Extracto
Antecedentes
honokiol, un producto natural de peso molecular pequeño, tiene previamente se ha informado para activar la apoptosis e inhibir la tumorigénesis gástrico. Ya sea honokiol inhibe la angiogénesis y la metástasis de las células de cáncer gástrico sigue siendo desconocido.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos probado los efectos de honokiol sobre la actividad angiogénica y diseminación peritoneal utilizando
in vivo, ex
vivo y
in vitro
sistemas de ensayo. Las respuestas de señalización en células de cáncer gástrico humano, se detectaron y se analizaron las células humanas umbilicales vasculares endoteliales (HUVEC), y los tumores aislados. En un modelo de ratón tumor gástrico xenoinjerto, honokiol inhibió significativamente la difusión peritoneal detectado por la técnica de PET /CT. Honokiol también atenúa eficazmente la angiogénesis detectado por el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo, ensayo de tapón de Matrigel ratón, ensayo de la brotación de células en anillo de aorta de rata endotelial, y el ensayo de formación de tubos de células endoteliales. transductor de señales Además, honokiol mejorar de manera efectiva y activador de la transcripción desfosforilación (STAT-3) e inhibido STAT-3 actividad de unión a ADN en células de cáncer gástrico humano y HUVECs, que se correlaciona con la regulación de la expresión de actividad y proteína de homología Src 2 (SH2) tirosina -Con fosfatasa-1 (SHP-1). inhibidor de la calpaína-II y la transfección de siRNA invierten significativamente la actividad SHP-1 honokiol inducida. La disminución de STAT-3 fosforilación y aumento de la expresión de SHP-1 también se muestran en los tumores metastásicos peritoneales aislados. Honokiol también era capaz de inhibir la generación de VEGF, lo que podría ser revertido por SHP-1 siRNA transfección.
Conclusiones /Importancia
honokiol aumenta la expresión y actividad de SPH-1 más que desactiva vía STAT3. Estos resultados también sugieren que honokiol es un novedoso y potente inhibidor de la angiogénesis y la diseminación peritoneal de células de cáncer gástrico, proporcionando apoyo a la potencial aplicación de honokiol en la terapia del cáncer gástrico
Visto:. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) La calpaína /SHP-1 interacción por honokiol Dampening peritoneal Difusión de cáncer gástrico en
nu /nu
ratones. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10.1371 /journal.pone.0043711
Editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Alemania |
Recibido: 17 Enero, 2012; Aceptado: July 24, 2012; Publicado: 24 Agosto 2012
Copyright: © Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación del hospital general de Veteranos Taichung, Taiwán (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) y el Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La mayoría de los pacientes (~ 60%) con cáncer gástrico son diagnosticados con la enfermedad en etapa tardía. El cáncer gástrico es la segunda causa más común de mortalidad global por cáncer en los países desarrollados y exhibe la enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico [1]. La cirugía y la quimioterapia de combinación para el cáncer gástrico se ha demostrado que confieren sólo modestos beneficios de supervivencia en casos avanzados, y casi el 50% de los pacientes siguen muriendo después de la recurrencia [2], [3]. Una forma importante de recurrencia es diseminación peritoneal. El crecimiento del cáncer y la metástasis peritoneal son dependientes de la angiogénesis, un proceso que implica varios factores angiogénicos que incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico, la prostaglandina E2, la interleucina-8, quimiocinas (CXC motivo) ligando 1, y la familia de metaloproteinasas de matriz [4] - [6]. Varias señales moleculares, tales como transductor de señal y activador de la transcripción-3 (STAT-3), factor nuclear-EB, Akt, proteínas quinasas activadas por mitógenos, la ciclooxigenasa-2, lipoxigenasa, inducible sintasa-óxido nítrico, factor de necrosis tumoral y otros , también se han demostrado estar involucrados en la progresión tumoral y la angiogénesis [7] - [9]. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares del desarrollo, progresión y metástasis de cáncer gástrico aún no se han aclarado.
La quinasa activada por Janus (Jak) /STAT vía de señalización desempeña un papel importante en la regulación de el crecimiento celular, la angiogénesis, la diferenciación, la migración y metástasis [10]. La activación constitutiva de las vías de STAT, particularmente STAT-3, se asocia con una amplia variedad de tumores malignos humanos. Persistente fosforilación STAT-3 se ha observado en diversos cánceres humanos, tales como tumores sólidos del estómago, colon, hígado, próstata, mama, pulmón y cabeza y cuello, así como enfermedades malignas de la sangre [8], [10]. estudio previo ha demostrado que la fosforilación de STAT-3 y expresión de la proteína VEGF se incrementan en el tejido de cáncer gástrico humano, que a su vez eleva el fenotipo angiogénico y contribuir al desarrollo de cáncer gástrico y la progresión [11]. Por otra parte, ciertas fosfatasas son conocidos por ser los supresores de tumores y pueden desempeñar un papel importante en la inhibición o control del crecimiento del cáncer [12] - [15]. fosfatasas proteína tirosina (PTP), incluyendo SH2 que contiene el dominio tirosina fosfatasa (SHP) -1 y SHP-2, son capaces de regular negativamente la señalización de STAT por la desfosforilación de tirosina de varios componentes en las vías de señalización relacionadas [13] - [15] . La activación continua de STAT-3 en los tumores podría ser facilitado al menos en parte por la pérdida de la función de estas fosfatasas. La calpaína II se ha demostrado que desempeñan un papel en el retículo endoplasmático (ER) de tensión-regulada la tumorigénesis, que está implicado en el mecanismo de la tumorigénesis gástrico honokiol inhibida [16]. Además, el estudio anterior también ha indicado que SHP-1 es un sustrato endógeno para la calpaína después de la activación plaquetaria inducida por A23187 [17]. Por lo tanto, un calpaína /SHP-1-regulada STAT-3 y la vía VEGF puede estar implicado en la angiogénesis, el crecimiento y la diseminación peritoneal de células de cáncer gástrico.
Honokiol, un producto natural de peso molecular pequeño, es un importante compuesto biphenolic activa de
Magnolia officinalis
, que es conocido para mejorar la infección microbiana, la inflamación y trastornos gastrointestinales en los sistemas medicinales tradicionales de Asia [18]. Nuestro estudio anterior demostró que inhibe la tumorigénesis honokiol gástrico mediante la activación de la 15-lipoxigenasa-1 y la consecuente inhibición de señales de peroxisoma proliferador activado del receptor-A y la COX-2-dependientes [19]. Honokiol se ha demostrado que induce estrés ER y desencadenar mediada por calpaína-II regulada por glucosa proteína-94 de escisión y la apoptosis en células de cáncer gástrico humano [16]. Se ha demostrado que la expresión de VEGF podría ser sensible a las condiciones de privación de nutrientes, que causan estrés ER [20], [21]. Por otra parte, el ER tunicamicina activador de estrés se ha encontrado para evitar notablemente el desarrollo de la microvasculatura, lo que sugiere que este ER inductor de estrés puede tener un papel potencial en el tratamiento de tumores de mama [21]. Los efectos de honokiol sobre la angiogénesis ER estrés correlacionados y la metástasis del tumor gástrico aún no están claros. En este caso, la hipótesis de que honokiol inhibe la angiogénesis y la diseminación peritoneal de células de cáncer gástrico a través de una vía de calpaína /SHP-1-regulada STAT-3 y VEGF. Los resultados mostraron que la angiogénesis honokiol marcadamente inhibida y difusión peritoneal de células de cáncer gástrico a través de una calpaína /SHP-1 interacción activado por STAT-3 desfosforilación y VEGF vía de baja regulación.
Resultados
Honokiol bloqueado peritoneal la metástasis del cáncer gástrico
in vivo
el cáncer se caracteriza con frecuencia por el aumento de la captación de [
18F] fluoro-2-desoxi-D-glucosa (FDG), y [
18F] FDG /PET puede servir como una medida sustituta de la eficacia terapéutica. Se evaluó la posibilidad funcional de formación de imágenes de pequeños animales utilizando un escáner clínico /CT PET con FDG. Se investigaron cuatro grupos de ratones para experimentos metástasis peritoneales. Una declaración /imagen de la situación metástasis se muestra en la Figura 1. Se utilizó [
18 F] FDG-PET /CT para detectar metástasis peritoneales en ratones inoculados con células humanas de cáncer gástrico (MKN45 o SCM-1) con o sin honokiol tratamiento. Como se muestra en la Figura 2, la proyección de intensidad máxima se genera a partir de ratones típicos representativos. La metástasis peritoneal fue marcado en los ratones de control (panel izquierdo), y se inviertan de forma efectiva por el tratamiento honokiol (panel derecho). Estas imágenes muestran claramente que no invasiva [
18 F] FDG en las captaciones de los tumores metastásicos peritoneales de ratones de control fueron mucho más altos que los de los ratones tratados con honokiol. La cuantificación de la intensidad se muestra en la Figura 3A. La inyección intraperitoneal de honokiol (5 mg /kg, dos veces /semana) redujo significativamente los recuentos de radiactividad estimados y los valores de absorción específicos (SUV) determinado por FDG-PET /CT en ratones inoculados con células de cáncer gástrico (Fig. 3). Por otra parte, muchos nódulos metastásicos fueron encontradas en la cavidad peritoneal (mesenterio) de los ratones de control inoculados con MKN45 y SCM-1 (Fig. 2) las células. En contraste, no se observaron nódulos tumorales peritoneales esporádicamente en los ratones tratados con honokiol. La cuantificación de los nódulos por campo se muestra en la Figura 3B
.
(A) se investigaron y se enumeran cuatro grupos de ratones. (B) Las condiciones metastásicos en la inoculación de las células cancerosas mediante la vigilancia de PET /CT y más para un tratamiento honokiol. Las células de cáncer gástrico humano (4~5 × 10
6 células) MKN45 (a) y SCM-1 (b) se inocularon a ratones en el día 7.
[
18F ] FDG-PET sirvió como una medida sustituta de la eficacia terapéutica. Se establecieron tumores en ratones desnudos durante 7 días después de la inoculación intraperitoneal de células de cáncer gástrico (MKN45, A; SCM-1, B). Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con honokiol (5 mg /kg /dos veces por semana). Veintiocho días después del tratamiento honokiol, se tomaron imágenes FDG-PET /CT de los ratones, y después los ratones fueron sacrificados para el examen macroscópico de la distribución de metástasis diseminada. se muestran imágenes representativas de FDG-PET /TAC de los animales inoculados con MKN45 (A-a) o SCM-1 (B-a) células de cáncer gástrico con o sin tratamiento honokiol (HK). HK (5 mg /kg) se administró por inyección intraperitoneal. La proyección de intensidad máxima de los ratones nude representante típico (a la izquierda, el control del tumor; la derecha, el tratamiento HK) se muestra. Por otra parte, muchos nódulos metastásicos fueron encontrados en el mesenterio de los ratones de control inoculados con MKN45 (A-B) o células SMC-1 (B-b). En contraste, se observó esporádicamente metástasis peritoneal en ratones tratados con honokiol.
Los ratones fueron inoculados con células de cáncer gástrico humano (MKN45 y SCM-1). [
18 F] de imagen /TC-FDG PET se realizó y analizó. (A) cuantificaciones de radiactividad estimado (Bq /ml, a) y los valores de absorción específicos (SUV, b) se calcularon. SUV se utiliza como un índice para determinar si un punto de acceso es significativo. se muestra (B) fotomacrografías de nódulos metastásicos peritoneales. Todos los datos se presentan como media ± SEM (n = 6-8). * P & lt; 0,05 en comparación con el control
honokiol inhiben la angiogénesis
in vivo
,
ex vivo, y
in vitro
las células endoteliales son críticos para el proceso angiogénico, que es necesaria para el crecimiento tumoral y la metástasis. A continuación se investigó el efecto angiogénico de honokiol usando el ensayo de membrana corioalantoidea de pollo (
CAM
ensayo), ensayo de tapón de Matrigel, ensayo de brotación anillo aórtico, y la formación de tubos de células endoteliales. Como se muestra en la Figura 4A, honokiol inhibe eficazmente la formación neo-vascular en el
CAM
ensayo sin ningún efecto visible sobre los vasos sanguíneos pre-existentes. El análisis cuantitativo reveló que honokiol causó una disminución de 2,5 veces en el número de vasos sanguíneos recién formados en comparación con la de control del medio
.
(A) ensayo de membrana corioalantoidea (
CAM
ensayo) era realizado. formación neovascular atrapado en geles de colágeno tipo I con o sin honokiol (HK, 20 mM) se examinó el tratamiento. Después de 24 h de incubación, se fotografió el área alrededor del disco cargado. (B) Matrigel (0,6 ml) se implantó por vía subcutánea en ratones desnudos con o sin honokiol (10 g /ml) o VEGF (100 ng /ml). El matrigel inyectado forma rápidamente un único tapón de gel sólido. Después de 21 días, los ratones se sacrificaron y se extirparon los tapones de Matrigel. se muestran los tapones de Matrigel representativos (A) y para la tinción IHC de CD31 de las secciones de tapones de Matrigel (B). Se calcularon las cuantificaciones de número de buques (c) y células endoteliales (d) en secciones de enchufe matrigel (cuentas /campo). Los números en cada caso son el promedio de cinco diapositivas diferentes regiones y cinco por diapositiva. Todos los datos se presentan como media ± SEM (n = 8-10). * P & lt; 0,05 en comparación con el control
En el ensayo de tapón de matrigel, matrigel que contiene VEGF (/ml de gel 100 ng) con o sin honokiol (10 g /ml) se implantó por vía subcutánea en ratones desnudos. . Después de 21 días de la implantación, los tapones de Matrigel formados fueron extirpados y se fotografiaron. Tapones con VEGF solo fueron marcadamente rayado, vascular y de color rojo. Plugs que contienen VEGF y honokiol eran pálido, indicando que no hay o menos formación de vasos sanguíneos (Fig. 4B-a). También se examinaron la densidad de los vasos y la morfología buque en las secciones de enchufe de H & amp; tinción E y tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo contra CD31, un marcador de células endoteliales. La vascularización en el grupo honokiol + VEGF se redujo significativamente en comparación con el grupo que sólo VEGF (Fig. 4B-b). La cuantificación de la vascularización contando los vasos y las células endoteliales presentados reveló que la densidad vascular en el grupo honokiol tratados se redujo significativamente (Figs. 4B-c y 4B-d).
A continuación, se indujeron las células endoteliales a brotar a partir de los aislados anillos aórticos de rata en presencia de matrigel y ECGM (medio de crecimiento de células endoteliales) que contiene citoquinas angiogénicas, tales como VEGF y el factor de crecimiento de fibroblastos básico. se observó Amplia excrecencia de las células endoteliales a partir de explantes de anillos de aorta de rata en el grupo de control (Fig. 5A). tratamiento Honokiol resultó en una reducción significativa (~five veces) de derivación endotelial y la brotación de anillos de aorta (Figs. 5A y 5C). Además, la diferenciación morfológica de la formación de tubos de células endoteliales se investigó usando un método matrigel de dos dimensiones. Como se muestra en la Figura 5B, la siembra de HUVECs en matrigel condujo a la formación de estructura similar a un tubo vascular. Honokiol inhibe eficazmente la formación de tubos de células endoteliales mediante la reducción de la estructura en forma de tubo en longitud y anchura (Figs. 5B y 5D).
(A) Honokiol células endoteliales inhibe la germinación en un ensayo de anillo aórtico. Aortas se recogieron de 6 semanas de edad, las ratas Sprague-Dawley y se cortan en rodajas de 1 mm, que a continuación se colocaron en placas de 12 pocillos que contenían matrigel. Los anillos fueron fotografiados y analizados. La célula endotelial brotación era abundante en los anillos aórticos de control (paneles de la izquierda), pero no en los anillos tratados con honokiol (HK; paneles medios, 40 mM; paneles de la derecha, 60 m). (B) Honokiol suprimió la formación de tubos de células endoteliales. HUVECs se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertos con matrigel. Las células se trataron con honokiol (40 y 60 mM) durante 12-18 h. Las imágenes formación de tubos se capturaron en un fotomicroscopio invertido, y se anotaron las formaciones de tubos. (C) El grado de microvasos que brota de anillos de aorta se puntuó de 0 (menos positivo) a 4 (más positiva). se muestra (D) Cuantificación de la formación de tubo HUVEC. Todos los datos se presentan como media ± SEM (n = 8-10). * P & lt; 0,05 en comparación con el control
honokiol suprimidas STAT-3 de señalización en células de cáncer gástrico humano, HUVEC, y tumores
Los estudios anteriores han demostrado una fuerte correlación entre STAT activado. -3 y angiogénico fenotipo [11]. Nos explicará adicionalmente el efecto de honokiol en la fosforilación de STAT-3 en células de cáncer gástrico humano (MKN45 y AGS) y HUVEC. Como se muestra en la Figura 6, honokiol redujo la tirosina (Tyr705) la fosforilación de STAT-3 de una manera dependiente del tiempo con alrededor de una disminución de dos veces en 1 a 2 h en células AGS (Fig. 6A) y un 3 a 10- fold disminución en 0,5-24 h en MKN45 células (Fig. 6B). Sorprendentemente, honokiol inducida STAT-3 desfosforilación de Tyr705, pero no Ser727, los residuos en estas células de cáncer gástrico humano. Sin embargo, honokiol inhibe simultáneamente tanto Tyr705 y la fosforilación de Ser727 de STAT-3 en HUVECs (Fig. 6C). El análisis cuantitativo de las bandas de proteína en la transferencia de Western usando Image-Pro Plus software se muestra en la Figura 7. Los resultados del análisis con microscopio confocal también mostró que honokiol abolió la tirosina (Tyr705) la fosforilación de STAT-3 en células de AGS y HUVECs (Fig . 8A).
AGS (a) y MKN45 (B) células de cáncer gástrico humano en reposo y HUVEC (C) fueron tratados con y sin honokiol (HK, 5-40 mM) durante los tiempos indicados. Lisados de células enteras se prepararon y analizaron mediante transferencia Western para la detección de fosforilados STAT-3 (PSTAT-3, Tyr705). Los blottings se volvieron a sondar con anti-STAT-3 anticuerpos para la normalización. Los resultados son representativos de al menos cinco experimentos independientes.
AGS (A) y MKN45 (B) células de cáncer gástrico humano en reposo y HUVEC (C) se trataron con y sin honokiol (HK, 5- 40 mM) durante los tiempos indicados. Lisados de células enteras se prepararon y analizaron mediante transferencia Western para la detección de fosforilados STAT-3 (PSTAT-3, Tyr705). Los blottings se volvieron a sondar con anti-STAT-3 anticuerpos para la normalización. Todos los datos se presentan como media ± SEM de cinco experimentos independientes. * P & lt; 0,05 en comparación con el control
(A) El p-STAT-3 (Tyr705) expresiones en células de cáncer gástrico (AGS) y HUVEC tratadas con honokiol (HK, 10 y 20 mM. ) durante 1 h se detectaron mediante un microscopio confocal. Se establecieron (B) Los tumores en ratones desnudos durante 7 días después de la inoculación intraperitoneal de células MKN45. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con honokiol (5 mg /kg /dos veces por semana) durante 28 días. se muestra la p-STAT-3 (Tyr705) expresiones en tumores metastásicos aislados de ratones con o sin tratamiento HK. Las expresiones proteína p-STAT-3 (Tyr705), teñido de color marrón oscuro, se detectaron mediante inmunohistoquímica. Todos los datos se presentan como media ± SEM de cinco experimentos independientes. * P & lt; 0,05 en comparación con el control
Además, examinó la fosforilación de STAT-3 en tumores metastásicos peritoneales aislados de ratones desnudos inoculados con células MKN45 con o sin tratamiento honokiol (5 mg /kg).. El análisis inmunohistoquímico demostró que p-STAT-3 sobreexpresión y la acumulación en la región del tumor, incluyendo los núcleos y citoplasma, se invirtió significativamente por el tratamiento honokiol (Fig. 8B). En análisis de transferencia de Western, honokiol disminuyó notablemente la acumulación de p-STAT3 en los tumores en comparación con el control del vehículo (Fig. 9A). La expresión de STAT3 constitutiva no se vio afectada. Además, la actividad de unión a ADN de STAT-3 se confirmó adicionalmente mediante EMSA. Como se muestra en la Figura 9B, honokiol marcadamente inhibida el aumento de la actividad de unión a ADN de STAT-3 en células de cáncer gástrico humano. Honokiol también inhibió el aumento de VEGF-STAT-3 actividad de unión de ADN en HUVECs (Fig. 9B).
(A) Western Blot para la detección de p-STAT-3 (Tyr705) proteínas en tumores metastásicos aislados de ratones con o sin honokiol se muestra (HK) de tratamiento. (B) EMSA se realizó para la detección de STAT-3 actividad en AGS, SCM-1 (panel izquierdo), y HUVECs (panel derecho) de unión a ADN con o sin tratamiento honokiol. Las células se trataron con honokiol para diversos cursos de tiempo como se indica. VEGF (20 ng /ml) aumentó la actividad de unión a ADN STAT-3 en HUVECs, y esta mejora se invirtió por honokiol (10 M). Todos los datos se presentan como media ± SEM de cinco experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 en comparación con el control
regulados-SHP-1 inducida por honokiol STAT-3 desfosforilación en células de cáncer gástrico, células endoteliales, y tumores
SHP-1 es una no transmembrana PTP [12]. A continuación examinó si honokiol puede regular la expresión y actividad de SHP-1. Como se muestra en la Figura 10A, honokiol aumentó la expresión de la proteína de SHP-1, pero no SHP-2, en las células HUVEC y AGS de una manera dependiente del tiempo. Farmacológico inhibidor de PTP y SHP-1 siRNA transfección abolieron eficazmente el honokiol inducida por STAT-3 desfosforilación en células HUVEC y AGS (Fig. 10B-A). Resultados similares en las células SCM-1 y las células endoteliales SV-40 inmortalizada microvasculares de ratón (SVECs) tratados con honokiol se muestran en la Figura 10B-b. A continuación examinó si endógena SHP-1 es modulada por honokiol. Honokiol era capaz de evocar la actividad SHP-1 en células de cáncer gástrico, HUVEC y SVECs de una manera dependiente del tiempo (Fig. 11A). Honokiol también aumentó la expresión de la proteína SHP-1 en los tumores metastásicos peritoneales aislados de ratones inoculados con MKN45 según lo revelado por análisis inmunohistoquímico (Fig. 11B). Además, investigó la interacción entre SHP-1 y STAT-3 usando los métodos de co-inmunoprecipitación y transferencia Western. Como se muestra en la Figura 11C, SHP-1 se asoció específicamente con STAT-3 en células de AGS y HUVECs en presencia de honokiol en comparación con el control de IgG.
Las células se trataron con honokiol (10 y 20 mM) para diversos cursos de tiempo como se indica. niveles SHP-1 y la proteína SHP-2 (A) fueron detectados por Western blot en células con o sin tratamiento honokiol. (B) La fosforilación de STAT-3 en células de cáncer gástrico (AGS y SCM-1) las células endoteliales (HUVEC y SVECs) con o sin honokiol y (10 M en HUVECs, SVECs, y SCM-1; 20 M en AGS) se detectó el tratamiento durante 24 h en presencia o ausencia de un inhibidor de fosfatasa (PTP inhibidor II, 20 mM) o SHP-1 siRNA transfección. En A, los datos se presentan como media ± SEM de cinco experimentos independientes. * P & lt; 0,05 en comparación con el control. En B, los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
Las células fueron tratadas con honokiol (HK) para diversos cursos de tiempo como se indica. Las células (A) se trataron con honokiol (HUVECs, 20 mM; SVECs, 20 mM; AGS, 20 mM; SCM-1, 40 mM) en los tiempos indicados, y luego se midieron las actividades de SHP-1. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 7). * P & lt; 0,05 en comparación con el control. se muestra (B) Inmunohistoquímica para SHP-1 expresión en tumores metastásicos aislados de ratones con o sin tratamiento HK. Las secciones se tiñeron con-SHP-1 anticuerpo anti. se detectó (C) Interacción de STAT-3 y SHP-1 en las células AGS o HUVECs. Las proteínas inmunoprecipitadas se recogieron y se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia con anti-STAT-3 o anticuerpos anti-SHP-1. En A y B, los datos se presentan como media ± SEM (n = 5). * P & lt; 0,05 en comparación con el control. En C, los resultados mostrados son representativos de al menos cuatro experimentos independientes.
honokiol alterada ER Morfología, inducido con regulación-calpaína-II inducida por SHP-1 STAT-3 y desfosforilación, y la disminución de VEGF Generación
Los estudios previos han sugerido que el estrés ER desempeña un papel importante en la angiogénesis [20], [21]. A continuación examinó el efecto de la microestructura en honokiol ER mediante microscopía electrónica de transmisión. Como se muestra en la Figura 12A, ER dilatación y la fragmentación fueron exhibidas en 1 SCM células honokiol tratados con cáncer gástrico y HUVEC
Las células (A) fueron tratados con honokiol (HUVEC, 10 micras;. SMC-1, 40 M) durante 18 h. Las células se recogieron y se visualizaron por microscopía electrónica como se describe en "Materiales y Métodos". Las flechas indican la dilatación de ER. Aumento original: 9800x. (B) Las células fueron tratadas con o sin honokiol (HUVECs, 20 mM; AGS, 20 mM) en presencia o ausencia de la proteína recombinante de la calpaína II (re-calpaína) o la calpaína II de la transfección de ARNsi, y luego las células se analizaron para SHP actividad -1. (C) Las células fueron transfectadas con el tipo salvaje STAT-3 (en peso) y plásmidos (mut) mutantes STAT-3 o SHP-1 siRNA, y luego se determinó la generación de VEGF. (D) La interacción de la calpaína y SHP-1 se detectó en las células AGS. Las proteínas inmunoprecipitadas se recogieron y se sometieron a SDS-PAGE e inmunotransferencia con anti-calpaína-II o anticuerpos anti-SHP-1. En A y D, los resultados mostrados son representativos de al menos 4 experimentos independientes. En B y C, los datos se presentan como media ± SEM (n≥4). * P & lt; 0,05 en comparación con el control.#P & lt;. 0,05, en comparación con solo honokiol
También querían determinar si se requiere la activación de la calpaína-II para la actividad SHP-1 en las células tratadas con honokiol. Farmacológico inhibidor de la calpaína y transfección calpaína II-siRNA reducen eficazmente la actividad de SHP-1-honokiol mejorada en células AGS y HUVEC (Fig. 12B). Las células tratadas con recombinante calpaína-II, como control positivo, mostraron un aumento de 4-5 veces en la actividad SHP-1 (Fig. 12B). VEGF se sabe que contiene el sitio de unión promotor STAT-3. A continuación examinó si honokiol puede regular la expresión de VEGF. Honokiol redujo significativamente la generación de VEGF en las células AGS y HUVECs, y este efecto se invirtió por SHP-1 siRNA transfección (Fig. 12C). Además, la transfección de mutante-STAT-3 plásmido en células también inhibió la generación de VEGF. La combinación de honokiol con el mutante-STAT-3 transfección del plásmido en las células reduce sinérgicamente la producción de VEGF en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo (Fig. 12C). Para confirmar aún más la interacción entre la calpaína-II y SHP-1, co-inmunoprecipitación y transferencia de Western se realizaron en células de cáncer gástrico. Como se muestra en la Figura 12D, la calpaína-II se asoció específicamente con SHP-1 en las células AGS en presencia de honokiol (20 mM) en comparación con el control de IgG. Del mismo modo, la calpaína honokiol inducida /interacción SHP-1 también se encontró en HUVEC (datos no mostrados).
Discusión
honokiol es un componente principal de
Magnolia officinalis
, que es un medicamento de transición en Asia [18]. Honokiol posee efectos antioxidantes y anti-inflamatorias
in vitro
y
in vivo
[22] - [25]. Honokiol se ha demostrado que presentan actividad anti-proliferativa potente contra las células endoteliales
in vitro
y anti-tumorales efectos en contra angiosarcoma en ratones desnudos [26]. En este estudio, hemos demostrado por primera vez que honokiol es un potente inhibidor de la angiogénesis y la metástasis peritoneal de cáncer gástrico. Nuestra investigación se ha centrado en los efectos y posibles mecanismos de honokiol sobre la metástasis peritoneal y la angiogénesis utilizando PET /CT,
CAM
ensayo, ensayo de tapón de Matrigel, ensayo de la brotación de células en anillo aórtico endotelial, ensayo de formación de tubo celular endotelial, y
in vitro
experimentos celulares. Los resultados mostraron que honokiol puede suprimir la angiogénesis y la diseminación peritoneal a través de un SHP-1 de activación de la cascada de señalización activada por calpaína-II. La activación de la fosfatasa SHP-1 por honokiol vez dio lugar a la baja regulación de la producción de STAT-3 de activación y VEGF, lo que resulta en la inhibición de la angiogénesis y la metástasis peritoneal. Sin embargo, la inhibición de la angiogénesis y la inhibición de potencial metastásico de las células cancerosas por honokiol pueden ser los aspectos separados, uno de ellos un efecto de honokiol sobre la angiogénesis directamente y otro efecto de honokiol en las células cancerosas.
Durante los últimos años, un número de estudios han indicado que la activación constitutiva de la familia STAT, especialmente STAT-3, se asocia con la proliferación celular, la angiogénesis y la metástasis [10], [11], [27] - [30]. El aumento de la activación de STAT-3 de expresión se ha encontrado en diversas células derivadas de tumores y muestras de tejidos de cáncer humano. Desregulado la activación de STAT-3 se ha sugerido que desempeñar un papel importante en la sobreexpresión de VEGF y el aumento de fenotipos angiogénicos en el cáncer gástrico, que pueden contribuir al desarrollo del cáncer gástrico y la progresión [11]. En el presente estudio, se encontró que honokiol puede inhibir eficazmente la fosforilación de STAT-3 en HUVEC (ambos sitios Tyr705 y Serine727), células de cáncer gástrico humano (Tyr705 sitio) y los tumores metastásicos peritoneales (Tyr705 sitio). Como la activación oncogénica de tirosina quinasas es una característica común en los cánceres, nos hemos centrado en el papel de la fosforilación de Tyr705 STAT-3.
SHP-1 posee una función potencial supresor de tumores y es un regulador negativo de la vía JAK /STAT vía de señalización [15]. También se ha demostrado que SHP-1 fosfatasa se puede unir a la fosforilada Y1173 de dominio, lo que conduce a EGFR desfosforilación [31]. Y429 en el dominio citoplásmico del receptor de la eritropoyetina se ha sugerido que el sitio de unión para la proteína tirosina fosfatasa SH-PTP1, que puede jugar un papel importante en la terminación de las señales de proliferación [32]. SHP-1 también se ha demostrado que es un antagonista de factor de crecimiento de señalización en las células epiteliales y hematopoyéticas [15]. SHP-1 fue especialmente destacado como un potencial antagonista fisiológico de VEGFR señalización [33]. En las células endoteliales, SHP-1 se asocia físicamente con VEGFR2 y también se requiere tanto para TNFa mediada y el tejido inhibidor de las metaloproteinasas (TIMP) la inhibición de la angiogénesis mediada por [31]. Por lo tanto, SHP-1 de activación puede tener consecuencias importantes para la regulación de la proliferación y la angiogénesis. En este estudio, se encontró que honokiol mejora específicamente la expresión de SHP-1, pero no SHP-2, en las células de cáncer gástrico, células endoteliales, y tumores metastásicos peritoneales. Estos hallazgos sugieren que honokiol puede inhibir la angiogénesis de células endoteliales y la metástasis de células de cáncer, que puede ser a través de una vía inducida por SHP-1 STAT-3 baja regulación.
Estudios anteriores han propuesto un papel importante para el estrés ER en el mecanismo molecular de la angiogénesis y el crecimiento de células de cáncer [16], [20], [21]. Koyama y colegas también han sugerido que la interrupción de calcio inducida por el estrés ER puede estar implicado en la inducción de la acumulación de amiloide β y la expresión del factor angiogénico en el epitelio pigmentario de la retina [34]. Un estudio reciente ha demostrado que la señalización de IRE-1α regulados por el estrés ER posee una función esencial en el desarrollo de la placenta y la viabilidad embrionaria, destacando la relación de estrés ER, y la angiogénesis en la placenta durante el embarazo [35]. Kim y sus colegas han demostrado que tanto la SHP-1 y SHP-2 son sustratos endógenos para la calpaína, que está implicado en el contexto de
Entamoeba histolytica
inducida por la muerte de la célula huésped [36]. En particular, las calpaínas se activan cuando el calcio intracelular ([Ca
2 +] i) la concentración es elevada;