Extracto
Antecedentes
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) se caracteriza por la rápida progresión y bajas tasas de supervivencia. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos agentes terapéuticos para esta enfermedad. La capsaicina, el ingrediente activo de los chiles, muestra actividad anti-proliferativa en la próstata y el cáncer epidermoide
in vitro
. Sin embargo, la actividad anti-proliferativa de la capsaicina no se ha estudiado en SCLCs humanos. El presente manuscrito llena este vacío de conocimiento y explora el efecto antiproliferativo de la capsaicina en el CPCP
in vitro
y
in vivo.
Metodología /Principales conclusiones
ensayos de BrdU y PCNA ELISA mostraron que la capsaicina muestra robusta actividad anti-proliferativa en cuatro líneas celulares de SCLC humanos. Por otra parte, la capsaicina potentemente suprime el crecimiento de tumores SCLC H69 humanos
in vivo
, que se comprobó mediante ensayos de CAM y modelos de ratones desnudos. La segunda parte de nuestro estudio se trató de proporcionar información sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la actividad anti-proliferativa de la capsaicina. Se encontró que la actividad anti-proliferativa de la capsaicina se correlaciona con una disminución en la expresión de genes de proliferación E2F-sensibles como la ciclina E, la timidilato sintasa, cdc25A y CDC6, tanto en el ARNm y los niveles de proteína. El factor de transcripción E2F4 mediada la actividad anti-proliferativa de capsaicina. La ablación de los niveles de E2F4 por la metodología ARNsi suprime la detención de G1 inducida por capsaicina. Chip ensayos demostraron que la capsaicina provocó el reclutamiento de E2F4 y p130 en promotores proliferativos sensible a E2F, lo cual inhibe la proliferación celular.
Conclusiones /Importancia
Nuestros hallazgos sugieren que los efectos antiproliferativos de la capsaicina podría ser útil en la terapia de SCLCs humanos
Visto:. Marrón KC, Witte TR, Hardman WE, Luo H, Chen YC, carpintero AB, et al. (2010) La capsaicina Muestra antiproliferativa La actividad contra Humano Cáncer de pulmón microcítico en cultivos celulares y modelos ratones desnudos a través de la E2F Pathway. PLoS ONE 5 (4): e10243. doi: 10.1371 /journal.pone.0010243
Editor: Dong-Jin Yan, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 8 de Enero, 2010; Aceptado: March 24, 2010; Publicado: 20 Abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Brown et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un Centro de Investigaciones Bioquímicas de Excelencia de Investigación piloto de subvención de los Institutos nacionales de Salud (número de concesión 5P20RR020180); la Asociación de Fabricantes de Productos Farmacéuticos Fundación Beca de Investigación de arranque; la beca Marshall Universidad ADVANCE; una beca de investigación de pregrado subvención-en-Ayudas de National Aeronautics and Space Administration; y un Premio Joven científico clínico del asistente de vuelo Instituto de Investigación Médica (número de concesión 82.115). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) es una neoplasia agresiva que representa el 13% de todos los casos de cáncer de pulmón, con una tasa de supervivencia global a 5 años de menos del 5% [1], [2]. Tales estadísticas ponen de relieve la necesidad de nuevas estrategias de tratamiento para esta enfermedad. Los recientes avances en la comprensión básica de los eventos moleculares implicados en la progresión del SCLC han llevado a la identificación de los agentes potenciales para intervenciones terapéuticas [2], [3], [4], [5]. Estas estrategias incluyen el factor de crecimiento /inhibidores específicos del receptor, inhibidores de proteína quinasa y agentes nutricionales. La identificación de los agentes nutricionales que muestran actividad anti-proliferativa puede representar una vía terapéutica novedosa en SCLC humano.
La capsaicina, el ingrediente activo principal de los chiles, se utiliza por vía tópica para tratar el dolor y la inflamación asociados con una variedad de enfermedades [6], [7]. estudios de quimioprevención demuestran que la capsaicina puede suprimir la carcinogénesis de la piel, colon, pulmón, la lengua y de próstata [8], [9], [10], [11], [12]. Aunque estos estudios han abordado el potencial quimiopreventivo de la capsaicina, sólo unos pocos han abordado su potencial como un agente anti-cáncer. Por ejemplo, la capsaicina se ha demostrado que induce la apoptosis en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), células de leucemia de células T, carcinoma de esófago, astroglioma, próstata, colon y cáncer gástrico en modelos de cultivo celular [13], [14], [15], [16], [17]. Además, la administración de capsaicina se ha demostrado que suprimir el crecimiento tumoral del cáncer de próstata en modelos de ratones nude [10], [18].
Además de causar la apoptosis, la capsaicina se ha encontrado para inducir la detención del ciclo celular en el cáncer humano Células. Varios estudios convergentes han demostrado que la detención G1 inducida por capsaicina en células de carcinoma epidermoide humano CE 81T /VGH y células de cáncer de próstata ocurrir a través de la inducción de la p53 y la quinasa (cdk) inhibidor de la p21 dependiente de ciclina [10], [17], [19 ], [20], [21]. El tratamiento de células HL-60 de leucemia humanas con capsaicina provocó la detención en G1 a través de la inhibición de la actividad cdk2. La actividad anti-angiogénica de la capsaicina se atribuye a su capacidad para provocar la detención en G1 en las células endoteliales. arresto G1 inducida por capsaicina se correlaciona con la supresión de los niveles de ciclina D1, inhibición de la actividad cdk4 y la fosforilación de Rb en las células endoteliales y de cáncer de mama [21], [22]. Estos datos plantean la posibilidad de que la actividad anti-proliferativa de la capsaicina está mediada por sus efectos sobre la vía de E2F-Rb.
La familia E2F de factores de transcripción, que consta de ocho genes miembros (E2F1-E2F8), obras de teatro un papel fundamental en la regulación de la progresión del ciclo celular y la proliferación celular [23], [24], [25], [26]. Estos han sido E2Fs subclassified su vez en dos grupos en función de sus propiedades reguladoras de la transcripción de genes promotores. E2F1, E2F2 y E2F3 se refieren a menudo como E2Fs "activador", ya que activan transcripcionalmente genes E2F objetivo proliferativas como la ciclina E, cdc25A y cdc6 [25], [27], [28], [29]. Estos genes diana entonces inducen la entrada de las células en la fase S, promoviendo así la progresión del ciclo celular. La segunda subclase, E2F4 y E2F5, se conocen como los "represores" E2Fs porque reprimen la transcripción de los genes E2F objetivo proliferativas. miembros de la familia E2F E2F6, E2F7 y E2F8 también son represores. E2F7 y E2F8 son los miembros más recientemente identificados de esta familia, y mucho menos se sabe acerca de su función y regulación [25]. A pesar del hecho de que todos los E2Fs transcripcionalmente activos se unen al mismo sitio de reconocimiento de ADN en el objetivo de los promotores, que tienen diferentes roles funcionales en la célula [26], [29].
Los estudios realizados en los últimos años han demostrado que la actividad de E2Fs está estrictamente regulada por la familia de proteínas de bolsillo, es decir, Rb, p130 y p107. E2Fs 1-3 puede unirse a la proteína Rb, pero E2Fs 4 y 5 de unirse preferentemente a p107 y p130 proteínas [24], [25], [26], [29], [30]. Las proteínas de la familia Rb se unen a un resto dentro de la región de activación transcripcional de E2Fs, reprimir eficazmente su actividad. Por lo tanto, las células quiescentes contienen altos niveles de proteínas E2F unidos a Rb, p130 y p107. El inicio de estímulos mitógenos provoca la fosforilación de Rb, p130 y p107 por la ciclina D y E y sus quinasas asociadas. La fosforilación de Rb, p107 y p130 resultados en su inactivación y la disociación de las proteínas E2F [25]. Estos E2Fs libres posteriormente se unen para apuntar promotores proliferativas como la ciclina E, la timidilato sintasa (TS), cdc25A y CDC6, que regulan la progresión del ciclo celular [31], [32]. De estos, E2F1-3 estimular la transcripción de los genes mencionados anteriormente, mientras que E2F4 y E2F5 reprimir la transcripción [25]. Una mayoría de SCLC humana son deficientes en la proteína Rb [3]. Por lo tanto, es probable que los otros dos bolsillos proteínas, p107 y p130, juegan un papel vital en la regulación E2F y la proliferación celular en SCLCs humanos.
La actividad anti-proliferativa de la capsaicina no se ha estudiado en humanos SCLCs . El presente manuscrito llena este vacío de conocimiento y muestra por primera vez que la capsaicina puede inhibir potentemente la proliferación de SCLCs humanos utilizando cultivo celular múltiple y
in vivo y modelos. Estudios anteriores han demostrado que la mayoría de SCLCs humanos tienen mutaciones en Rb y p53, así como una desregulación en la vía de E2F-Rb [3], [4], [5]. Los datos obtenidos de microarrays, muestras de tejidos de pacientes con cáncer de pulmón y líneas de células de cáncer de pulmón humanos indican que las moléculas reguladoras del ciclo celular, como E2F1-5, p130, Skp2, ciclina D1 y p16, contribuyen al crecimiento y la progresión de los tumores de pulmón [33] . Por lo tanto, la hipótesis de que la capsaicina muestra la actividad anti-proliferativa en SCLCs humanos mediante la regulación de la actividad de la familia E2F de factores de transcripción.
El presente manuscrito es un estudio inicial destinado a investigar la actividad anti-proliferativa de capsaicina en SCLC humano en ambos modelos de cultivo celular y animales. Aquí, hemos demostrado por primera vez que la capsaicina muestra una potente actividad anti-proliferativa en cuatro líneas celulares de SCLC humanos
in vitro
. Además, nuestros resultados muestran que la capsaicina suprime el crecimiento de tumores SCLC humanos en modelos de ratones desnudos y CAM. También hemos explorado la contribución de la familia E2F de factores de transcripción en los efectos inhibidores de crecimiento de la capsaicina en células de SCLC. Hemos observado que la capsaicina inhibe la proliferación de SCLCs humanos a través de un miembro específico de la familia E2F, a saber E2F4. Se encontró la ablación de los niveles de E2F4 por dos siRNA independiente para neutralizar el efecto antiproliferativo de la capsaicina. Además, la detención del crecimiento inducida por capsaicina se asoció con una disminución en la expresión de los genes diana de E2F de la ciclina E, TS, Cdc25A y Cdc6. Por último, IP cromatina (CHIP) análisis de las células de SCLC humanos demostró que el tratamiento de la capsaicina se redujo el reclutamiento de E2Fs activador, es decir, E2F2 y E2F3, proliferativa promotores como la ciclina E, TS, cdc25A y cdc6. Por otro lado, el reclutamiento de E2F4 represor se mejoró por la capsaicina tratamiento. En conjunto, nuestros datos sugieren que la capsaicina muestra una potente actividad anti-proliferativa en las células de SCLC humanos mediante la regulación diferencial de la familia E2F de factores de transcripción. Por otra parte, nuestros resultados plantean la posibilidad de que los agentes nutricionales como la capsaicina pueden ser útiles para la terapia de SCLC humano.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Los ratones desnudos se obtuvieron a partir Charles River Laboratories y aclimataron durante una semana. Ellos fueron alojados en jaulas tratado al autoclave con
ad libitum
acceso a los alimentos y el agua en bastidores filtros HEPA y seguidos de cerca por personal de las instalaciones de los animales. Todos los procedimientos que implican ratones desnudos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de cuidado y uso de animales en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) Internacional y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de Joan C. Edwards School of Medicine, Universidad de Marshall (protocolo#371).
Cultivo de células y transfección
Las líneas celulares de SCLC humanas NCI-H69, NCI-H82 (en lo sucesivo, H69 y H82, respectivamente), y DMS53 DMS114 se obtuvieron de American Type Culture Collection, Rockville, MD. Estas líneas celulares fueron elegidos porque se han estudiado ampliamente, y sus características físicas y moleculares se parecen mucho a SCLC en los pacientes. Gazdar et al., (1985) originalmente aislado y caracterizado las líneas de células H69 y H82 [34], [35]. Ellos encontraron que las características de morfología y crecimiento de células H69 y H82 eran típicas de las células tumorales de SCLC que se encuentran en los pacientes. Además, se encontró que el perfil bioquímico de estas células (presencia de la descarboxilasa de L-dopa, marcadores neuroendocrinos, la inmunorreactividad de la bombesina-como, enolasa específica de neuronas y altas concentraciones de la isoenzima cerebral de creatina quinasa) para ser idénticos a los tumores SCLC humanos observados en los pacientes . Del mismo modo, las células DMS53 y DMS114 se aislaron primero a partir de biopsias de SCLC humanos y caracterizados por Pettengill et al., (1980). Ellos encontraron que tanto DMS53 y DMS114 retuvieron el perfil físico, morfológica y bioquímica de los tumores humanos de SCLC observadas en la clínica [36].
H69 y H82 se mantuvieron en RPMI-1640 suplementado con 2 mM de glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (FBS). células de SCLC humanos DMS53 se cultivaron en medio de Waymouth MB752 /1, que contiene glutamina 2 mM, 100 unidades /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina y 10% de FBS. Se obtuvieron los medios de cultivo para las células de SCLC humanos DMS114 era idéntica a DMS53, excepto que el medio contenía un bicarbonato de sodio adicional 2%.
primarios células normales humanas bronquiales epiteliales (NHBE) y células epiteliales de las vías aéreas pequeñas (SAEC) Lonza Technologies, Suiza. NHBEs se mantuvieron en medios que contienen factores de crecimiento BEBM. Del mismo modo SAECs se mantuvieron en medios complementados SABM con factores de crecimiento. Tanto los medios de comunicación y BEMB SABM se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos utilizando NHBEs y SAECs se realizaron entre los pasajes 3-8 [31].
MTT Ensayo
ensayos de MTT se realizaron como se describe por Heo et al., (1990). células H69 y H82 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 50.000 células /pocillo. células DMS53 y DMS114 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5.000 células /pocillo. Las placas se incubaron durante 24 horas para permitir la reinserción completa de las células. Posteriormente, las células se trataron con 50 mM de capsaicina durante 24 horas, 48 horas o 72 horas. Después de que los puntos de tiempo indicados, se añadieron 50 l de solución de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo, y las placas se incubaron durante 4 horas a 37 ° C [37]. A continuación, se aspiró el medio y se añadió 150 ml de DMSO a cada pocillo para solubilizar los cristales de formazán. La absorbancia de las placas se midió en un lector de ELISA (Benchmark, BioRad) a una longitud de onda de 540 nm. Cada muestra se realizó por triplicado, y todo el experimento se repitió dos veces.
BrdU y PCNA Ensayos de proliferación
bromodesoxiuridina (BrdU) enzima de marcación ensayo de inmunoabsorción ligado (ELISA) se obtuvieron de Roche Bioquímicos y se utilizaron para examinar los efectos de la capsaicina sobre la proliferación de cuatro líneas celulares humanas SCLC, H69, H82, DMS53 y DMS114. BrdU es un análogo de nucleótido de timidina que se incorpora durante la fase S (en lugar de timidina) sólo en el ADN de las células proliferantes [31], [32], [38] las células.
H69 y H82 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 50.000 células /pocillo. células DMS53, DMS114, SAEC y NHBE se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células /pocillo. DMS53 y DMS114 se incubaron con medio libre de suero durante 36 horas para eliminar el efecto de factores de crecimiento endógenos. Después de 36 horas, estas células fueron luego re-estimularon con 10% de FBS en presencia o ausencia de las concentraciones indicadas de capsaicina durante 18 horas, que es el tiempo requerido para la entrada de la fase S [31], [32], [38] . El NHBEs y SAECs se prestaron reposo en medios basales contienen ¼ de la cantidad (v /v) de factores de crecimiento durante 24 horas (CIT). Posteriormente, las células fueron estimuladas con medio completo que contiene el volumen completo de factores de crecimiento durante 18 horas como se describió anteriormente. La tasa de incorporación de BrdU se midió por la técnica de ELISA, y el porcentaje de células en fase S se cuantificó mediante la evaluación colorimétrica (λ = 405 nm). La absorbancia de las células tratadas con 10% de FBS o medios de comunicación completa se supone que es 100%, y disminuye la capsaicina inducida en la fase S se calcula como un porcentaje de las células tratadas FBS control. Cada muestra se ensayó por triplicado, y el ensayo se repitió dos veces.
La proliferación celular también se evaluó mediante la medición de los niveles de antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) usando un kit de ELISA PCNA de Calbiochem. H69, H82, DMS53 y DMS114 se sembraron en placas de 96 pocillos y se trataron de una manera idéntica como el ensayo de BrdU se ha descrito anteriormente. Posteriormente, se retiró el medio, y se añadió tampón de resuspensión (Tris 50 mM, pH 8, EDTA 5 mM, PMSF 0,2 mM, 1 mg /ml de pepstatina, 0,5 mg /ml de leupeptina) a las células. El nivel de PCNA en las células se cuantificó midiendo la absorbancia a 405 nm, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada muestra se ensayó por duplicado, y el ensayo se repitió dos veces para cada tipo de célula.
se utilizaron análisis del ciclo celular
células H69 SCLC para el análisis del ciclo celular, utilizando una modificación del yoduro de propidio técnica [15], [39]. En pocas palabras, se utilizaron 5 × 10
5 células por muestra. Cada muestra se incubó con medio libre de suero durante 36 horas para eliminar el efecto de factores de crecimiento endógenos. Después de 36 horas, las células se volvieron a estimular con 10% de FBS en presencia o ausencia de 50 mM capsaicina durante 18 horas, que es el tiempo requerido para la entrada de la fase S [30]. Se recogieron las células, se lavaron dos veces en tampón (1 mM de EDTA en DPBS sin calcio y magnesio, suplementado con 1% de ultra baja IgG FBS, Invitrogen Corporation), se fijaron en hielo frío de etanol al 70% y se resuspendieron en solución de tinción de yodo propidio (50 g /ml de yoduro de propidio, 25 mg /ml RNasa a en tampón /EDTA DPBS) durante 30 minutos a 37 ° C. Las muestras se analizaron por un flujo BD FACS Aria II citómetro (BD Biosciences).
lisados y transferencia Western
lisados para cada línea celular se hicieron utilizando el protocolo de lisis basado en NP-40 [ ,,,0],31], [38], [40]. células DMS114 se cultivaron en placas de 100 cm a aproximadamente 70% de confluencia. Las células se vuelven quiescentes por incubación en medio libre de suero durante 36 horas. Posteriormente, las células se re-estimularon con 10% de FBS en presencia o ausencia de las dosis indicadas de la capsaicina durante 18 horas. Las células se recogieron y se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo. Las células fueron lisadas con tampón M2 de lisis (Tris 20 mM, pH 7,6, 0,5% NP-40, NaCl 250 mM, EGTA 3 mM, EDTA 3 mM, 4 mM de DTT, mM PMSF 5, fluoruro de sodio 1 mM, sodio 1 mM ortovanadato, 25 mg /ml de leupeptina, 5 mg /ml de pepstatina, 5 mg /ml de aprotinina, 25 mg /ml de inhibidor de tripsina-quimotripsina). Se añadieron setenta microlitros de tampón de lisis por cada 20 l de volumen de la masa globular. El lisado se hizo girar a 4 ° C durante 30 minutos y posteriormente se centrifugó a 15.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante para su posterior análisis. La concentración de proteína del lisado se midió usando un reactivo de Bradford (Bio-Rad Labs). Ciento cincuenta microgramos alícuota de la proteína se llevó a cabo en un gel de SDS-PAGE 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (BioRad Labs).
La expresión relativa de las proteínas indicadas se analizó por Western Blot. monoclonal E2F1 y policlonales E2F2-6 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos monoclonales para TS, cdc25A y cdc6 también fueron obtenidos de Santa Cruz Biotechnology. El anticuerpo monoclonal de la ciclina E se obtuvo de BD Biosciences. anticuerpo β-actina monoclonal se obtuvo de Sigma Chemical Company, EE.UU.. anticuerpo policlonal GAPDH se obtuvo de Trevigen, Inc. Los anticuerpos secundarios fueron obtenidos de Pierce biotecnologías. La señal obtenida en los experimentos de Western blot fue detectado por el SuperSignal West Dura Sustrato Duración extendida (Pierce Biotecnología). Los resultados de los ensayos de transferencia de Western se cuantificaron por análisis densitométrico (Sistema de documentación de gel BioRad) utilizando el software de análisis de Cantidad 4.5.2.
embrión de pollo corioalantoidea de membrana (CAM) Ensayo
de patógenos específico libres (SPF) huevos de pollo fértiles (Charles River Laboratories, North Franklin, CT) se incubaron a 37,5 ° C con 75% de humedad relativa, y continuamente giran lentamente por un tornero de huevo automático (GQF Manufacturing Company, Savannah, GA). En el día 9, los huevos se trasluz y ventanas abiertas en la cubierta para exponer la CAM [41]. células H69 (3 × 10
6) se suspendieron en 100 l de medio libre de suero frío, se mezcla con 100 l fría BD Matrigel Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA) y 50 mM capsaicina. Estas células se aplicaron a la CAM de cada embrión de pollo. Los huevos fueron incubados a 37 ° C durante 4 días antes de que se retiraron, fotografiadas y se pesaron los implantes tumorales. Un total de 12 huevos fueron ensayados para cada grupo [41].
Estudios antitumoral en ratones desnudos
Ocho 4 semanas de edad ratones desnudos macho se obtuvieron de Charles River Laboratories y aclimatados durante una semana. Ellos fueron alojados en jaulas tratado al autoclave con
ad libitum
acceso a los alimentos y el agua en bastidores filtros HEPA y seguidos de cerca por personal de las instalaciones de los animales. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de cuidado y uso de animales en una instalación acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) Internacional y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de Joan C. Edwards escuela de Medicina de la Universidad Marshall (protocolo#371).
se recogieron las células H69 y re-suspendidas en una solución 01:01 (v /v) de medio libre de suero y de la matriz de Matrigel (BD Biosciences). Se inyectaron dos millones de células en 100 l por vía subcutánea entre las escápulas de cada ratón [42]. Después de que los tumores alcanzaron 100 mm
3, los ratones se cambiaron a controlar dieta basada AIN-76A que contiene aceite de maíz 10% hasta que los tumores alcanzaron 800 mm
3. Posteriormente, los ratones se dividieron en dos grupos. El grupo de tratamiento (N = 4) se cambió a una dieta que contenía 50 mg de capsaicina /kg de alimento (que es de aproximadamente 10 mg de capsaicina /kg de peso corporal de ratón por día). El grupo de control (N = 4) se continuó con la dieta control. Los ratones se pesaron una vez por semana. Su consumo de alimentos se controló pesando la comida sobrante una vez por semana. La administración de capsaicina causado ninguna molestia o pérdida de peso en ratones. Además, la ingesta de alimentos fue similar entre el control y los ratones tratados con capsaicina.
El tratamiento farmacológico se continuó hasta que los tumores del grupo control alcanzaron 2.000 mm
3. tumorales longitudes (L), anchuras (W) y altura (h) se midieron diariamente (durante 6 días de cada semana) para cada ratón. Los volúmenes tumorales se calculan como (L x W x h) /2 [43], [44]. Después de la eutanasia de los ratones, se extirparon los tumores. La mitad del tumor se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se utiliza para hacer lisados. lisados tumorales se prepararon utilizando T-Per tampón de lisis (Pierce Biotechnology), según el protocolo del fabricante [38]. La otra mitad del tumor se fijó en formalina y se utiliza para inmunohistoquímica.
Cleavage Ensayo de Caspasa
ensayo de escisión de la caspasa se realizó con lisados tumorales preparadas a partir de ratones de control y ratones tratados con capsaicina utilizando el caspasa -3 kit de escisión (Chemicon, Temecula). lisados tumorales se prepararon utilizando T-Per tampón de lisis como se describió anteriormente. Una parte alícuota de 60 l de lisado se utilizó para cada reacción. Además, 60 l de cisplatino tratados con lisado H69 (hechos de tratamiento de células H69 con 30 M de cisplatino durante 72 horas) se utilizó como control positivo, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada muestra fue analizada por duplicado, y el ensayo se repitió dos veces para cada tipo de célula.
La inmunohistoquímica
La inmunotinción se realizó a través de M.O.M. kit de tinción (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). secciones de parafina embebido en H69 xenoinjerto de ratón de tejido (4 M) se dewaxed en xileno y rehidratada posteriormente en etanol. Las secciones se someten a un tratamiento de recuperación de antígeno usando el kit de antígeno Retrival (BioGenex Inc.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las secciones se trataron a continuación con el tratamiento de proteinasa K (20 mg /ml) durante 15 minutos y enfriados de peroxidasas endógenas en 0,3% H solución
2O
2 en metanol durante 30 minutos. Las secciones fueron bloqueadas usando el kit de bloqueo de avidina-biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Las secciones se incubaron con anti-PCNA (BioGenex Inc.) anticuerpo primario monoclonal (1:100 dilución) durante una hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron en PBS para eliminar el exceso de anticuerpo y se desarrolló usando el M.O.M. y peroxidasa kit DAB, obtenida de Vector Laboratories (Burlingame, CA). Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina, se deshidrataron, montadas en medio de montaje Permount (Fisher Biotech) y se fotografiaron bajo Olympus BX41 microscopio de campo claro. Hemotoxylin y eosina (H y E) las imágenes fueron fotografiadas en un aumento de 40X. tinción con PCNA fue fotografiada con un aumento de 1000X utilizando aceite. células positivas PCNA, que son las células en proliferación, se cuantificaron contando 5 campos de 100 células. Los datos se presentan como el porcentaje de células PCNA positivas.
siRNA transfección y ensayos
Químicamente sintetizado, de cadena doble siRNA para E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5 y E2F6 se adquirió de Santa Cruz Biotechnology. Los experimentos de transfección se realizaron en células H69 y DMS114 [31], [45]. se recogieron las células asíncronas y re-sembraron en placas de 96 pocillos a aproximadamente 40% de confluencia en medio de crecimiento que contiene 10% de FBS en ausencia de antibióticos. La transfección de la mencionada siRNA se realizó mediante el uso de reactivo de Oligofectamine (Invitrogen Corporation), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Dieciocho horas después de la transfección, las células se vuelven quiescentes durante 36 horas por incubación en medio libre de suero. Posteriormente, las células se trataron con 10% de FBS en presencia de 50 mM capsaicina durante 18 horas. La capsaicina se añadieron 30 minutos antes de la adición de los medios que contienen 10% de FBS. Después de 18 horas, el porcentaje de células en fase S se midió por el kit BrdU ELISA (Roche Laboratories). Una secuencia de siRNA no director (Santa Cruz Biotechnology) se utilizó como control negativo para los experimentos de transfección. Cada transfección se realizó por duplicado, y todo el ensayo se repitió dos veces
.
Los resultados de los experimentos de transfección E2F4 se verificaron usando un segundo conjunto de siRNA independiente obtenido de Ambion Biotecnologías [31], [45]. El protocolo de la transfección era mismo que el descrito anteriormente. A no director de control-siRNA se utilizó como control negativo en todos los experimentos. Cada transfección se realizó por duplicado, y todo el ensayo se repitió dos veces
.
se realizaron experimentos de transferencia Western para evaluar la expresión de proteínas después de la transfección siRNA [31], [45], tanto en H69 y células DMS114. Cada transfección en las células H69 se realizó utilizando 5 × 10
5 células sembradas en matraces T-10 (Midwest Scientific) en RPMI que contiene FBS al 10% sin antibióticos. En el caso de las células DMS114, la transfección se llevó a cabo en placas de 6 pocillos, usando 5 × 10
5 células /pocillo. En tanto las células H69 y células DMS114, cada transfección se realizó por duplicado, y todo el experimento se repitió dos veces. La transfección del ARNsi indicado se llevó a cabo utilizando el reactivo Oligofectamine (Invitrogen Corporation), de acuerdo con el protocolo del fabricante. A no director de control-siRNA se utilizó como control negativo. Después de 36 horas de la transfección, se hicieron los lisados como se describe anteriormente y la expresión de la familia E2F de proteínas se determinó mediante análisis Western Blot.
PCR en tiempo real
H69 células fueron sometidas a privación de suero durante 36 horas y posteriormente se estimularon con 10% de FBS durante 8 horas [46]. El ARN total se aisló usando el kit RNeasy miniprep de QIAGEN. Un microgramo de ARN fue tratada usando DNasa RQ1 DNasa (Promega), seguido de la síntesis de ADNc de primera cadena usando el kit de síntesis de cDNA iScript (Bio-Rad). Una fracción (1/20) del volumen de reacción de ADNc final se utilizó en cada PCR [46]. Primer secuencias [46], [47] son los siguientes:
ciclina E (cebador directo): 5'TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC3 '.
ciclina E (cebador inverso): 5'TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC3'.
TS (cebador directo): 5'CTGCCAGCTGTACCAGAGAT3 '
TS (cebador inverso):. 5'ATGTGCATCTCCCAAAGTGT3'.
Cdc6 (cebador directo): 5'CCCCATGATTGTGTTGGTAT3 '.
Cdc6 (cebador inverso): 5'TTCAACAGCTGTGGCTTACA3 '
18S (cebador directo):. 5'CTCAACACGGGAAACCTCAC3'
18S (cebador inverso):. 5'AAATCGCTCCACCAACTAAGAA3 ' .
-PCR en tiempo real se realizó en un Bio-Rad iCycler.
inmunoprecipitación de cromatina (cHIP) Ensayo
H69 fueron suero de hambre durante 36 horas mediante su incubación en sin suero RPMI-1640 [31], [32], [40], [48]. Posteriormente, estas células H69 quiescentes fueron re-estimularon con 10% de FBS en presencia o ausencia de 50 mM capsaicina durante 8 horas. Se utilizaron veinte y cinco millones de células por reacción de IP. Las células se trataron con 1% de formaldehído durante 10 minutos a temperatura ambiente para reticular las proteínas y el ADN. La reticulación se terminó mediante la adición de 0,125 M de glicina. Conejo anti-ratón anticuerpo secundario se utilizó como el control para todas las reacciones. Las reacciones de PCR se realizaron con 5 l de ADN a partir de las reacciones de inmunoprecipitación o 1 l de ADN de la reacción de entrada como plantilla. condiciones de los ciclos de PCR para TS y CDC6 fueron las siguientes: 94 ° C durante 2 min; luego 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 56 ° C durante 30 s y 65 ° C durante 30 s; seguido de 65 ° C durante 2 min. condiciones de los ciclos de PCR para la ciclina E fueron las siguientes: 94 ° C durante 2 min; luego 35 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 66 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s; seguido de 72 ° C durante 2 min. El cebador para la ciclina E abarcaba dos de los tres sitios de unión a E2F en el promotor como se describe en Nevins et al., (1994). Estos sitios de unión comprenden la alta afinidad E2F sitios en el promotor de la ciclina E humana [49] de unión. PCR para el promotor c-Fos (que no está regulado por E2F) se utilizó como control negativo para todos los experimentos. Las secuencias de los cebadores de PCR usados en las PCR fueron las siguientes:
ciclina E (cebador directo): 5'CCCCGTCCCTGCGCCTCGCTG3 '.
ciclina E promotor (cebador inverso): 5'CGGCGGCGGCGACGGCAGTGG3' .
promotor Cdc6 (cebador directo): 5'GGCCTCACAGCGACTCTAAGA3 '.
promotor Cdc6 (cebador inverso): 5'CTCGGACTCACCACAAGC3'
TS promotor (cebador directo).: 5'TGGCGCACGCTCTCTAGAGC3 '.
TS promotor (cebador inverso): 5'GACGGAGGCAGGCCAAGTG3'
El cdc25A, cebadores c-fos y condiciones de PCR se describen en [29]
análisis estadístico
Todos los datos se expresan como la media ± SEM y representan usando Graph Pad Prism 5. las diferencias entre el control y las muestras tratadas se analizaron mediante análisis de varianza (ANOVA), seguido por prueba de comparación múltiple de Dunnett . Las tasas de crecimiento tumoral en ratones atímicos se analizaron por ANOVA seguido de la prueba Neuman-Keuls. En los experimentos de inmunohistoquímica, todos los núcleos PCNA positivas se contaron en cinco campos independientes por dos observadores independientes de una manera doble ciego aleatorizado.