del colon en la mediación de la efectos del butirato de cadena corta de ácidos grasos derivados de microbios sobre la expresión génica de acogida. Curiosamente, en las células HCT-116, butirato suprimió muchos de los mismos miRNAs aumento en los cánceres de colon humanos. Uno de estos miRNAs, MIR-106b, se encontró que apuntar p21. Butirato y el tratamiento de miR-106b de un p21 3'UTR constructo informador de luciferasa en células HCT116 indica que la expresión de p21 butirato estimulada se inhibe en traslación en parte por el miR-106b. Esta inhibición parcial por miR-106b confirma informes anteriores que el butirato también regula la expresión de p21 a través de un mecanismo independiente de los genes miARN, a través de su inhibición de la HDAC [7], [13], [14]. Proponemos que el butirato producto microbiano regula el ciclo celular a través de tanto la regulación epigenética y de la traducción a través de su doble papel como un inhibidor de HDAC y el inhibidor de la expresión de miR-106b (Figura 5).
El butirato inhibe deactylases histonas (HDAC) , lo que permite el aumento de la acetilación de histonas, disminución superior plegable orden de la cromatina, y aumento de la transcripción de p21. El butirato también disminuye la expresión de miR-106b, y varios otros miRNAs con la misma región de secuencia de semilla. La familia de miR-106b p21 inhibe la traducción, y por lo tanto disminución de la expresión de la familia miR-106b conduce a un aumento de traducción p21.
Estos resultados tienen implicaciones importantes para la homeostasis intestinal y la carcinogénesis. Estos datos sugieren que estos miRNAs juegan un papel en la carcinogénesis de colon y que su reducción por butirato es un mecanismo importante de sus efectos contra el cáncer. Seis de estos miRNAs son de la misma familia miARN (miR-17, miR-20a, miR-20b, miR-93, miR-106a, y miR-106b), comparten una secuencia de una semilla idéntica, y por lo tanto se dirigen a los mismos sitios de unión en los 3'UTRs de ARNm diana. Por lo tanto, la supresión de sus genes diana durante el proceso carcinogénico podría representar una respuesta de células patrón para promover la proliferación y /o mantenimiento del estado indiferenciado de células
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Debido a que muchos miRNAs también se encuentran en las regiones intrónicas de codificación de los genes, la respuesta miRNA es probable que coordina con genes transciptionally activados que contribuyen al proceso general de la carcinogénesis. Como un ejemplo pertinente a nuestros hallazgos, la polycistron miR-106b-25 está situado dentro del intrón 13 del gen en el cromosoma 7q22.1 MCM7 [23]. MCM7 (minichromosome proteína de mantenimiento 7) regula la replicación del ADN durante la fase S. En las células quiescentes, los niveles de ARNm de MCM7 humanos son casi indetectable, pero su expresión se induce como las células entrar en el ciclo celular. El promotor MCM7 tiene tres sitios E2F, tres cajas GC y una caja de E [30]. En el carcinoma hepatocelular (HCC), la expresión del precursor de miR-106b se correlaciona fuertemente con la expresión MCM7, lo que indica que la polycistron miR-106b-25 se transcribe de forma coordinada bajo la influencia del promotor MCM7. Los altos niveles de expresión de la E2F1 factor de transcripción en HCC también se correlacionó con el aumento de expresión de miR-106b [31]. En células de cáncer gástrico, E2F1 también parece regular miR-106b-25 expresión en paralelo con aumentos en la expresión MCM7 [32]. En fibroblastos de ratón transformadas con los oncogenes Ras EIA y, butirato disminuye transcripciones E2F1 y proteínas, así como promotor de activación [33]. Por lo tanto, butirato podría ejercer su efecto sobre la expresión de miR-106b a través de una disminución de expresión de E2F1, aunque se necesitan más estudios en células HCT-116 para examinar esta posibilidad.
Como se dijo anteriormente, la desregulación de la expresión de los genes miARN puede influir en la carcinogénesis cuando los genes miARN objetivos son los supresores de tumores u oncogenes. Mientras que el tratamiento con miR-106b conduce a la disminución de expresión de la proteína p21, los niveles de mRNA p21 no cambian, lo que es consistente con informes previos que miR-106b regula p21 a través de inhibición de la traducción en lugar de la estabilidad de ARNm [32]. Aunque la regulación miR-106b de la expresión de p21 se ha descrito en muchos tipos de células, no hay datos conflictivos sobre el mecanismo de esta interacción. En las células epiteliales mamarias humanas y fibroblastos pulmonares normales, miR-106b disminuyó el mRNA p21 en aproximadamente un 40% [22]. Por el contrario, en el CHC, la expresión de p21 no mostró correlación con la expresión de la agrupación miR106b-25, y no parece ser un objetivo de estos miRNAs en este tipo de células [31]. En una línea de carcinoma gástrico humano derivado de las células, el miR-106b reprime la expresión de la proteína p21, pero no causó un cambio significativo en los niveles de mRNA p21 [32].
En resumen, hemos descubierto un nuevo mecanismo de acción para efectos contra el cáncer de butirato que implican la modulación de los perfiles de miARN y la expresión génica dependiente de traducción. Como un ejemplo, butirato induce la expresión de p21, una molécula reguladora clave de la detención del ciclo celular, mediante la supresión de los miembros de la familia miR-106b. inhibición butirato de miR-106b también se asocia con una disminución significativa en las tasas de proliferación de células de cáncer. Este último se invierte mediante la adición de imita miR-106b. Estos hallazgos han descubierto un ejemplo único de la regulación de la expresión génica microbiana de acogida que retarda el ciclo celular e inhibe la proliferación de células de cáncer de colon.
Apoyo a la Información
Figura S1.
butirato altera significativamente la expresión de cuarenta y cuatro miRNAs en células HCT-116. células HCT-116 se trataron con butirato de 1 mM durante 24 horas. ARN total aislado se somete a miARN gama de hibridación. Cuarenta y cuatro miRNAs demostraron cambios significativos en la expresión en respuesta al tratamiento butirato. Microarray datos se normalizó utilizando el algoritmo global de regresión Lowess y se expresa como logaritmo en base 2 ratios transformadas de la señal de la muestra a la señal de reserva de referencia control. Los cambios en la expresión de los genes miARN se confirmó por el uso en tiempo real, PCR cuantitativa para 13 de los 26 miRNAs que disminuyeron y 5 de los 18 s miARN que aumentaron
doi:. 10.1371 /journal.pone.0016221.s001 gratis ( TIF)
Tabla S1.