Extracto
Si los componentes del estroma facilitan el crecimiento, invasión y diseminación de las células cancerosas o suprimen las lesiones neoplásicas de la progresión maligna es un enigma para continuar en la biología del tumor. La conceptualización de una imagen dinámica de la tumorigénesis es complicada por la heterogeneidad interindividual. En la era post genómica, desentrañar esta complejidad sigue siendo un reto para el biólogo de cáncer. Hacia el establecimiento de una asociación funcional entre la diafonía celular y la agresividad del cáncer diferenciado, hemos identificado una firma de respuesta epitelial maligno de mama a la señalización del estroma. La proximidad a los fibroblastos dio como resultado alteraciones de genes de transcripción de & gt; 2 veces para 107 sondas, designados colectivamente como fibroblastos de expresión de genes desencadenan en Tumor (TextoNO). La razón de riesgo predicho por el clasificador TextoNO de recaída a distancia en pacientes con tumores de mama intermedio y alto grado fue significativa en comparación con las variables clínicas rutinarias (conjunto de datos 1, n = 258, HR - 2,11, IC del 95%: 1,17 a 3,80, p-valor de 0,01 ; conjunto de datos 2, n = 171, HR - 3,07; IC del 95%: 1,21 a 7,83, p-valor de 0,01). Biofunciones representados por TextoNO incluyen la señalización inflamatoria, eliminación de radicales libres, la muerte celular, y la proliferación celular. A diferencia de los genes de la "proliferación grupo ', que se sobreexpresa en tumores primarios agresivos, los genes TextoNO fueron reprimidas de forma única en tales casos. Como prueba de concepto para nuestros hallazgos correlativos, que vinculan la diafonía estromal-epitelial y el comportamiento del tumor, se muestra un diferencial de distintivo en el impacto del estroma en los puntos finales funcionales pronóstico de definición de la progresión del ciclo celular, y la resistencia a la detención del crecimiento inducida por el tratamiento y la apoptosis en baja frente a las células de cáncer de alto grado. Así, nuestros datos experimentales revelan aspectos de la "cooperatividad paracrina 'que son exclusivamente depende de la calificación definida histopatológicamente de interactuar epitelio tumoral, y demuestran que la capacidad de respuesta del epitelio al microambiente tumoral es un factor determinante que subyace en el resultado clínico. En este sentido, a principios de atenuación de la diafonía epitelial-estromal podría mejorar la gestión de los casos con tendencia a presentar un desafío clínico
Visto:. Luciani MG, Seok J, Sayeed A, S Champion, Goodson WH, Jeffrey SS, et Alabama. (2011) La capacidad de respuesta del estroma distintivo de señalización Acompaña Programación Grado histológico de las células cancerosas. PLoS ONE 6 (5): e20016. doi: 10.1371 /journal.pone.0020016
Editor: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de Cáncer, Brasil |
Recibido: 9 Febrero 2011; Aceptado: 8 Abril 2011; Publicado: 19 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Luciani et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud, bajo R01CA109325 subvención. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la opinión generalizada es que el microambiente local del tejido del huésped es un participante activo en todo el desarrollo y progresión del cáncer [1]. En este entorno, los intercambios interactivos entre las células del estroma del tumor y pueden influir en la supervivencia, el crecimiento y la difusión [2]. quimiocinas estromales autocrinos, paracrinos y señales de TGF son bien conocidos mediadores pro-tumorigénicos [3] - [8]. En los tumores de mama, los fibroblastos representan generalmente el tipo de célula más abundante en el estroma, a menudo referido como el "estroma reactivo ', altamente enriquecido en tipo I y VI de colágeno, laminina, entactina, proteoglicanos heparán-sulfato y fibrina [9]. fibroblastos tumorales derivadas de diferentes órganos muestran considerable variabilidad en los perfiles de transcripción [10], y se producen variaciones significativas en la expresión génica dentro de los tumores del estroma del mismo sistema de órganos, a menudo en asociación con parámetros clínico. Por ejemplo, la sobreexpresión de CD10, y el receptor PDGFß en el estroma del cáncer de mama es característico de alto grado histológico [11], [12]. firmas de fibroblastos-asociado y su correlación clínica con los resultados en pacientes con cáncer [13], [14], sugieren que un estroma tumoral alterado es el resultado de 'diafonía de cooperación "con células de carcinoma.
Un esfuerzo integral para revelar los fundamentos de la diafonía estromal-epitelial dentro de los tumores sólidos podrían ayudar en la identificación de un espectro más amplio de los determinantes moleculares de la evolución del paciente dirigibles. Es concebible que los fenotipos agresivas de las células tumorales a menudo representan una respuesta localizada a las señales microambientales [15]. Sin embargo, a pesar de transitorios
in vitro
inducción, la diafonía estromal-epitelial ha efectos funcionales sobre la tumorigenicidad y el potencial metastásico de las células inoculadas en animales de experimentación [16] de larga duración. En la búsqueda de efectos fenotípicos específicos,
in vitro
interacciones entre los fibroblastos y las células epiteliales de mama previamente intentos se limitaron a las líneas celulares de cáncer de mama de manera uniforme derivadas de tumores de alto grado agresivos y efusiones metastásicos [17] inmortalizada espontáneamente - [19 ], o de tejido no maligno de mama humano [20]. Interpretación de estos datos está gravado por la falta de un amplio espectro, basado en la enfermedad de modelos sustitutos de cáncer humano. Así conclusiones inequívocas con respecto a una asociación entre la heterogeneidad clínica y la señalización del estroma-epitelio subyacente biología funcional siendo difícil de alcanzar. Un requisito previo fundamental para el análisis de la interacción entre varios subconjuntos celulares en el tejido tumoral es la disponibilidad de componentes interactivos en vivo fraccionados a partir de tejido de descarte quirúrgico fresco en cantidad suficiente para la recogida de datos robusta y la generación de hipótesis. Del mismo modo, para alcanzar puntos de vista de la traducción a través de la simulación experimental, es críticamente importante incorporar un repertorio celular, lo que refleja la amplitud de la variabilidad clínica aportado por elementos epiteliales y estromales dentro del tejido tumoral. Al facilitar la diafonía directa entre nuevas líneas celulares de tumor primario de amplia clinicopathology van [21] y múltiples muestras independientes de fibroblastos derivadas de tejido no malignas o tumorales, nuestro estudio ha estado dirigida hacia una mejor comprensión de la biología del cáncer y su aplicación en las siguientes maneras. En primer lugar, se identifica un conjunto de genes, cuya expresión se altera constantemente a través de interacciones paracrinas. A continuación, el papel de una respuesta de las células tumorales inducida stromally tales en la promoción de gravedad de la enfermedad se ilustra a través de su correlación con el resultado clínico. Finalmente, una base funcional directa para variar el resultado clínico asociado con la capacidad de respuesta del tumor a la señalización del estroma se demuestra por los cambios en la cinética del ciclo celular, la evasión de la apoptosis, la reducción de ROS, y la neutralización de los efectos inhibidores del crecimiento de la terapia del cáncer hormonal. Nuestra demostración de la variabilidad asociada de grado en la reprogramación dinámica de epitelio canceroso por el microambiente del estroma mejora el alcance de patobiología cáncer clásica, y sugiere nuevos objetivos para los tumores refractarios a los tratamientos actuales. Por otra parte, la detección de patrones de respuesta paracrino en las primeras etapas podría revelar la propensión a la progresión de lesiones premalignas, y la enfermedad pre-invasiva de lesiones avanzadas
Resultados
Identificación de TextoNO -. Un perfil de expresión génica que representa maligna respuesta de las células del estroma de señalización
un perfil de expresión diferencial entre las líneas de mama primario de células tumorales solos (T ninguno) y aquellos que se propaga en la presencia de fibroblastos de tumor de mama (T + TF) se define por una lista de genes significativa compuesta de 482 conjuntos de sonda con un ajustado valor de p & lt; 0,05, donde 7 líneas celulares de tumores primarios independientes se designan como T y fibroblastos derivados del tumor primario como TF. Perfiles de expresión para 3/7 líneas celulares se adquirieron con 2 muestras de fibroblastos independientes. Un mapa de calor, lo que refleja en gran medida la represión transcripcional de co-cultivo de fibroblastos-tumoral (Figura 1A) incluye 107 conjuntos de sonda, con & gt; 2 veces el cambio en la expresión génica (Tabla S1). Este grupo de genes, que muestra significativo factor de cambio negativo en las células tumorales, y se designa como de fibroblastos de expresión de genes desencadenan en Tumor (TextoNO), se investigó adicionalmente. upregulated sonda fija dentro de la lista de genes importantes no cumplían con los criterios de selección para el cambio veces, y no se consideraron para su posterior estudio. enriquecidos categorías de funciones biológicas asociadas a los genes TextoNO se determinaron mediante Ingenuity Pathway Analysis, y principalmente involucrado respuesta inflamatoria, la proliferación celular, la muerte celular, y la eliminación de radicales libres (Figura 1B y Figura S1).
A. La agrupación jerárquica de líneas celulares de cáncer de mama primario como monocultivo de control, y en cocultivo con fibroblastos derivados del tumor. Nota agrupaciones independientes que retratan distintivos patrones de expresión stromally inducidos en las células tumorales reflejados por 482 conjuntos de sonda significativos. B. categorías enriquecida de bio-funciones representadas por 107 conjuntos de sonda, con & gt; 2 veces el cambio en la expresión génica, designado como TextoNO. Las barras se agrupan y color de acuerdo a las categorías de bio-función. Cada barra representa una prueba de valor de p enriquecimiento de un bio-función. C. Análisis de 482 conjuntos de sonda significativos como promedio durante varios cultivos de células epiteliales derivadas del maligno (rojo) y el tejido no maligno de mama (verde) en presencia (eje y) o ausencia (eje x) de co-cultivo estromal. La línea punteada representa negro x = y. Las células tumorales muestran una mayor desviación de esta línea, es decir, entre el control y el co-cultivo, mientras que los patrones de expresión de células epiteliales no malignas cocultivadas muestra una desviación mínima de control. D. Gráfico de dispersión de los niveles de transcripción relativos de 11 genes TextoNO medidos por QPCR en un conjunto independiente de 6 líneas de células de tumor de mama primarios cocultivaron con una de las 4 muestras de fibroblastos (TF) derivados del tumor. Los datos representan
ACTB
normalizada de expresión del gen en las células tumorales prueba cocultivadas relación con el control. . Rango de notas de expresión para cada gen de ensayo
enfoques adicionales para evaluar la diversidad de influencia del estroma, incluye: (1) análisis comparativo de la lista de genes importantes derivado del tumor (482 conjuntos de sonda) con datos de la matriz de co-cultivos estromales epiteliales aisladas de 8 muestras de tejido de mama no malignas independientes. los patrones de expresión de genes eran distintiva entre las células malignas cocultivadas vs malignos epiteliales de mama (Figura 1C). Mientras que las células epiteliales no malignas cocultured con correspondientes fibroblastos no malignos muestran relativa uniformidad en la respuesta, se observó amplia heterogeneidad en cocultivos de estroma-epitelial derivados del tumor (2) análisis de QPCR de 11 genes TextoNO en un conjunto independiente de 6 líneas de células epiteliales derivadas de tumores primarios cocultivadas con 4 fibroblastos derivados del tumor no probados previamente. De manera similar a la matriz de datos mencionados anteriormente, un análisis cuantitativo gen-por-gen confirmó la inducción de cambios en la expresión de genes de ensayo con respecto a la limpieza de genes,
ACTB
, dentro de las células tumorales cocultivadas (de 4 coincidentes, y 2 cocultivos inigualables) (Figura 1D).
TextoNO variación y la asociación con el resultado clínico de cáncer de mama primario
Para determinar la relevancia clínica de los cambios fenotípicos inducidos directamente por la interferencia del estroma, el poder clasificación de TextoNO (107 conjuntos de sonda) se ensayó en combinación con datos de la matriz de 2 conjuntos de datos de cáncer de mama independientes. Distante supervivencia libre de metástasis (CPOS) se utilizó como criterio de valoración de la evolución del paciente. En el conjunto de datos GSE6532 [22], los tumores con peor pronóstico muestran significativamente mayor represión de genes TextoNO en comparación con aquellos con buen pronóstico (n = 401; p = 0,031, Figura 2A - panel izquierdo). La energía de la estratificación de TextoNO abarcaba los tumores de todos los grados. Por otra parte, el clasificador mejorado aún más la subclasificación del subconjunto compuesto solamente de tumores intermedio y de alto grado (n = 258; p = 0,011, Figura 2A - panel derecho). En otras palabras, TextoNO identificó fiable a los pacientes que hicieron mal en situaciones en las que el pronóstico basado histopatología tradicional estaba limitado en términos de proporcionar una predicción precisa. Reproducibilidad de la actuación clasificador TextoNO se demostró además en un conjunto de datos independiente [23] - GSE11121 en todos los grados (n = 200; p = 0,013, Figura 2B - panel de la izquierda), así como en un análisis separado de cáncer de mama intermedio y de alto grado (n = 171; p = 0,013, Figura 2B - panel derecho). Cabe destacar que en todos los análisis, TextoNO era mejor predictor independiente del resultado de los casos intermedios y de alto grado en comparación con los parámetros pronósticos convencionales, como por ejemplo, el grado del tumor, el estado del RE, la positividad de los ganglios linfáticos, y el tamaño del tumor (Tabla 1).
A.
Conjunto de datos 1 (GSE6532) -
TextoNO clasificador predice bien contra el mal resultado para el extremo distante de la supervivencia libre de metástasis (CPOS) (n = 401,
panel izquierdo
). TextoNO estratificación basada de los pacientes diagnosticados con tumores de grado 2 (intermedio) y 3 (alto) (n = 258,
panel de la derecha
). B.
Conjunto de datos 2 (GSE11121) CD - TextoNO predicción de CPOS en un conjunto de datos independientes (n = 200,
panel izquierdo
). Confirmación de la estratificación basada TextoNO de pacientes diagnosticados de grado 2 y 3 tumores (n = 171,
panel de la derecha
).
Nuestros combinados de genes co-cultivo de datos de expresión y análisis TextoNO del tumor primario conjuntos de datos demostraron que este perfil stromally inducida se manifestó como un continuo. En un extremo estaban los patrones relativamente sin cambios de la expresión de genes característicos de co-cultivos no malignas, desplazando a la represión mínimo de genes TextoNO dentro de los tumores primarios asociados con buena evolución clínica, mientras que en el otro extremo estaban altamente reprimida perfiles de expresión dentro de los tumores que confieren un peor pronóstico del paciente.
la inducción de un amplio espectro de cambios funcionales en las células malignas del estroma de fibroblastos diafonía
en un esfuerzo por revelar el significado biológico de los fenotipos inducidos stromally como determinante del resultado clínico, que emplea novela tumor primario de mama líneas celulares de diferente grado histológico [21] en una variedad de pruebas funcionales. Reflejando el análisis biofunción enriquecida de genes TextoNO, ensayos robustos fueron priorizados, donde se podrían emplear criterios de valoración cuantificables y que podrían llevarse a cabo fácilmente en vista de las limitaciones en la disponibilidad de las culturas del estroma de la vida finita. En concreto, los cambios en los criterios de valoración funcional de los principales programas celulares, tales como la cinética de proliferación hyperactivated; neutralización estrés oxidativo; y la evasión de apoptosis la muerte celular se investigó en células tumorales cocultured con fibroblastos derivados de tejido mamario humano malignos o no:.
(1) distribución del ciclo celular de las células cancerosas reprogramadas
Ten cáncer de mama primario independiente líneas de células bajo condiciones de control y TF-cocultivo fueron marcadas con BrdU, y se analizaron por FACS. cambios del ciclo celular inducida por cocultivo se resumen en la Tabla 2. Las gráficas de puntos de las líneas celulares representativas se ilustran en la Figura 3A. Los datos demostraron perfiles del ciclo celular de grado dependiente de distintivos. En respuesta a la señalización de células del estroma, grado 1 (CCdl22, CCdl68) y grado 2 (CCdl1570) líneas celulares derivadas de tumores muestran ya sea (a) ningún cambio significativo en la distribución del ciclo celular en comparación con los controles no cocultivadas, o (b) la inducción de ciclo celular detención en el directorio /M-fase G2, que indica la activación de un puesto de control de reparación post-replicativa /ADN. En contraste, las células tumorales de grado 3 (CCdl54, CCdl257, CCdl675), incluyendo un carcinoma ductal de alto grado
In situ gratis (CDIS) -derivado línea celular (CCdl1797) y líneas de tumor de grado 2 adicionales (CCdl66, CCdl329, CCdl1599) muestran un aumento significativo en la población de la fase S, indicativo de (a) defectos de la síntesis de ADN /replicación debido a estancamiento de las horquillas de replicación, o (b) una tasa de proliferación de las células más rápido. En particular, la especificidad de la respuesta de las células tumorales era común entre las muestras de fibroblastos independientes.
A. Análisis del ciclo celular de líneas celulares de tumor de mama primarios en cocultivo con 2 muestras de fibroblastos independientes, TF1, TF2 y. Los gráficos circulares resumen los datos de FACS. Los números indican porcentaje de células en la fase S del ciclo celular. Cada valor es la media de puntos de datos por triplicado. FACS representativos salpican gráficos se muestran para el control (a la izquierda del gráfico de sectores correspondientes) y las células cocultured-TF2 (derecho de gráfico circular correspondiente). Nota diferentes efectos de co-cultivo estromal sobre el ciclo de las células tumorales. B. Medición de la cinética de la fase S en el tiempo de las líneas representativas de grado 1 y grado 3 de células en la presencia de células TF1 y TF2. Nota efectos de contraste de las células del estroma de la tasa de replicación de líneas de células se muestra. Las barras de error representan la desviación estándar de la media de los valores por triplicado. disminución de fibroblastos inducida en las células marcadas con BrdU en las células tumorales de grado 1, y un aumento correspondiente en las células tumorales de grado 3 fue significativa en todos los puntos de tiempo (p & lt; 0,005 y p & lt; 0,001, respectivamente)
(2) alteraciones dramáticas en la tasa de proliferación de las células tumorales.
para confirmar que una fracción de la fase S aumentó en respuesta a la señalización del estroma en células tumorales de grado 3 de hecho representó una tasa de proliferación más rápida en comparación con grado 1 líneas celulares, los representantes de cada grupo en cocultivo con 2 muestras independientes TF se pulsaron con BrdU en múltiples puntos de tiempo durante un período de tiempo de 1 hora. mediciones FACS de la fracción de células BrdU-incorporando con el tiempo proporcionan una estimación fiable de la tasa de síntesis de ADN en las células tumorales con y sin exposición a la señalización de fibroblastos. la cinética de proliferación de 1 (CCdl22) co-cultivos de grado confirmaron además un G2 detención observado anteriormente fibroblastos inducida /M. la detención del ciclo celular se mantuvo durante todo el transcurso de tiempo experimental, dando lugar a una marcada disminución (hasta 70%) en la proporción de células BrdU incorporación (Figura 3B). En marcado contraste, en el grado 3 (co-cultivos CCdl675), un aumento considerable de al menos 47% y hasta 60% ocurrió en la tasa de replicación basado en las pendientes de las curvas de crecimiento en comparación con las células control. La inducción de una tasa de proliferación más rápida o más lenta en las células tumorales de grado 1 y grado 3, respectivamente, fue consistente entre muestras de fibroblastos independientes.
(3) Stroma asistida protección contra la muerte celular por apoptosis.
para evaluar si la señalización del estroma aumenta la supervivencia y propagación de células tumorales cocultivadas, el antagonista de ESR1, 4-hidroxi tamoxifeno (HTO), conocido para ejercer sus efectos antitumorales por inducción de estrés oxidativo y la posterior apoptosis, se utilizó para iniciar la muerte celular en líneas celulares , que muestran un aumento en la fase S por ciento en respuesta al co-cultivo. Las líneas celulares derivadas tanto de grado 2 (CCdl329 y CCdl1599) y grado 3 fueron evaluados (CCdl675) tumores. Un índice de apoptosis obtenido experimentalmente comparando una sola concentración de 10 mM OHT sin control OHT activar un ensayo normalizado en el que los efectos protectores relativas de cocultivo estromal podrían medirse por tinción de Anexina-V. En primer lugar, una comparación entre la apoptosis de línea de base en líneas de células tumorales (CCdl675, CCdl329 y CCdl1599) cultivadas solas o como co-cultivos con 3 fuentes de fibroblastos independientes (1 reducción mamoplastia-derivado, designado como EF, y 2 tumorales derivadas o TF) demostraron una stromally inducida efecto protector (Figura 4A). La fracción apoptótica se redujo en un 30 a 60% en las líneas de grado 2 de células (CCdl1599 - p & lt; 0,002; CCdl329 - p & lt; 0,001), y por 85% en el grado 3 células (CCdl675 - p & lt; 0,005). Más significativamente, el dramático aumento en la muerte celular inducida por OHT también fue suprimida por la exposición previa de todas las líneas celulares tumorales a 3 cocultivo de fibroblastos. los fibroblastos del estroma tanto de derivación malignas y no malignas fueron igualmente eficaces en la provocación de la supresión de la apoptosis en células tumorales (p & lt; 0,001) (Figura 4B). Si bien es posible que la variabilidad en la respuesta celular a OHT evidente en cocultivo es en gran parte un reflejo de la actividad ESR1 diferencial, nuestros datos sugieren fuertemente que el crecimiento de la inducción de la señalización paracrina en células tumorales puede alterar potencialmente la sensibilidad a la terapia hormonal y desempeñar un papel en el adquisición de un fenotipo resistente.
a. Reducción en la fracción apoptótica línea de base medida como Anexina-V células positivas por análisis de FACS. Tres líneas de células tumorales independientes fueron cocultured con no maligno (EF), y fibroblastos de tumores derivados (TF1) y (TF2), y se compararon con los cultivos control solo tumorales para los cambios en el índice de apoptosis. se muestran los perfiles FACS representativos que se basan los resúmenes gráficos y las células positivas por ciento Anexina-V. Nota disminución significativa en la fracción apoptótica de las 3 líneas tumorales (* p & lt; 0,005). B. La resistencia a la muerte apoptótica inducida por OHT en las células tumorales cocultured con muestras EF y TF en comparación con el control solo tumor tratado con las drogas. Nota notable represión de la muerte celular inducida por OHT cocultivo. C. La neutralización de los niveles celulares ROS medidos como C400 intensidad media de fluorescencia (MFI) por análisis FACS. Los resultados se expresan como porcentaje de reducción sobre la línea de base de fluorescencia de los cultivos frente a cocultivos de tumor de control. se muestran los perfiles FACS representativos que representan los resúmenes gráficos y valores de MFI. Nota disminución de la inducida por OHT C400 MFI de todas las líneas tumorales (* p & lt; 0,005). D. Coculture inducida anulación de la detención G1 mediada por OHT en las células tumorales. reducción de Nota en aumento inducido por OHT ciento de la población G1 en líneas celulares de tumor cocultivadas (* p & lt; 0,005). Cada punto de datos es un promedio de valores triplicados en todos los paneles de la figura. Bares están codificados por colores en los paneles B y D para representar los siguientes: control de -untreated gris, negro - control tratado con OHT, blanco - tratamiento de OHT de EF co-cultivo, azul - OHT tratamiento de TF1 cocultivo, rojo - OHT tratamiento de co-cultivo de TF2.
(4) Reducción del estrés oxidativo en las células tumorales.
La intensidad media de fluorescencia de la tinción C400 sirvió bien como un indicador de los niveles de ROS endógenos, aunque son generalmente bajos en el tumor líneas celulares en comparación con los tipos de células inflamatorias. Se observó una marcada disminución en la acumulación de ROS inducida por OHT en líneas de células tumorales (CCdl1599, CCdl329, y CCdl675) cocultured antes del tratamiento de drogas (Figura 4C). La reducción media de ROS con cocultivo fue del 34% (p & lt; 0,0001). Todas las 3 líneas de células fueron consistentes en su grado de respuesta a fibroblastos malignas y no malignas derivadas de tejido.
análisis del ciclo celular demostró una detención inducida por OHT fase G1 en todas las líneas celulares tumorales ensayadas, que osciló entre un 35% a aumento del 73% en esta fracción (p & lt; 0,001). Además, una acumulación leve en la fracción G2 /M también fue evidente en 2/3 líneas celulares de tumor (p & lt; 0,02) en la presencia del antagonista de la hormona terapéutica. En cocultivos de 2/3 líneas de células tumorales (CCdl1599, CCdl675), la fracción detenido G1-disminuyó significativamente a pesar de la exposición OHT (p & lt; 0,001) (Figura 4D). El efecto protector de co-cultivo de fibroblastos no era tan evidente en la línea CCdl329 ya que muestra resistencia relativa al tratamiento OHT como se indica por el aumento más bajo en la fracción G1 - lo que sugiere que el G1 /S de control puede ser defectuoso en estas células. Curiosamente, a pesar de la inducción de solamente un arresto G1 suave, las células CCdl329 fueron sensibles a la apoptosis inducida por OHT (Figura 4B). Tales respuestas diferenciales a OHT sugieren otras fuentes de variabilidad en los tumores de mama, que modificar aún más el resultado de las interacciones tumor-estroma, y reflejan otras fuentes de heterogeneidad.
En conjunto, nuestros datos demuestran que el co-cultivo de fibroblastos facilitó un paralelo reducción de los 3 parámetros independientes pero estrechamente relacionadas, del daño inducido por OHT: acumulación de ROS, la detención de G1 y la muerte celular por apoptosis dentro de un subconjunto agresiva de líneas celulares derivadas de tumores de mama primario. Sin embargo, a pesar de la capacidad de respuesta del tumor promover mostrada por estas líneas celulares, marcada variación fue evidente. células CCdl329 evadidas eficazmente la apoptosis inducida por OHT a pesar de la detención en G1 en presencia de la droga fue superado sólo parcialmente por cocultivo. En contraste, las células CCdl675 eran relativamente deficiente en la superación de la carga de apoptosis a pesar de la reducción de ROS observado y una disminución notable en el G1 y G2 /M arrestado fracción, en consonancia con nuestras observaciones de la reparación deficiente que culminan en un aumento de la inestabilidad genómica (datos que se publicarán en otros lugares ).
fibroblastos del estroma inducida impacto funcional es reversible
por último, para evaluar la reversibilidad de los puntos finales distintivos y deterministas de la agresividad del crecimiento inducida stromally, se analizaron las células tumorales en un período de recuperación a corto plazo para reversión de los cambios del ciclo celular, y la inducción de la muerte celular, después se interrumpieron las condiciones de cocultivo (Figura 5A). La eliminación de la influencia del estroma de grado 3 (CCdl675) cocultivos revirtió el aumento de la fase S sorprendente por el control durante el periodo de prueba de 48 horas. Sin embargo, no se detectó aumento en la muerte celular apoptótica durante este periodo (datos no presentados), lo que confirma que el aumento inducido por cocultivo en la fracción de BrdU marcado de las células tumorales representaba una población de ciclo más grande, en lugar de la acumulación en la fase S debido a la Replicación detener y estancamiento tenedor. En el caso de esta última posibilidad, la terminación de cocultivo habría conducido a la celda progresión del ciclo en las células tumorales que alberga un conjunto de cromosomas no replicado, que culmina en catástrofe mitótica y la muerte celular. En el grado 1 en las células tumorales (CCdl22), que respondían al co-cultivo, mostrando un aumento medio del 64% en el G2 /M detenidos población en relación con el control (p & lt; 0,001), el ciclo celular se observó el reingreso después de la retirada de fibroblastos. Sin embargo, como el cultivo alcanzó la confluencia en el marco de tiempo experimental, un paro G0 /G1 posterior fue evidente tanto en las células control y cocultured grado 1, sugiriendo fuertemente que (a) estas células tumorales eran de reparación del ADN probable competentes, como la eliminación de los efectores del estroma superado el punto de control G2, y que el potencial de (b) el crecimiento fue intacto, pero sensible a la regulación negativa por la señalización paracrina. Había el G2 /M puesto de control no era reversible, pero debido lugar a la aparición de la detención de la mitosis en co-cultivos, que habría dado lugar a la muerte celular por apoptosis, detectable como un aumento sustancial de la población subG1 dentro del período de prueba.
A. perfiles comparativos del ciclo celular de las células tumorales de grado 1 y grado 3 Después de 7 días de co-cultivo de fibroblastos, seguido de un período de 48 horas sin cocultivo. Nota marcada reducción en la población G2 de la línea celular de grado 1 a la terminación de las condiciones de cocultivo. Ambas poblaciones control y de prueba muestran signos de detención G0 /G1 debido a la confluencia de cultivo. En la línea de tumor de grado 3, ciclismo mensaje de células co-cultivo vuelve a controlar los perfiles. segmentos de gráfico de sectores numeradas indican el porcentaje de células en G1 y fase S. SubG1: amarillo; G1: verde; S: rojo; G2 /M: azul. B.
El modelo TextoNO
:
a través de la aplicación de los co-cultivos interactivos en vivo de los fibroblastos del estroma y el epitelio derivado del tumor primario de variar el grado histológico, TextoNO ofrece nuevos conocimientos sobre las bases biológicas de grado- estratificación asociado de cáncer de mama primario. Se propone que las líneas celulares derivadas de tumores bien diferenciados asociados con buen pronóstico clínico recapitulan sus características funcionales en presencia de fibroblastos del estroma
in vitro
. Del mismo modo, las células tumorales derivadas de lesiones malignas mal diferenciados retienen la capacidad contextual para responder a la misma influencia paracrina de una manera correspondiente a la agresividad del cáncer y el resultado desfavorable paciente. Tales sistemas de modelos auténticos son una herramienta esencial para el avance de los objetivos de la investigación en la biología del cáncer.
En general, los resultados experimentales en este estudio son consistentes y de apoyo de los datos de los resultados clínicos diferenciales derivados a través del análisis de perfiles de TextoNO correlativa de cáncer de mama primario. En conjunto, proporcionan un marco conceptual para la nueva asociación significativa entre el patrón de expresión en el tumor TextoNO moderadamente y pobremente diferenciado o de grado 2 y 3, respectivamente, y el papel del estroma en la inducción de rápido crecimiento y los pobres resultados clínicos. En contraste, la inducción de punto de control en las células bien diferenciadas o grado 1 tumorales mediadas por la señalización del estroma se corresponde con el patrón de expresión génica observada de tumores primarios, que confieren un buen resultado clínico (Figura 5B).
Discusión
hacia una visión completa del desarrollo y progresión del cáncer, una delimitación exhaustiva de las fuentes subyacentes que contribuyen a la manifestación de los fenotipos malignos y su heterogeneidad, es crítica. En estudios anteriores se ha identificado de forma única fenotipos intrínsecas que reflejan la variabilidad histológica del tumor pero independiente de las influencias contextuales, tales como la inducción del estroma [21]. Mediante el empleo de co-cultivo experimental en conjunción con nuevas líneas celulares de tumores primarios, aquí nuestro enfoque ha identificado TextoNO, una respuesta programada de factores secretados stromally. En lugar de un impacto del estroma que promueve o inhibe de manera uniforme todos los tumores, nuestros datos demuestran la importancia de la capacidad de respuesta epitelial variable en resultado de la enfermedad. Junto con los análisis correlativos de tejido clínica, sin embargo este tipo de amplio alcance estrategias de investigación enfocados a definir el marco funcional de los fenotipos de cáncer podría mejorar sustancialmente el alcance y la precisión de la identificación de objetivos druggable.
El perfil TextoNO generado a través de co-cultivo experimental retrata la regulación del estroma de los principales programas biológicos, lo que sugiere un papel clave para la promoción del estroma asistida de las primeras características del cáncer abarca la evasión de los circuitos de regulación, tales como la vigilancia inmunológica, el estrés oxidativo, y la deficiencia metabólica [24], además de las características del cáncer avanzado [25]. En consecuencia, se encontró el perfil de expresión TextoNO estar asociado con un pobre resultado clínico en dos conjuntos de datos independientes, que representan más de 600 casos. Consistente con estos datos clínicos correlativos, hemos demostrado, además, que los efectos funcionales de aguas abajo de los cambios transcripcionales stromally inducidas fueron dramáticamente variable entre las células de tumor de mama primarios de derivación histopatológico divergente. En las células de cáncer de mama agresivos, los efectos promotores de tumores fueron evidentes como una mayor capacidad para la neutralización del estrés oxidativo, la evasión de la apoptosis y el ciclo celular rápida.