Extracto
La obesidad confiere un mayor riesgo de desarrollar formas específicas de cáncer. Aunque los mecanismos no son claros, aumento de la secreción de células de grasa de proteínas específicas (adipoquinas) puede promover /facilitar el desarrollo de los tumores malignos de la obesidad a través de la diafonía entre el tejido (s) adiposo y los tejidos propensos a desarrollar cáncer entre los obesos. Se realizaron búsquedas de nuevas adipoquinas que se sobreexpresa en el tejido adiposo de los sujetos obesos, así como en células tumorales derivadas de cánceres asociados comúnmente con la obesidad. Para este propósito la expresión de datos a partir de tejido adiposo humano de células y tejidos primarios obesos y no obesos, así como de un gran panel de líneas celulares de cáncer humano y los correspondientes fueron exploradas. Encontramos expresión de ceruloplasmina a ser el más enriquecida en células cancerosas asociadas con la obesidad. Este gen también fue significativamente hasta reguladas en el tejido adiposo de los sujetos obesos. La ceruloplasmina es portador de cobre principal del cuerpo y está implicado en la angiogénesis. Se demuestra que la ceruloplasmina es una novela adipokine, que es producida y secretada en el aumento de las tasas en la obesidad. En el estado de obesidad, tejido adiposo contribuyó notablemente (hasta 22%) para la circulación nivel total de proteínas. En resumen, tenemos mediante el cribado identificado ceruloplasmina bioinformático como una novela adipokine con aumento de la expresión en el tejido adiposo de los sujetos obesos, así como en las células de cáncer asociadas con la obesidad. Si existe una relación causal entre la sobreexpresión adiposo del desarrollo ceruloplasmina y el cáncer de la obesidad no puede ser respondida por estas comparaciones transversales
Visto:. Arner E, Forrest ARR, Ehrlund A, Mejhert N, M Itoh, Kawaji H, et al. (2014) La ceruloplasmina es una novela adipokine que se sobreexpresa en el tejido adiposo de sujetos obesos y en células de cáncer asociadas con la obesidad. PLoS ONE 9 (3): e80274. doi: 10.1371 /journal.pone.0080274
Editor: Qiong Wu, Instituto de Tecnología de Harbin, China
Recibido: July 9, 2013; Aceptado: 11 Octubre 2013; Publicado: 27 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Arner et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. FANTOM5 era posible gracias a una beca de investigación para el Centro RIKEN ómicas Ciencia de MEXT a Yoshihide Hayashizaki y una subvención del Programa de Investigación de Biología celular innovador mediante una tecnología innovadora (Programa de Innovación de la célula) de MEXT, Japón, para Yoshihide Hayashizaki. Este estudio también fue apoyada por las subvenciones del Consejo Sueco de Investigación y la Fundación de Cáncer de Suecia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Hay un aumento mundial de la prevalencia de la obesidad y la obesidad y sus comorbilidades se han convertido en un problema de salud importante en la mayoría de los países [1]. cáncer de la obesidad asociada recientemente ha ganado mucha atención. El Fondo Mundial para la Investigación del Cáncer concluyó en 2007 que la obesidad se asocia de forma convincente con un mayor riesgo de páncreas, de mama (posmenopáusico), endometrio y cáncer renal [2]. Estas conclusiones se confirmaron y ampliaron en un reciente meta-análisis de estudios prospectivos que evalúen los riesgos de cáncer asociados con ≥ 5 kg /m posteriormente
2 aumentos en el índice de masa corporal (IMC) [3]. Se observó que el riesgo más fuerte (odds ratio ≥1.30) para el cáncer renal y el adenocarcinoma esofágico en ambos sexos, para el cáncer de tiroides en los hombres y para el cáncer de endometrio y vesícula biliar en las mujeres.
Los mecanismos que vinculan la obesidad con el cáncer son poco entendidas aunque varias teorías se han propuesto [4], [5], [6], [7], [8]. Dado que el tejido adiposo constituye el órgano más grande endocrino del cuerpo, la secreción de cientos de señales de péptidos denominan colectivamente adipoquinas, y que la secreción adipokine se altera significativamente en la obesidad, una hipótesis atractiva es que las señales derivadas de tejido adiposo a otros tejidos podrían estar involucrados en el desarrollo del cáncer. Los dos adipoquinas estudiados más a fondo, la adiponectina y la leptina, de hecho, han sido relacionados con el desarrollo de tumores malignos a través de su acción sobre receptores afines que afectan a la sensibilidad a la insulina y /o la activación de la señalización asociada al cáncer [4]. Además, varios adipoquinas son factores de crecimiento que podrían servir como señales directas a los tumores [9]. Por lo tanto, estos, así como otras adipoquinas, no todavía descubiertos, pueden tener cáncer de promoción de propiedades.
En este estudio, encaminado a la búsqueda de nuevos adipoquinas humanos que pueden estar asociados con el cáncer asociadas con la obesidad. Con este fin, se extrajeron los datos de la novela FANTOM5 atlas de expresión, lo que proporciona una cobertura sin precedentes de los tejidos humanos, células primarias y líneas celulares de cáncer [10]. Nos centramos en las líneas celulares de cáncer derivadas de tumores malignos tienen la más fuerte asociación con la obesidad (odds ratio ≥1.3 en uno u otro sexo) de acuerdo con Renehan et al [3]. Putativo nuevos adipoquinas de potencial relevancia para el cáncer asociado con la obesidad se identificaron mediante la comparación del transcriptoma enriquecido tanto en las células de cáncer y tejido adiposo obeso. Esto se hizo mediante la combinación de los datos de expresión atlas FANTOM5 con un estudio recientemente publicado de la expresión génica en el tejido adiposo de una gran cohorte de mujeres obesas y no obesas [11].
Este trabajo forma parte del proyecto FANTOM5 . descargas de datos, herramientas genómicas y manuscritos co-publicada se resumen aquí http://fantom.gsc.riken.jp/5/.
Métodos
Sujetos y tejido adiposo
Todos los sujetos fueron informados en detalle sobre el estudio y se obtuvo el consentimiento informado por escrito. Los estudios fueron aprobados por el Comité de Ética en el Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia. Tres cohortes diferentes de los sujetos fueron utilizados en el estudio. En la primera cohorte, se describe anteriormente [11], se obtuvo tejido adiposo subcutáneo de 26 no obesos y 30 mujeres obesas. La obesidad se define como un IMC de 30 kg /m
2 o superior. Se extrajo el ARN y se sometió a los microarrays expresión global como se describe [11]. Los datos de expresión génica se han depositado en el Centro Nacional de Biotecnología Expresión Génica Omnibus (número de acceso GSE25402). El número de protocolo del Comité de Ética es 592/03 (aprobado 1
er de diciembre de 2003).
En la segunda cohorte, el tejido adiposo subcutáneo fue obtenida por liposucción cosmética y se utiliza para identificar experimentalmente nuevos adipoquinas . Se investigaron nueve mujeres. Todos eran obesos y no saludables de acuerdo a la auto-informe. Los valores (media ± DE) para la edad y el IMC fueron 45 ± 13 años y 27,4 ± 1,2 kg /m
2. El tejido se sometió a digestión con colagenasa y la porción de estroma vascular se diferenció en adipocitos en cultivo como se describe [11]. Para la determinación de proteína en medio condicionado, se retiraron alícuotas de 4, 8 y 12 días después del inicio de la diferenciación. El número de protocolo del Comité de Ética es 2009/1881/31/1 (aprobado 14
de enero de 2010).
En la tercera cohorte, se determinaron la secreción de tejido adiposo de las proteínas y sus niveles plasmáticos . Veinte obesos (edad 46 ± 6 años, media ± DE) y 19 mujeres saludables no obesos (edad 47 ± 9 años) fueron investigados por la mañana después de un ayuno nocturno. La obesidad se programaron para la cirugía bariátrica. Siete eran sanos, 10 tenían hipertensión y tres tenían diabetes tipo 2 tratados con antidiabéticos orales. La grasa corporal total fue determinada por absorciometría de rayos X de energía dual (62 ± 10 kg en obesos y 24 ± 8 kg en los no obesos). A partir de entonces, se obtuvo una muestra de plasma venosa para la determinación de los niveles circulantes de proteínas. Finalmente, el tejido adiposo se obtuvo una biopsia abdominal subcutánea como se describe [11], [12]. Parte de la muestra de tejido adiposo se sometió a
in vitro
de incubación de 2 h y medio acondicionado se utilizó para la determinación de la proteína como se describe [12]. La otra parte se sometió a la colagenasa se obtuvieron las células de tratamiento y grasas aisladas para la determinación del tamaño de las células de grasa y el volumen como se describe [13]. la secreción de proteínas se relaciona con el número de células de grasa en la muestra de tejido se incuban y a la cantidad total de grasa corporal. En este último caso, la secreción de proteína se relaciona con la cantidad de lípidos en el tejido se incubó y este valor se multiplicó por el peso total de grasa corporal como se describe [12]. El número de protocolo del Comité de Ética es 2005 /1441-1432 (aprobado 1
er de febrero de 2006).
medidas Proteína
La ceruloplasmina y la osteopontina se midieron mediante kits ELISA comerciales ( . Abcam, Cambridge, Reino Unido)
adiposo contribución a la producción total de ceruloplasmina
con el fin de estimar la contribución de ceruloplasmina derivadas de tejido adiposo a la circulación, se hicieron los siguientes supuestos: (a) la secreción de ceruloplasmina incuba tejido adiposo
in vitro
es similar en diferentes regiones de tejido adiposo y refleja
in vivo
secreción. (B) la ceruloplasmina se distribuye de manera uniforme en el espacio de agua que es 0,530 l /kg de peso corporal en los no obesos y 0,465 l /kg de peso corporal en los sujetos obesos [14]. (C) el nivel plasmático de ceruloplasmina en la mañana refleja los niveles generales de 24 horas y la vida media de la proteína es de 5,5 días [15]. Partiendo de estas premisas, la producción total de ceruloplasmina por hora se calcula como: (nivel plasmático medido x 5,5 x el agua corporal total) dividida por 24. secreción adiposo total por hora se mide como la secreción de lípidos por peso de tejido adiposo por hora tiempos de grasa corporal total . A partir de estos valores, el porcentaje de contribución a la producción de tejido adiposo ceruloplasmina se puede calcular.
muestras y control del cáncer
Sobre la base de Renehan et al [3], se identificaron las siguientes líneas celulares de cáncer en el FANTOM 5 conjunto de datos como se derivan de los tipos de tumores asociados a la obesidad y tienen una relación de probabilidades ≥1.30 en hombres, mujeres o ambos. Útero: línea celular de sarcoma del estroma endometrial (9-MAC), línea celular de carcinoma de endometrio (2-MAC), línea celular de adenocarcinoma endometrioide (1-JHUEM), clara línea celular de carcinoma de células (RTE); Riñón: línea celular de carcinoma de células renales (OS-2-RC), la línea celular de carcinoma de células renales (TUHR10TKB); Vesícula biliar: la vesícula línea celular de carcinoma de vejiga (TGBC2TKB), la línea celular de carcinoma de la vesícula biliar (TGBC14TKB); Tiroides: línea celular de carcinoma (TCO-1), tiroides línea celular de carcinoma (KHM-5 M), la línea celular de adenocarcinoma papilar (8505C). Como muestras de control se utilizó el siguiente tejido y muestras de células primarias. Útero: adultos y tejido fetal; Riñón: adultos y tejido fetal, las células corticales renales epiteliales (dos donantes), células epiteliales renales (tres donantes), las células renales glomerulares endoteliales (tres donantes), células mesangiales renales (tres donantes), renal proximal tubular de células epiteliales (tres donantes) ; Vesícula biliar: tejido adulto; Tiroides:. Adultos y tejido fetal
Identificación de nuevos candidatos adipokine relacionados con el cáncer
La expresión génica en la base de datos FANTOM5 se calculó como la cuenta de etiquetas (tags normalizado por millón, TPM) en un 1 ventana kb en torno RefSeq [16] sitios de inicio de la transcripción. Los genes fueron identificados como candidatos si se expresa a un nivel funcionalmente significativo (aquí definida como 10 TPM o superior) y enriquecidos al menos de dos veces en las líneas celulares de cáncer enumerados anteriormente en comparación con todas las líneas celulares disponibles en FANTOM5, no siendo enriquecido entre los tejidos correspondientes o células primarias. El enriquecimiento se calculó como se describe en [17] con p-valores corregidos para múltiples pruebas utilizando el método de Benjamini-Hochberg [18]. Los genes candidatos fueron retenidos si fueran significativamente hasta reguladas en el 5% FDR en el tejido adiposo de los sujetos obesos de acuerdo con un estudio previo [11]. Utilizando la base de datos de expresión FANTOM5, se requieren al menos 10 TPM CAGE expresión génica a través de un locus del receptor en una o más líneas celulares de cáncer asociado con la obesidad con el fin de retenerlo para una mayor investigación.
El análisis estadístico
Los valores son la media ± error estándar. Ellos se compararon mediante análisis de varianza (medidas repetidas), la prueba t no pareada y el análisis de regresión lineal.
Resultados
El análisis inicial de la base de datos FANTOM 5 [10] y el tejido adiposo publicada array [11] identificaron 700 genes que se expresaron de manera significativa (≥10 TPM) y al menos dos veces enriquecido en una línea celular de cáncer de interés pero no se enriquece en las células de los tejidos o primarias correspondientes, y hasta regulado en el tejido adiposo de obeso. No fue posible realizar un análisis detallado de todos los genes identificados o para determinar cuál de ellos que fueron realmente secretada por las células de grasa. Por lo tanto, reducir aun más la lista mediante la restricción de la expresión en la línea celular de cáncer relevante para ≥100 TPM (un alto nivel de expresión), el enriquecimiento de al menos cinco veces en la línea celular de cáncer en comparación con el correspondiente tejido sano /célula, y al menos dos -fold sobre regulación en el tejido adiposo en la obesidad. Sólo dos genes cumplen estos criterios más estrictos, a saber, la ceruloplasmina (Geneid:
CP
) y osteopontina (Geneid:
SPP1
). Sorprendentemente, los dos proteínas presentes en la circulación codificado y por lo tanto se consideraron adipoquinas potenciales. Hemos investigado si la ceruloplasmina y la osteopontina se secretan de forma activa a partir de células de grasa mediante la determinación de si hubo una liberación dependiente del tiempo en los medios de comunicación. Mientras que la osteopontina no era detectable en el medio de incubación (el gráfico no se muestra), ceruloplasmina fue de hecho liberado de una manera dependiente del tiempo en la diferenciación de adipocitos (Fig. 1a). Por lo tanto, a pesar de ARNm de osteopontina se expresa en el tejido adiposo de acuerdo con microarrays y está regulada positivamente en la obesidad [11], no aparece la proteína codificada para ser secretada por las células de grasa lo que implica que la osteopontina no es una adipocina. La influencia de la obesidad en los niveles de plasma y secreción de ceruloplasmina a partir de tejido adiposo subcutáneo También se investigó (Fig 1b-d). Los niveles en plasma y secreción adiposo se incrementaron significativamente en las muestras de los sujetos obesos. Hubo una fuerte relación positiva entre circulante y ceruloplasmina adiposo-secretada. De hecho, este último explicó 45% de la variación interindividual en la ceruloplasmina plasmática (r ajustada
2), que es independiente del IMC (r parcial = 0,36; p = 0,026) o la grasa corporal (r parcial = 0,44; p = 0,007). Se determinó la contribución del tejido adiposo a la producción total ceruloplasmina como se describe en Métodos y se estimó en 13 ± 5% en los no obesos y 22 ± 6% en los obesos (p & lt; 0,0001).
A. La secreción durante la diferenciación de las células progenitoras de células de grasa. Los datos se analizaron mediante ANOVA, medidas repetidas. Influencia B y C. de la obesidad en los niveles en plasma y la secreción a partir de tejido adiposo como se analiza con la prueba t no pareada. D. Relación entre la ceruloplasmina secretada y sus niveles plasmáticos como analizados mediante regresión lineal.
Además, investigó el patrón de expresión de
CP Hoteles en células cancerosas humanas. La figura 2 muestra la localización genómica de
CP
(figura 2a, b), la distribución de la actividad del promotor medida por la expresión de genes análisis tapa (CAGE, la figura 2c) y
CP
expresión a través de una amplio panel de tipos celulares de cáncer según nivel de expresión (figura 2d). Cabe destacar que la línea celular de cáncer con la más alta expresión de
CP
es un carcinoma de células claras de endometrio (2d figura, la flecha sólida superior). Otros tipos de cáncer asociadas con la obesidad (renales, endometriales) también muestran relativamente alto
CP
expresión (flechas figura 2D, sólido). cáncer hepático no se incluyó en este estudio debido a que no cumplía con nuestro criterio de la obesidad /cáncer de probabilidades de asociación proporción de 1,30 o más; sin embargo, es interesante observar que se asocia con la obesidad en los hombres cuando se utiliza un poco menos estricta criterios (odds ratio = 1,24 en la referencia [3]) y que las líneas celulares de cáncer de varios hígado están entre las de mayor
CP
expresión (flechas discontinuas, figura 2D). Entre las nueve líneas celulares de cáncer con mayor
CP
expresión, siete fueron asociados con la obesidad.
A. CP se encuentra en la cadena negativa (púrpura) del cromosoma 3 en la posición 3q23-q25, flanqueado por HPS3 en la cadena positiva (verde) y CPHL1 en la cadena negativa. modelos B. ARNm RefSeq del locus. C. Promotor de distribución de señales de actividad, medido por jaula en el locus. La mayoría de la expresión viene desde el extremo 5 'de CP. D. Expresión (etiquetas por millón, TPM) a través del emplazamiento de las líneas celulares presentes en FANTOM5. líneas celulares con expresión anterior 10 TPM se muestran aquí; en el total de líneas celulares fueron 269 perfilada. líneas celulares asociados con la obesidad se indican con negro (O & gt; = 1,30) y gris (O & gt; = 1,20).
flechas
Discusión
En este estudio tomamos un enfoque sistemático para identificar nuevos adipoquinas que estaban asociados con la obesidad y los cánceres relacionados con la obesidad mediante la comparación de la expresión de todos los genes de la obesidad inducida en el tejido adiposo con genes enriquecido en todos los cáncer de líneas celulares incluidos en el estudio FANTOM5. El uso más estrictos criterios de selección, sólo dos genes se calificó como muy alto en esta comparación. En teoría, estos genes podrían haber codificada secretada, así como proteínas no secretada con cualquier tipo de función. Sin embargo, resultó que los dos genes codifican proteínas circulatorios, a saber, la osteopontina y ceruloplasmina. La osteopontina no se podría definir como un adipokine (proteína secretada a partir de células de grasa) de acuerdo con nuestros hallazgos. Por el contrario, la ceruloplasmina cumplía los criterios para una verdadera adipocina, es decir, que se segrega de manera dependiente del tiempo. Por otra parte, ya que no está incluido en el secretoma publicado por células de grasa humanos, consideramos que es una novela adipokine [9]. Sin embargo, nuestro estudio no puede establecer si existe una relación causal entre la ceruloplasmina y cánceres asociadas a la obesidad, y se necesitan más estudios para determinar en qué medida, en su caso, la ceruloplasmina derivada de los adipocitos o células tumorales juega un papel funcional en el crecimiento del cáncer tejido. Sin embargo, podemos afirmar que
CP
se sobreexpresa en el tejido adiposo y la obesidad en las células cancerosas asociadas con la obesidad.
La ceruloplasmina en la circulación se cree que se produce principalmente en el hígado [15], [19]. Sin embargo, los datos actuales sugieren un papel que contribuye hasta ahora desconocida de tejido adiposo. En consonancia con las conclusiones anteriores [20], [21], los niveles circulantes aumentaron en la obesidad. Por otra parte, la secreción de tejido adiposo se incrementó notablemente en los obesos que en los sujetos no obesos. Nuestras estimaciones sugieren que el tejido adiposo en la obesidad contribuye con hasta un 22% de los niveles circulantes de ceruloplasmina y esta secreción explicó tanto como el 45% de la variación interindividual en la ceruloplasmina plasmática tanto en sujetos no obesos y con sobrepeso. La relación entre circulante y ceruloplasmina adiposo-secretada era independiente del índice de masa corporal o la masa grasa corporal. Cabe destacar que el estimado
in vivo
valores se calculan basándose en
in vitro
resultado en que pueden ser diferentes de los
in vivo
. Por otra parte, los resultados pueden estar sesgados de género ya que los datos de microarrays de tejidos adiposos utilizados aquí era de mujeres, mientras que las hipótesis sobre la distribución de la ceruloplasmina se basan en parte en un estudio previo en los hombres [14]. De hecho, aunque se midió la secreción de ceruloplasmina en el tejido adiposo de la mujer, se utilizaron los datos de sexo masculino para el agua corporal total [14] ya que los últimos valores se obtuvieron utilizando una técnica estado de la técnica. Sin embargo, los valores totales de agua corporal para las mujeres medidos con el método menos preciso biompedance son comparables con los utilizados en nuestros cálculos actuales, es decir, 0,527 ± 0,04, 0,472 ± 0,03 y 0,426 ± 0,028 l /kg de peso corporal en grasa, sobrepeso y obesidad hembras, respectivamente [22].
Por último, nuestro estudio examinó sólo el tejido adiposo subcutáneo. Dado que la expresión y secreción de adipoquinas algunos son regulados diferencialmente en diferentes depósitos de grasa [23], que no sabemos si ceruloplasmina expresa y se libera de otros depósitos pueden mostrar otras correlaciones con la obesidad. Por otro lado, el tejido adiposo subcutáneo es, con mucho, depósito de grasa más grande del cuerpo y por lo tanto cuantitativamente el determinante más importante de los niveles circulantes de adipokine
.
En resumen, mediante la realización de bioinformatically un cribado sistemático de los genes sobreexpresados en el cáncer asociado con la obesidad este estudio identificó ceruloplasmina como una novela adipocina humano. Su secreción y la expresión se incrementan en la obesidad y la ceruloplasmina adiposo es un importante contribuyente a la ceruloplasmina circulante.
Apoyo a la Información sobre Table S1. List de los miembros del consorcio FANTOM5
doi:. 10.1371 /journal.pone.0080274.s001 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros de el consorcio FANTOM5 para contribuir a la generación de muestras y el análisis de los datos genas-set y gracias a la producción de datos
Nota:. RIKEN ómicas Science Center dejó de existir como del 1 de abril de 2013, debido a la reorganización RIKEN.