Extracto
Carnosina, un dipéptido de origen natural, ha sido recientemente demostrado poseer anti-tumoral actividad. Sin embargo, su mecanismo subyacente no está claro. En este estudio, se investigó el efecto y el mecanismo de la carnosina sobre la viabilidad celular y la proliferación del cáncer gástrico humano cultivaron células SGC-7901. tratamiento carnosina no indujo apoptosis de las células o necrosis, pero reduce la capacidad proliferativa de las células SGC-7901. El análisis mostró Seahorse SGC-7901 células cultivadas con piruvato tiene mitocondria activa, y dependen de la fosforilación oxidativa mitocondrial más de glicolisis vía para la generación de ATP. La carnosina disminuyó notablemente el valor absoluto de la respiración ATP ligado mitocondrial, y redujo el consumo de oxígeno máximo y la capacidad respiratoria de repuesto, que puede reducir la función mitocondrial correlacionado con potencial proliferativo. Al mismo tiempo, la carnosina también redujo la tasa de acidificación extracelular y células de la glucólisis SGC-7901. Nuestros resultados sugieren que la carnosina es posible regulador del metabolismo energético de las células SGC-7901, tanto en el anaeróbico y vías aerobias, y proporcionaron una pista para la evaluación preclínica y clínica de carnosina para la terapia del cáncer gástrico
Visto:. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) La carnosina inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico humano SGC-7901 a través de ambos de la respiración mitocondrial y de la glucólisis Caminos. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10.1371 /journal.pone.0104632
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 14 Febrero, 2014; Aceptado: July 15, 2014; Publicado: 12 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81102427), y en parte con el apoyo de las fundaciones de Zhejiang Provincial de investigación Científica (Y2110322), el Programa de Zhejiang Equipo Responsable de S & amp; T Innovación (2010R50048) y la ciudad de Wenzhou Ciencia y Proyecto de Tecnología (2010S0094 ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es una de las neoplasias más frecuentes en el mundo. En los países en vías de desarrollo económico, el cáncer gástrico es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer [1], [2]. A pesar de la mejora en el tratamiento quirúrgico y multimodal, la tasa de supervivencia global a los 5 años es aún baja (15% a 35%) debido a las altas tasas de recurrencia, invasión y metástasis [3]. Por lo tanto, en el presente, para descubrir fármacos más eficaces anti-tumorales con menos efectos secundarios que se necesita.
L-carnosina (β-alanil-L-histidina) es un dipéptido de origen natural que se sintetiza por la carnosina endógeno sintetasa. Se encuentra ampliamente distribuida en el cerebro de los mamíferos, el músculo esquelético, el estómago, los riñones, el corazón y la piel [4], [5]. Hasta el momento, no se sabe mucho acerca de su función fisiológica, sino varios papeles putativos han sido considerados, como neurotransmisor, agente anti-inflamatorio, eliminador de radicales libres, tampón de pH orgánico móvil y quelante de metales [6], [7]. Se ha informado de que la carnosina es un agente terapéutico potencial para el tratamiento de la enfermedad, accidente cerebrovascular, diabetes de Alzheimer, y otras enfermedades de los órganos de los sentidos [8], [9]. Recientemente, se ha demostrado que la carnosina puede tener también un efecto anti-tumorigénicos. Por ejemplo, la carnosina se ha informado que poseen la capacidad de inhibir el crecimiento de gliomas malignos [10], y este efecto puede estar mediado por una influencia sobre el metabolismo de la energía glicolítica, la mejor fenotipo metabólico caracterizado observado en las células tumorales, conocido como efecto Warburg [11 ], [12].
Recientemente, la importancia de las mitocondrias como sensores de oxígeno, así como productores de ATP se ha convertido en un punto focal de la investigación del cáncer, y los estudios han mostrado un fenómeno importante que el metabolismo mitocondrial, en particular el ácido cítrico la actividad del ciclo es importante para la rápida proliferación de múltiples tipos de células del cáncer [13], [14]. Sin embargo, en el caso de las células de cáncer gástrico humano, hay poca información disponible en qué medida la glucólisis y la fosforilación oxidativa mitocondrial (fosforilación oxidativa) contribuyen a la producción de energía celular y la proliferación rápida. Ya sea que la carnosina también puede inhibir el crecimiento de células de cáncer gástrico humano sigue siendo desconocido. Y si el efecto inhibidor de la carnosina sobre el crecimiento de las células tumorales también se relaciona con su acción sobre la respiración mitocondrial y la fosforilación oxidativa sigue siendo poco clara.
Recientemente, el Seahorse Bioscience XF96 extracelular Flux analizador se ha utilizado para controlar simultáneamente y continuamente tanto el componentes aeróbicos y glucolíticas de la bioenergética celular [15]. Por lo tanto, en el presente estudio, hemos explorado los efectos de la carnosina sobre el crecimiento de células de cáncer gástrico humano y para caracterizar mejor el perfil bioenergético de cultivaron células de cáncer de SGC-7901 gástrico humano y las funciones de carnosina en el metabolismo de las células de energía SGC-7901 con el Seahorse Bioscience XF96 extracelular Flux Analyzer y otras tecnologías relacionadas.
Materiales y Métodos
Reactivos
L-carnosina, piruvato de sodio, rotenona, carbonil cianuro de p-trifluorometoxifenil-hidrazona (FCCP), antimicina A, la 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-diphenyltetra-zolium bromuro (MTT), metanol, ácido láctico fueron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Penicilina, estreptomicina, L-glutamina, tripsina, medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero fetal bovino eran de GIBCO-BRL (Grand Island, NY, EE.UU.). Anexina V-FITC /PI kit de detección de apoptosis, BCA kit de ensayo de proteínas y ATP Kit de ensayo fueron comprados de Beyotime Instituto de Biotecnología ((Nanjing, China). XF medio de ensayo y solución de calibrado XF fueron comprados a Seahorse Bioscience.
cultivo de células
humano línea celular de cáncer gástrico SGC-7901 (SGC-7901), línea de hígado humano de células de carcinoma hepatocelular (HepG2) y la línea celular de glioma C6 de rata (C6) se adquirieron en el banco de células Shanghai Institute, Academia china de Ciencias (la fuente original es la American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). las células se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina G, y 100 g /ml de estreptomicina, y se mantuvo a 37 ° C y 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Las células se trataron con tripsina en una proporción de 1:03 después de confluencia usando 0,25% de tripsina. subcultivaron las células fueron sembradas en 96-, 24- o placas de 6 pocillos a densidades de 2 × 10
3, 5 × 10
4, 2 × 10
5 o 1 × 10
6 células /pocillo, respectivamente.
reducción de MTT ensayo
Cell actividad metabólica se controló mediante el ensayo colorimétrico MTT como se describe anteriormente [16]. Brevemente, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y se había 6 pozos en cada grupo. Al final de los experimentos, las células se incubaron con 0,5 mg /ml de MTT durante 4 horas a 37 ° C. A continuación, se retiró la capa sobrenadante, y se añadieron 100 l de sulfóxido de dimetilo en cada pocillo. metabolismo MTT se cuantificó espectrofotométricamente a 570 nm en un lector de microplacas Biorad. Los resultados se expresaron como el porcentaje de la reducción de MTT, teniendo la absorbancia de células de control como 100%.
Colonia ensayo de formación de
Las células se sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 100-200 células por pocillo, y después se trataron con la carnosina (20 mM). Los clones se dejaron crecer durante 14 días en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina G, y 100 mg /ml de estreptomicina. Las células se fijaron posteriormente con etanol al 70% y se tiñeron con azul brillante de Coomassie para el análisis de la formación de colonias como se describe anteriormente [17].
de citometría de flujo ensayo de muerte celular
La muerte celular se cuantificó por Anexina V-FITC-PI (yoduro de propidio) doble tinción, utilizando un kit de detección de apoptosis Anexina V-FITC de acuerdo con la sugerencia del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos en medio DMEM. Las células se trataron con carnosina 20 mM durante 48 h, y luego se recogieron y se lavaron dos veces en PBS helado, se resuspendieron en tampón de unión a una densidad de 1 x 10
6 células /ml. Las células se incubaron simultáneamente con marcado con fluoresceína anexina V y PI de 20 min y se analizaron por citometría de flujo. Anexina V-FITC genera señales se detectaron con un detector de señal de FITC (FL1, 525 nm). señales de PI fueron monitorizados usando un detector de emisión reservados para ficoeritrina (FL2, 575 nm). Los datos fueron analizados utilizando el software Cell Quest de BD.
extracelular Flux Tecnología
Para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de las células en diferentes condiciones, un caballito de mar XF96 se utilizó extracelular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, EE.UU.). Este instrumento permite la medición sensible de la glucólisis y múltiples parámetros de la función mitocondrial, incluyendo OCR basal, la capacidad respiratoria de repuesto, máxima OCR, ligado-ATP respiración y el protón de fugas a partir de células cultivadas intactas adherentes. Después de las mediciones iniciales, OCR y el CERA se midieron después de la adición secuencial a cada pocillo 20 l de oligomicina, FCCP y rotenona, para alcanzar concentraciones de trabajo de 1 g /ml, 1 M y 1 mM, respectivamente. Todos los ensayos se llevaron a cabo utilizando una densidad de siembra de 10.000 células /pocillo en 200 l de DMEM en una microplaca de cultivo celular XF96 (Seahorse Bioscience). Las células se cambiaron a DMEM sin búfer suplementado con piruvato de sodio 2 mM y 20 mM carnosina 1 h antes del comienzo del ensayo y se mantuvo a 37 ° C. OCR se informó en la unidad de picomoles por minuto y el CERA se reporta en unidades de mili-pH (mph) por minuto.
Determinación de la producción del ATP
Se realizó el ensayo de ATP de acuerdo con el fabricante instrucción. Brevemente, las células cultivadas recogidas se lisaron con un tampón de lisis, seguido de centrifugación a 10.000 xg durante 2 min, a 4 ° C. Por último, en placas de 6 pocillos, el nivel de ATP se determinó mediante la mezcla de 20 l del sobrenadante con 100 l de reactivo de luciferasa, que catalizó la producción de luz a partir de ATP y luciferina. La luminancia se midió mediante un lector de microplacas monocromador. Curva estándar también se generó y se determinó la concentración de proteína de cada grupo usando el kit de ensayo de proteína BCA. Los niveles totales de ATP se expresaron como proteínas nmol /mg.
análisis
HPLC de ácido láctico extracelular
La concentración de ácido láctico en el sobrenadante libre de células se midió por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC ) combinado con un detector ultravioleta utilizando la técnica como se describe anteriormente. En resumen, los analysates preparados se separaron en ECOSIL C-18 columna (3 m, 250 mm x 4,6 mm) inversa usando disolvente A y disolvente B [0,1 mol /l NH
4H
2 PO
4 ( pH 3,4) diluido v /v en metanol 97:3] con un caudal de 0,5 ml /min. La temperatura de la columna se mantuvo a 25 ° C, y la longitud de onda de detección de UV se fijó a 210 nm.
potencial de membrana mitocondrial evaluación
Los cambios en la membrana mitocondrial relativa potenciales (Δ
Ψ
m) se evaluó a través de la sonda lipofílica catiónica JC-1 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraetilo-benzamida yoduro de azolocarbocyanine (JC-1; Molecular Probes). El colorante JC-1 sufre un cambio reversible en la emisión de fluorescencia de verde a naranja verdoso como Δ
Psi
m aumenta. Las células con alta Δ
forma Ψ
m JC-1 agregados y la fluorescencia roja; aquellos con baja Δ
Ψ
m contienen monómeros JC-1 y emiten fluorescencia verde. Después del tratamiento con carnosina durante 48 h, el medio de cultivo se retiró y las células, cultivadas en cubreobjetos, se incubaron en la oscuridad con JC-1 a una concentración final de 2 M durante 20 min. Las células fueron lavadas dos veces con PBS y excitado a 488 nm con un microscopio de fluorescencia Olympus BX-51.
copias de ADNmt medida numérica
Absoluto ADNmt número de copias se midió mediante la comparación de la amplificación por PCR de un mitocondrias amplicón [, cadena de óxido-reductasa NADH-ubiquinona humana 4 (ND4)] con una amplificación nuclear (humana, β-actina) a partir de ADN aislado utilizando un kit Qiagen ADN mini. Primer secuencias son las siguientes: β-actina humana (adelante: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 '; inversa: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); ND4 humana (adelante: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; inversa: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). plantillas de ADN se hicieron de las regiones que abarcan cada uno de amplificación mediante amplificación por PCR. Las diluciones de 1 × 10
8 hacia abajo a 1 × 10
2 copias del ADN aislado se utilizaron para generar una curva estándar para la cuantificación. Las condiciones de los ciclos de PCR consistieron en una etapa de activación a 95 ° C durante 30 segundos, seguido de 40 ciclos de 5 segundos a 95 ° C y 30 seg a 58 ° C. Todas las PCR se realizaron en un administrador del sistema de Bio-Rad CFX Real-Time PCR (Applied Biosciences).
Análisis estadístico
Todos los datos representan tres o más experimentos independientes. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS 11.5 para Windows. ANOVA de una vía (análisis de varianza) seguido de LSD (diferencia menos significativa) o T3 de Dunnett
post-hoc
prueba (donde no se asumieron varianzas iguales) se aplicó para comparaciones múltiples, mientras que la prueba t de Student fue utilizado para las comparaciones entre dos grupos.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Efecto de la carnosina sobre SGC-7901 células viabilidad
Para determinar el efecto de la carnosina sobre. Las células del cáncer SGC-7901 gástrico humano viabilidad, se usó un ensayo de reducción de MTT. Los resultados mostraron que el tratamiento carnosina reduce significativamente la viabilidad celular de una manera tiempo y dependiente de la concentración. La carnosina a concentraciones de 5 y 20 mM redujo notablemente la viabilidad celular a 84,0% y 57,9% de control a las 24 h, y a 73,5% y 45,9% del control a las 48 h, respectivamente (Fig. 1A). Sin embargo, la carnosina a una concentración de 1 mM no afectó SGC-7901 células viabilidad a 24 o 48 h. Además, utiliza citometría de flujo para analizar si la carnosina podría causar necrosis celular SGC-7901 o apoptosis. Sorprendentemente, los resultados mostraron que el tratamiento carnosina durante 48 h no indujo la muerte celular necrótica o apoptótica en SGC-7901 células (Fig. 1B). Debido a la reducción de MTT también se interpreta como indicativa de la actividad metabólica celular, y el valor de MTT de una población celular se determina por tanto el número de células viables presentes y sus tasas metabólicas relativas, de forma que junto a calcular el número de células en un experimento paralelo con células SGC-7901 tratadas de forma idéntica utilizando la placa de recuento celular. Se encontró que el número de células en la carnosina tratado por 48 grupo h fue similar a la del grupo control (Fig. 1C), lo que indica que la viabilidad celular reducida inducida por el tratamiento carnosina durante 48 h en células SGC-7901 se debe a los cambios metabólicos pero no se debe a la muerte celular o la proliferación celular.
las células (a) se pre-trataron con diferentes concentraciones de carnosina durante 24 o 48 h, y luego la viabilidad celular se ensayó usando el ensayo de reducción de MTT. Los resultados se expresan como porcentaje de control, y se mostraron media ± desviación estándar. n = 10-12.
P ** Hotel & lt; 0,01 frente a control en el grupo 24 h;
##
P Hotel & lt; 0,01 frente a control en el grupo 48 h. (B) Las células se trataron con carnosina 20 mM durante 48 h, y luego la muerte celular se determinó por PI y la anexina V-FITC tinción seguido por citometría de flujo. las células (C) SGC-7901 fueron tratados con carnosina 20 mM y el número total de células se calculó después del tratamiento carnosina para 2, 3, 4, 5, 6 días utilizando la placa de recuento de células. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. n = 6.
** P
. & lt; 0,01 frente a control
Para comprobar si también existen estas acciones de carnosina en otras células cancerosas, se utilizaron células HepG2 y C6. Los resultados mostraron que 20 mM tratamiento carnosina durante 48 h no indujo la muerte celular (Tabla. S1) o la proliferación, pero marcadamente reducida actividad reductora MTT tanto en células HepG2 y C6 (Fig. S1).
tratamiento coriónicas con carnosina inhibe SGC-7901 la formación de colonias de células
para examinar si la exposición a coriónicas carnosina podría afectar a la capacidad proliferativa de las células SGC-7901, las células se sembraron a una densidad baja (100-200 células /pocillo) y permitido para formar colonias durante 14 días en DMEM suplementado con 20 mM carnosina. Como se muestra en la Fig. 2, la exposición coriónicas a la formación de colonias de carnosina reducida al 39,9% de control.
(A) Imágenes representativas de los pozos de clonación. Las células se sembraron a baja densidad en el suplemento DMEM con o sin la carnosina (20 mM) durante 14 días. Las colonias se fijaron posteriormente con etanol al 70% y se tiñeron con azul brillante de Coomassie para el análisis de formación de colonias. (B) análisis de imagen cuantitativo de colonias en células SGC7901 cultivadas. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. n = 6.
** P
. & lt; 0,01 frente al grupo de control
caracterización bioenergético de las células cultivadas SGC-7901
Hemos investigado el OCR y el CERA en células cultivadas SGC-7901 utilizando un analizador de flujo extracelular Seahorse XF-96, tal como se describe anteriormente [18]. OCR celular Basal y ECAR se encontró que eran 161,02 ± 29,58 pmol /min por 10 × 10
3 células (recuento de células inicial), y 39,31 ± 4,29 mph /min por 10 × 10
3 células, respectivamente (Fig. 3A). El vinculada respiración-ATP (la tasa basal total menos la tasa con oligomicina, donde oligomicina es un inhibidor de la síntesis de ATP) fue de 96,15 ± 18,34 pmol /min por cada 10 × 10
3 células, lo que indica que ~ 60% de oxígeno celular el consumo se relaciona con la síntesis de ATP. Simultáneamente ECAR se aumentó a ~ 250% de tasas de referencia en presencia de dosis máximamente efectiva de oligomicina (1 mg /ml), lo que indica que las células cambiaron la respiración mitocondrial a la glucólisis. Rotenona (1 M) redujo OCR a 55,78 ± 8,86 pmol /min por 10 × 10
3 células (~ 35% de las tasas de referencia). La tasa de rotenona resistente refleja la tasa de respiración no mitocondrial, que incluye la oxidación de sustratos y el consumo de oxígeno de la superficie celular [19]. Por lo tanto, la respiración mitocondrial no representó ~ 35%, mientras que la respiración mitocondrial representó el ~ 65% del total de la respiración celular. Por lo tanto, en las células SGC-7901 cultivadas ~92% (60% /65%) de la respiración mitocondrial se acopló a la síntesis de ATP, y ~ 8% de la respiración mitocondrial se explica por fuga de protones (Fig. 3B). En presencia de dosis máximamente efectiva de FCCP (1 M, un agente de desacoplamiento que permite el transporte de electrones máxima,), se observó un aumento concomitante de OCR, y se aumentó a 204 ± 30,24 pmol /min por 10 × 10
3 células.
(A) análisis en tiempo real de las tasas de consumo de oxígeno (OCR) y las tasas de acidificación extracelular (ECAR) de las células cultivadas SGC-7901 perturbando con pequeñas moduladores del metabolismo de moléculas. Oligomicina (O; 1 g /ml), carbonilo cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP; F; 1 M), oxamato (Ox; 100 mM), y la rotenona (R; 1 M) se inyectaron secuencialmente en los puntos de tiempo indicados en cada pocillo que contiene células SGC-7901 después de la medición de la frecuencia de línea de base. Cada dato representa la media ± SD. n = 17. (B) Análisis de imagen cuantitativo de OCR en células cultivadas SGC-7901. Basal, tasa endógena; Oligomicina, ATP-sintasa-inhibido tasa; FCCP, la tasa de desacoplado máxima; y rotenona, la tasa de rotenona inhibe. (C) Basal ECAR y el protón tasa de producción a partir de mediciones tomadas en conjunto con las tasas de respiración. (D) la tasa de producción de ATP a partir de la fosforilación oxidativa y la glucólisis.
También se evaluó la contribución relativa de la glucólisis y la fosforilación oxidativa en la tasa de producción de ATP en las células SGC-7901. cuantificaciones absolutos tanto de la tasa glucolítica y la tasa de consumo de oxígeno sensible a la oligomicina se midieron en células SGC-7901. La tasa de acidificación extracelular se debe principalmente a la producción de lactato y bicarbonato y, cuando se calibra como la tasa de producción de protones, indica tasa glicolítica [15]. Por lo tanto, hemos utilizado oxamato para inhibir la lactato deshidrogenasa, que convierte el piruvato en lactato durante el último paso de la glucólisis, para calcular la tasa de producción de protones (Fig. 3C). Hay una relación de uno a uno entre la tasa de producción de lactato y la tasa de producción de ATP a partir de la glucólisis. El consumo de oxígeno sensible a la oligomicina se convirtió en la tasa de producción de ATP usando una relación P /O de 2,3 [20]. Los resultados mostraron que las células SGC-7901 cultivadas en DMEM (glucosa alta) suplementado con piruvato 2 mM hecho al menos 93% de su ATP usando la fosforilación oxidativa (Fig. 3D).
carnosina cambió la caracterización bioenergético de SGC- 7901 células
Se investigaron los efectos de la carnosina sobre la tasa de consumo de oxígeno y la velocidad de acidificación extracelular en células cultivadas SGC-7901. Los resultados en la Fig. 4 mostró que el tratamiento con carnosina 20 mM durante 48 h redujo el OCR basal y ECAR a 141,13 ± 27,06 pmol /min por 10 × 10
3 células (~87% de control), y 11,32 ± 2,49 mph /min por 10 × 10
3 células (~27% del control), respectivamente (Fig. 4A, B). El vinculada respiración-ATP, fugas de protones, y la tasa de respiración no mitocondrial fueron 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6 y 52,96 ± 8,40 pmol /min por 10 × 10
3 células, respectivamente (Fig. 4C, D, E ). Así, en la carnosina células tratadas SGC-7901, la respiración mitocondrial representó ~62% de la respiración celular total y ~92% (57% /62%) de la respiración mitocondrial fue acoplado a la síntesis de ATP, y ~ 8% de la respiración mitocondrial fue explicado por la fuga de protones. Por lo tanto, el tratamiento carnosina disminuyó el valor absoluto de la respiración ligada al ATP, pero no influyó en la tasa de contribución relativa de los vinculada respiración-ATP, fugas de protones, y la respiración mitocondrial no a la respiración celular total. Por otra parte, también se encontró que el tratamiento carnosina reduce notablemente la máxima capacidad respiratoria OCR y repuesto a 161,60 ± 28,46 pmol /min por 10 × 10
3 celdas (~79% del control) y 20,47 ± 6,92 pmol /min por 10 × 10
3 células (~47% del control) (Fig. 4F, G).
Las células se sembraron en microplacas especializado y se cultivaron con o sin la carnosina (20 mM) durante 48 h. Las células fueron entonces cambiados a DMEM sin búfer suplementado con piruvato de sodio 2 mM y 20 mM carnosina, y la función mitocondrial se evaluó mediante la inyección secuencial de oligomicina, FCCP, y rotenona. (A) Basal OCR, (B) Basal ECAR, (C) ATP ligado a OCR, (D) de fugas de protones, (E) no mitocondrial OCR (no Mito), (F) máxima de OCR, y (G) de repuesto se muestra la capacidad. Los resultados son las medias ± SD. n = 6-9.
P * Hotel & lt; 0,05;
P ** Hotel & lt; 0,01 frente al grupo de control
También se utilizaron células HepG2 y C6 para verificar aún más los efectos de la carnosina sobre el metabolismo de las células de cáncer de energía.. Los resultados mostraron que 20 mM tratamiento carnosina durante 48 h reduce notablemente el OCR basal y ECAR de las células HepG2 y C6, respectivamente. Además carnosina también redujo vinculada respiración-ATP en células C6, pero no en las células HepG2 (Fig. S2). Sin embargo, la carnosina 20 mM redujo notablemente el contenido de ATP celular tanto en células HepG2 y C6, lo que indica que la inhibición de la glicólisis estaba involucrado en la acción carnosina, al menos en las células HepG2 (Fig. S2J).
carnosina disminuyó de ácido láctico extracelular nivel en cultivos de células SGC-7901
Debido a que la carnosina es un tampón de pH orgánico móvil, la tasa de acidificación extracelular está probado en el presente de la carnosina mediante el Seahorse XF96 extracelular Flux analizador no puede reflejar la tasa de glucólisis real. Así que también se utiliza HPLC para ensayar el nivel de ácido láctico extracelular para verificar el efecto de la carnosina sobre la glucólisis en las células SGC-7901. Nuestros resultados demostraron que el tratamiento carnosina reduce notablemente el nivel de ácido láctico extracelular a 84% del control (Fig. 5), lo que indica que la carnosina tiene un potencial efecto inhibidor de la glucólisis en las células SGC-7901 cultivadas.
Las células se cultivaron durante 48 h en DMEM con o sin la carnosina (20 mM). Se recogió el sobrenadante para el análisis HPLC de ácido lactato. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. n = 6.
** P
. & lt; 0,01 frente al grupo de control
carnosina modificar el aporte relativo de la glucólisis y la fosforilación oxidativa a cargo de ATP en las células SGC-7901 cultivaron en DMEM falta de piruvato
también caracteriza el efecto de la carnosina sobre los cambios en el contenido de ATP y la contribución relativa de la glicolisis y la fosforilación oxidativa a cargo ATP en las células SGC-7901 cultivadas en DMEM falta de piruvato. Se midió la concentración celular de ATP en las células expuestas durante 45 minutos a seis condiciones: vehículo, el inhibidor de la glucólisis 2-DG, FCCP, rotenona, FCCP, más rotenona, y 2-DG además FCCP más rotenona. Se encontró que el tratamiento carnosina durante 48 h redujo significativamente el contenido de ATP a 62% del control. tratamiento 2-DG reduce notablemente el contenido de ATP por 48% y 34% en los grupos ausentes y carnosina presentes de carnosina en comparación con sus propios grupos de vehículos, respectivamente. FCCP y FCCP más rotenona cada uno también redujo significativamente el contenido de ATP en un 15% y un 18% en el grupo de carnosina ausente. Sin embargo, estos fármacos no afectaron el contenido de ATP en el actual grupo de carnosina. Rotenona no afectó el contenido de ATP tanto en grupos ausentes o presentes de carnosina. 2-DG en combinación con FCCP y rotenona elimina esencialmente la producción de ATP tanto en estos dos grupos (Fig. 6). De este modo 2-DG disminuyó ATP cobra más hizo en carnosina grupos ausentes y presentes FCCP o rotenona. Estos datos indican que los cambios de generación de ATP a partir de la fosforilación oxidativa a la glucólisis cuando se altera la función mitocondrial. cargo ATP no se mantiene plenamente después de la inhibición de la glucólisis o la función mitocondrial en la carnosina grupo ausente, mientras que la carga de ATP se mantiene después de la inhibición de la función mitocondrial en el actual grupo de carnosina. Así, el tratamiento carnosina altera la contribución relativa de la fosforilación oxidativa y la glucólisis en la tasa de producción de ATP en las células SGC-7901.
nivel intracelular de ATP se midió en respuesta a la glucólisis inhibidor de 2-desoxiglucosa (2-DG, 100 mM), mitocondrial desacoplador FCCP (1 M), y complejo de I inhibidor tratamiento rotenona (1 M) durante 45 min, de forma individual o en combinación como se muestra, en las células SGC7901 cultivadas con o sin carnosina tratamiento (20 mM) durante 48 h. nivel de ATP se expresó como% del control, que se define como el valor de línea de base en las células expuestas sólo para vehículo. Cada dato representa la media ± SD. n = 6.
P ** Hotel & lt; 0,01 frente al vehículo en el grupo de carnosina ausente,
## P Hotel & lt; 0,01 frente al vehículo en el grupo de carnosina ausente,
& amp; P Hotel & lt; 0,05,
& amp; & amp; P
. & lt; 0,01 frente al vehículo en el actual grupo de carnosina
Efecto de piruvato en la acción inhibitoria de la carnosina sobre células SGC-7901 función mitocondrial
para investigar si el aumento del nivel de piruvato puede revertir el efecto inhibidor de la carnosina sobre la respiración mitocondrial de las células SGC-7901, las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de piruvato. Como se muestra en la Tabla. 1, aumentando el nivel de piruvato no pudo revertir el efecto inhibidor de la carnosina sobre células SGC-7901 la respiración mitocondrial. Además, el ensayo de MTT también mostró que el aumento del nivel de piruvato no pudo invertir la acción sobre las células carnosina SGC-7901 metabolismo mitocondrial (Fig. 7).
Cambios
(A) en JC-1 de fluorescencia con carnosina el tratamiento de las células SGC-7901 cultivadas. Las células fueron tratadas con la carnosina (20 mM) durante 48 h, y luego se tiñeron con JC-1. fluorescencia de color rojo indica un estado polarizada y fluorescencia verde indica un estado despolarizado. Barra de escala: 20 micras. (B) el número de copias de ADNmt en las células SGC-7901 tratados con o sin carnosina.
Efectos de la carnosina sobre el contenido de ADN mitocondrial y el potencial de membrana mitocondrial en las células SGC-7901
potencial de membrana mitocondrial (Δ
Ψ
m) representa la mayor parte de la fuerza protón-motriz utilizada para conducir la síntesis de ATP y por lo tanto tiene un papel significativo en la capacidad de generación de ATP máxima [21]. Por lo tanto, también se utiliza la sonda lipofílica catiónica JC-1 explorar si la carnosina suprime la fosforilación oxidativa través de la supresión del potencial de membrana mitocondrial (Δ
Ψ
m). Los resultados mostraron que el tratamiento carnosina durante 48 h no podría inducir un cambio obvio de Δ
Ψ
m en células SGC-7901 cultivadas (Fig. 8A).
células SGC-7901 se cultivaron en DMEM suplementado con dosis crecientes de piruvato (2, 4, 6 mM) en presencia o ausencia de la carnosina (20 mM) durante 48 h, y luego la actividad de metabolismo mitocondrial células se midió por ensayo de reducción de MTT. Los resultados son la media ± SD. n = 8-16.
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. & Lt; 0,01 frente al grupo de control
Para hacer frente a la aparente disminución de la respiración mitocondrial inducida por la carnosina, también cuantificó el ADN mitocondrial absoluta (ADNmt) número, que está estrechamente regulada para el mantenimiento de los requisitos de energía celular [22]. Para nuestra sorpresa, los resultados revelaron que, en comparación con las células de control, los ADNmt absolutos el número de copias de las células 7901 carnosina tratados se incrementaron notablemente, y los ADNmt promedio absolutos número de copias fueron 141,49 ± 7,42 en las células control y 360.0 ± 59.84 en el carnosina células tratadas (Fig. 8B).
Discusión
Para nuestro conocimiento, este es el primer informe del perfil bioenergético de células SGC-7901 en cultivo tratados con y sin carnosina. Nuestras principales conclusiones son las siguientes. En primer lugar, la carnosina reduce la capacidad proliferativa de las células SGC-7901. En segundo lugar, las células cultivadas en DMEM (glucosa alta) suplementado con 2 mM de piruvato hicieron ~93% de su ATP utilizando la fosforilación oxidativa. En tercer lugar, la carnosina ejercía su efecto inhibidor sobre las células SGC-7901 proliferación a través de la inhibición de la glicólisis, de la fosforilación oxidativa y la respiración mitocondrial de las células, y también se encontró que estas acciones de carnosina en células HepG2 y C6. Por lo tanto, la carnosina se debe considerar junto con la creciente armamento de compuestos en diversas etapas de desarrollo de fármacos que se dirigen a metabolismo del tumor, una de las características clave de tumor [23].
Debido a su amplio espectro de actividad, la carnosina puede ser considerded como un factor terapéutico en el tratamiento de muchas enfermedades. Por ejemplo, Zinc carnosina se ha utilizado para la salud gástrica y para la reparación intestinal [24]. células Recientemente, los estudios mostraron transformaron no crecieron en MEM que contiene altas concentraciones de carnosina, y carnosina podrían administrarse como un fármaco in vivo para inhibir el crecimiento de las células malignas [25]. Sin embargo, tuvo que ser preguntado si la carnosina se puede prevenir el crecimiento de células tumorales gástricas humanas además de las células malignas que han sido reportados previamente.