Extracto
La cistatina C se cree que previene la progresión tumoral mediante la inhibición de la actividad de una familia de cisteína proteasas lisosomales. Sin embargo, se sabe poco sobre el mecanismo exacto de la función de cistatina C en el cáncer de próstata. En el presente estudio, se analizó la expresión de cistatina C y su asociación con las metaloproteinasas de matriz 2 (MMP2) y del receptor de andrógenos (AR) en un microarray de tejido comparando muestras benignas y malignas de 448 pacientes sometidos a prostatectomía radical por cáncer de próstata localizado. expresión de cistatina C fue significativamente menor en muestras de cáncer que en los tejidos benignos (p & lt; 0,001) y no había una correlación inversa estadísticamente significativa entre la expresión de la cistatina C y MMP2 (r
s
2 = -0,056, p = 0,05 ). Hubo una clara tendencia a que los pacientes con disminución del nivel de cistatina C tuvieron una supervivencia global menor. la inhibición selectiva de la cistatina C usando siRNA resultó en un aumento de la invasividad de las células PC3, mientras que la inducción de la cistatina C sobreexpresión reduce en gran medida la tasa invasión de PC3 in vitro. El efecto de la cistatina C en la modulación de la invasión de células PC3 fue provocado por Erk2 inhibidor que inhibe específicamente la actividad MAPK /Erk2. Esto sugiere que la cistatina C puede mediar invasión de células tumorales mediante la modulación de la actividad de las cascadas de MAPK /ERK. De acuerdo con nuestros hallazgos inmunohistoquímicos que los pacientes con baja expresión de cistatina C y alta expresión de receptor de andrógenos (AR) tienden a tener peor supervivencia global de los pacientes con alta expresión de cistatina C y la expresión de alto AR, la sobreexpresión inducida de AR en células PC3 que expresan la cistatina C siRNA permitió aumentar la invasividad de las células PC3. Esto sugiere que puede haber una diafonía entre la cistatina C y las vías mediadas por AR. Nuestro estudio revela un nuevo papel para la cistatina C y sus vías celulares asociados en la invasión y la metástasis del cáncer de próstata
Visto:. Wegiel B, Jiborn T, M Abrahamson, Helczynski L, L Otterbein, Persson JL, et al. (2009) La cistatina C es downregulated en cáncer de próstata y modula la invasión de las células del cáncer de próstata
a través de
MAPK /ERK y del receptor de andrógenos Caminos. PLoS ONE 4 (11): e7953. doi: 10.1371 /journal.pone.0007953
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 17 de mayo de 2009; Aceptado: 29 de octubre de 2009; Publicado: 23 Noviembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Wegiel et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Consejo de Investigación sueco (concesión no. 20760 y 09915), la Sociedad sueca del cáncer (Proyectos n 07 a 0458 y 02-4573), el Fondo de Investigación y el Fondo de Investigación del cáncer de Malmö, hospital de la Universidad, la Facultad de Medicina, Universidad de Lund, Gunnar Nilsson Fundación del cáncer y el Crafoord STF, y el Gobierno de la Salud Grant (ALF) y A. Fundación Oesterlund. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) sigue siendo el tumor más letal más común en los hombres y la segunda en el mundo occidental [1]. Aproximadamente un tercio de los pacientes tratados recaída y existe actualmente ningún tratamiento curativo para la enfermedad metastásica [2]. La progresión a través dependiente de hormonas para el cáncer de próstata metastásico resistente a la castración y es poco conocida. Los procesos de invasión y metástasis de las células tumorales dependen de su capacidad para degradar proteínas circundantes y otros componentes del tejido. Las enzimas proteolíticas y proteasas tales como la colagenasa y catepsinas son necesarias para este fin, y por lo tanto juegan papeles cruciales en múltiples etapas de crecimiento del cáncer y la metástasis [3], [4]. Entre las proteasas, las metaloproteinasas de la matriz MMP y lisosomal catepsinas B se han atribuido un papel importante en la progresión del cáncer de próstata [5] - [9] [10], [11]. Recientemente, la MMP-2 también se relacionó con un fenotipo invasivo de las células de cáncer de próstata [12] y la expresión de MMP-2 en el epitelio prostático maligno demostró ser un predictor independiente de cáncer de próstata supervivencia libre de enfermedad [13].
La cistatina C es un inhibidor de la proteasa de cisteína secretada que regula la resorción ósea, la quimiotaxis de neutrófilos, y la inflamación del tejido así como la resistencia a las infecciones bacterianas y virales. También sirve como un potente inhibidor de la catepsina B y otras proteasas de cisteína lisosomal humanos [14]. La cistatina C también es conocido por ser un mejor marcador de daño renal que la creatinina [15], [16]. Mediante la inactivación de la actividad de la proteasa catepsina, la cistatina C inhibe la invasión de células de cáncer y la metástasis [17], [18]. los niveles séricos anormales de la cistatina C o complejo catepsina B /cistatina C se han sugerido como agentes de diagnóstico y los indicadores de pronóstico para el cáncer de piel, colon y pulmón [19]. La cistatina C se ha sugerido que desempeñar un papel importante en la diferenciación neuroendocrino del cáncer de próstata [20]. Más recientemente, el suero de cistatina C se ha propuesto como marcador útil de aumento de la actividad osteoblástica asociada a bifosfonatos tratamientos en pacientes con cáncer de próstata con metástasis ósea [21]. Sin embargo, el papel de la cistatina C en la progresión del cáncer de próstata y sus redes celulares y moleculares asociadas permanecen ser investigado.
Estudios recientes han demostrado que durante la tumorigénesis y la metástasis, diversas cascadas proteolíticas que consta de enzimas tales como proteasas de cisteína y MMPs actúan de una manera sincronizada y la ayuda en el crecimiento tumoral, la invasión en los tejidos circundantes [10]. Catepsina B ha sido implicado en la degradación de la matriz extracelular (ECM), ya sea en forma secretada en el espacio extracelular o unida a la superficie celular [10]. En particular, MMP-2 y MMP-9 se han sugerido para ser asociado con la metástasis del cáncer de próstata, se midieron como altos niveles de estas proteínas en el plasma y en la orina en los pacientes con enfermedad metastásica [5], [22], [23]. MMP9 también ha sido estudiado intensamente y es sin embargo de desempeñar un papel importante en dos aspectos importantes de la progresión tumoral, la angiogénesis y la vasculogénesis [8].
El proceso metastásico implica la coordinación de varias vías celulares y de transducción de señales que permiten que las células cancerosas proliferen, remodelar su entorno, invaden al sitio distante y formar nuevos tumores. MAPK vías de señalización desempeñan un papel importante en la inducción de la secreción de enzimas proteolíticas que degradan la membrana basal, la mejora de la migración celular y el mantenimiento del crecimiento de células tumorales [7]. Los aumentos en la actividad de MAPK se han observado en CaP avanzado lo que sugiere que una vía Ras constitutivamente activa podría estar asociado con la progresión del cáncer de próstata y metástasis [7], [24]. Es importante destacar que la activación de MAPK está ligada al desarrollo del cáncer de próstata independiente de andrógenos, que ahora se denomina comúnmente el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) [25], [26], [27].
receptor de andrógenos (AR), un miembro de la superfamilia de los receptores nucleares activados por ligando, desempeña un papel central en la patogénesis de cáncer de próstata primario y metastásico [28], [29]. la amplificación del gen AR se encuentra en un tercio de los cánceres de próstata avanzados y se cree que contribuye a la progresión y la metástasis de cáncer de próstata [30], [31], [32], [33]. AR no actúa de forma independiente en la regulación del crecimiento del tumor, sino que requiere la interacción con los compañeros de los reguladores [34]. Las mutaciones en el gen o mensaje de la AR son las razones para el aumento de la sensibilidad de andrógenos de esos tumores. producción autocrina Local de la dihidrotestosterona y testosterona en las células de cáncer de próstata disminuye el efecto de la castración [35]. La diafonía entre las vías de señalización AR y otros (por ejemplo MAPK), así como cambios en AR co-reguladores [34] acelerar el ligando de activación independiente de la AR. Por lo tanto, AR desempeña un papel vital en ambos tipos de cáncer de próstata clínicamente localizado y avanzado.
El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la expresión de cistatina C y su relevancia clínica en el cáncer de próstata, y para dilucidar un nuevo papel para la cistatina C en la invasión del cáncer de próstata. La cistatina C se asocia con la cascada proteolítica y la vía MAPK /ERK junto con AR puede actuar de una manera sincronizada para promover el crecimiento del tumor y la invasión en los tejidos circundantes. A continuación, se estableció por primera vez un vínculo funcional entre la cistatina C y la señalización de las MAPK Erk y rutas mediadas por AR en células de cáncer de próstata.
Resultados
Expresión tisular de cistatina C en el cáncer de próstata se asocia con la MMP-2 como marcador de la invasión y la evolución clínica
la disminución de la expresión de ARNm de cistatina C se ha reportado en varios tipos de tumores sólidos, incluyendo cáncer de mama, cáncer de colon y carcinoma renal [36], [37]. Sin embargo, no se ha informado el papel específico de la expresión de proteínas de cistatina C en la progresión del cáncer de próstata y su asociación con características clínicas. Hemos utilizado un tejido microarrays (TMA) que contiene muestras de tejido prostático benigno y los tumores malignos de 448 pacientes sometidos a prostatectomía radical por cáncer de próstata localizado. Expresión de la cistatina C se examinó mediante inmunohistoquímica. Prácticamente todas las muestras benignas mostraron expresión marcadamente alta proteína citoplasmática de la cistatina C, mientras que los tejidos de cáncer de próstata emparejados consistentemente muestran más débil o inmunotinción indetectable (Figura 1A, B). La diferencia fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,001), lo que sugiere que la expresión de proteínas de cistatina C es, en general, el regulado en el cáncer de próstata en comparación con el epitelio benigno. a continuación, hemos dividido las muestras tumorales en dos grupos en función de los grados de Gleason de las biopsias de núcleo individuales, Gleason de grado 2 ó 3 (Grupo 1) frente a Gleason 4 o 5 (Grupo 2) [38]. Encontramos disminución de la expresión de cistatina C en muestras de tumores 61% del grupo 1 en comparación con el 72% de las muestras en el Grupo 2 (Figura 1A). Tanto MMP2 y MMP-9, en particular, se han encontrado para ser asociado con la metástasis del cáncer de próstata [13], [39]. Recientemente, la cistatina C se identificó como un nuevo sustrato para MMP2 en análisis proteómico basado en células, lo que sugiere que existe una relación funcional directa entre MMP2 y cistatina C [40]. Por lo tanto, exploramos una posible asociación entre la expresión de cistatina C y la expresión de MMP2 en las muestras de pacientes por análisis inmunohistoquímico de nuestro constructo microarrays de tejidos (TMA). Curiosamente, la expresión de la proteína cistatina C se asoció inversamente con la MMP-2 en el material del paciente 448, que fue estadísticamente significativa (r
s
2 = -0,056, p = 0,05). Además, investigó si la expresión de cistatina C correlaciona con el resultado clínico en pacientes con cáncer de próstata, y hemos dividido los pacientes en dos grupos basados en el nivel de expresión de cistatina C: cistatina C elevada (intensidad de la tinción 2 o 3) o la cistatina C bajo (intensidad de tinción de menos de 2) grupo. No se encontraron diferencias significativas en los parámetros clínicos, incluyendo la puntuación de Gleason, estadio T /etapa de Patología, el tiempo libre de metástasis, los niveles de PSA pretratamiento, los niveles de recurrencia bioquímica del PSA, el tiempo libre de Bioquímica y márgenes quirúrgicos positivos entre la cistatina C bajo grupo de alto y la cistatina C (Tabla 1 ). a continuación, se investigó si el resultado clínico general incluyendo la supervivencia (OS) diferenció entre la cistatina C de alta y baja de cistatina C pacientes. Los pacientes en el grupo alto cistatina C a 100 meses desde el diagnóstico tenían un sistema operativo de aproximadamente 40% en comparación con el 25% de los pacientes en el grupo bajo la cistatina C (p = 0,307) (Figura 1C). A pesar de que no alcanzó significación estadística, hay una tendencia clara que los pacientes con bajo nivel de expresión de cistatina C tuvieron peores resultados en comparación con aquellos con los niveles más altos. Cuando se evaluó si la supervivencia libre de recidiva bioquímica fue diferente entre los grupos, también hubo ninguna diferencia significativa (p = 0,401) (Figura 1D).
A). El análisis inmunohistoquímico de la expresión de cistatina C en las muestras benignas y PCA. Se muestran secciones que representan benigna, tejidos y tumores de Gleason de grado 3 y grado 5. Representante imágenes se obtuvieron utilizando un objetivo de 40x. SEGUNDO). La gráfica de análisis cuantitativo de la tinción inmunohistoquímica de la cistatina C (puntuación 0-negativo, 1- moderado, 2- fuerte, 3- muy fuerte) muestra la comparación entre 448 muestras benignas y cancerosas (tinción media de duplicados de cada muestra). Los análisis de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon pareada se utilizaron para evaluar la comparación entre los grupos. Se muestran los valores medios de las intensidades de tinción (líneas horizontales) con barras de error representan intervalos de confianza del 95% para la media. Los recuadros representan la distribución de la expresión de cistatina C en los grupos. C) La supervivencia global en pacientes con alta o baja expresión de cistatina C en muestras de cáncer de próstata. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. curvas D) Supervivencia de tiempo hasta la recaída, según se evaluó como una recurrencia bioquímica medida como por aumento de PSA [57] para la baja (intensidad anotar 0-1,5) y alta (intensidad anotar la expresión 2-3) cistatina C.
Expresión tisular del receptor de andrógenos es inversamente asociados con la cistatina C Expresión
la amplificación y mutaciones del gen AR se identifican como factores críticos relacionados con el mal pronóstico del cáncer de próstata. Queríamos investigar si la expresión de cistatina C en combinación con AR puede predecir la evolución de la enfermedad. Se evaluó la expresión de cistatina C en un subconjunto de nuestros TMA muestras que comprenden 99 pacientes con la enfermedad más avanzada y tenía alto nivel de expresión de AR. Dividimos estos 99 pacientes en dos grupos: la cistatina C-baja /grupo AR-alta y la cistatina C-alta /grupo AR-alta (Figura 2). Los pacientes con niveles C bajo cistatina y la expresión de alto AR tuvieron una supervivencia global menor (40%, a 100 meses) en comparación con los pacientes con alto niveles de cistatina C y la expresión de alto AR (60%, a 100 meses), aunque estos resultados no alcanzaron estadística significación (p = 0,094). Esto indica que los pacientes que tenían bajo la cistatina C y la expresión de alto AR tienden a tener peores resultados en comparación con los pacientes con alto cistatina C y la expresión de alto AR.
La supervivencia global en un grupo de 99 pacientes con el cáncer de próstata más avanzado (grado de Gleason 4-5), que se caracteriza por una alta expresión de AR y se separaron a diferentes grupos en función de los niveles de cistatina C (intensidad baja puntuación de 0-1,5 y la puntuación alta intensidad 2-3).
la cistatina C expresión en líneas celulares de cáncer de próstata
Debido a que la cistatina C se redujo reguladas en tejidos de cáncer de próstata y se asocia con una mayor expresión de la MMP-2 que se sabe que contribuyen a la invasión tumoral y la metástasis, que querían investigar el papel de la expresión de cistatina C en el crecimiento de células de cáncer de próstata, la supervivencia y la invasión. Se examinó la expresión de cistatina C en tres líneas celulares de cáncer de próstata, incluyendo las células LNCaP sensibles a andrógenos y PC3 andrógenos insensible y células DU-145 (Figura 3). las concentraciones de proteína de cistatina C en los sobrenadantes se midieron por ELISA, después de cultivar las células en medio libre de suero durante 24 y 48 horas, respectivamente. Curiosamente, las células LNCaP que se sabe que son no invasivos altos niveles producidos de la cistatina C, mientras que las líneas de células invasivas PC3 y DU-145 mostraron niveles más bajos de la secreción de la cistatina C (Figura 3). células PC3, con un nivel moderado de expresión de cistatina C se eligieron para estudios funcionales posteriores para evaluar los efectos de la sobreexpresión forzada y desmontables de cistatina C en la invasión de células PC3.
ensayo ELISA de los sobrenadantes de las células de cáncer de próstata tres diferentes líneas, que se colocaron en placas de 24 h o 48 h antes de experimento se llevó a cabo. Los datos se muestran como media ± DE de triplicados de 3 experimentos.
baja regulación de la cistatina C está ligada a la invasión de células PC3
Dado que las células PC3 son invasoras, expresan nivel moderado de la cistatina C y tienen AR funcional falta, por tanto, puede ser un excelente modelo para estudios combinados en la cistatina C y la función AR. células PC3 se transfectaron con la cistatina C siRNA vector o control siRNA vector durante 24 horas. El análisis por inmunotransferencia confirmó que la cistatina C siRNA bloqueado específicamente la expresión de la proteína de la cistatina C en células PC3 (Figura 4A). Para examinar el efecto de la cistatina C tumbar en la modulación de la actividad invasiva de las células PC3, en ensayos in vitro de la actividad invasiva se realizaron para evaluar la proporción de células PC3 que expresan la cistatina C siRNA o controlar siRNA que han invadido a través de membranas con recubrimiento de Matrigel. Una proporción significativamente mayor de las células PC3, transfectadas transitoriamente con la cistatina C siRNA, migra a través de cámaras recubiertos con matrigel en comparación con la de las células PC3 transfectadas con ARNsi de control (Figura 4B-C). A continuación, se evaluó si la cistatina C caída podría tener efecto sobre la proliferación de células de cáncer de próstata. células PC3 transfectadas con cistatina C siRNA o siRNA de control se sometieron a ensayo de incorporación de BrdU. La proliferación celular se evaluó después de 24 horas o 48 horas de la transfección. No se observaron diferencias significativas en las tasas de proliferación entre las células PC3 transfectadas con siRNA de cistatina C o de control de siRNA (datos no presentados), lo que sugiere que la inhibición de la cistatina C no tuvo efecto sobre la proliferación de células PC3. También evaluamos el efecto de la cistatina C en la distribución del ciclo celular. Análisis de citometría de flujo se realizó en células transfectadas con la cistatina C siRNA o ARNsi de control, no se observó que el silenciamiento de la cistatina C tuvo ninguna influencia significativa sobre la distribución de fases del ciclo celular en células PC3 (datos no mostrados). A continuación, hemos querido poner a prueba si la inhibición de la cistatina C puede tener algún efecto en las supervivencias de las células PC3 en respuesta al tratamiento con el agente citotóxico. células PC3 transfectadas con siRNA de cistatina C o de control de siRNA se trataron con el agente citotóxico camptotecina a 10 ng /ml para inducir la apoptosis. El tratamiento de células PC3 con camptotecina indujo con éxito la muerte celular en células PC3. células PC3 transfectadas con siRNA contra la cistatina C, sin embargo, no mostraron diferencias significativas en la apoptosis camptotecina inducida en comparación con células PC3 transfectadas con ARNsi de control (datos no mostrados).
A). Inmunotransferencia de la cistatina C en células PC3 después del tratamiento con el control (siCtr) y la cistatina C (siCys) siRNA. B-C) ensayo de invasión en matrigel- recubierto Boyden cámaras de células PC3 con caída cistatina C. imagen Representante de células invasoras se muestra en (B) y el análisis cuantitativo de la invasión de midiendo la absorbancia después de la tinción de células invasoras con solución de tinción de la célula que contiene cristal violeta suministrado en el ensayo de invasión Transwell (Chemicon, Millipore, CA) (C) ± dE de datos son representativos de al menos 3 experimentos, * p & lt;. 0,01 (t de Student) guía empresas
Debido inhibición de la cistatina C en células PC3 tuvo efecto significativo en la invasión de células PC3, que por lo tanto evaluado si la sobreexpresión de la cistatina C podría tener efectos inhibidores sobre el comportamiento invasivo de las células PC3. Para inducir la sobreexpresión de la cistatina C en células PC3, células PC3 se transfectaron con un vector de expresión de cistatina C o con un vector de expresión vacío. La sobreexpresión estable de cistatina C en células PC3 se logró después de la selección de antibióticos. La sobreexpresión de la cistatina C en células PC3 se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia (Figura 5A). Cuando se investigó el efecto de la sobreexpresión de la cistatina C en la invasión de células PC3, hemos observado que una proporción significativamente menor de células PC3 que sobreexpresan la cistatina C migra a través de cámaras de Boyden recubiertas con Matrigel en comparación con las células que expresan el vector de control (Figura 5B-C). En conjunto, nuestros datos actual sugiere un papel importante para la cistatina C para inhibir la invasión de células de cáncer de próstata.
A) por inmunotransferencia de la cistatina C en células PC3 después de la transfección estable con pcDNA3.1 y cistatina C-plásmidos pcDNA3.1 . clones estables se establecieron después de 2 semanas de selección de neomicina. B-C) ensayo de invasión de células PC3 con sobreexpresión de plásmidos de control o la cistatina C. Imágenes representativas de las células se muestran en la B y cuantificación (absorbancia) de los datos + SD de 3 experimentos independientes se muestra en C. * p & lt; 0,05 (prueba t de Student) guía empresas
El papel de Erk2. Camino en la cistatina C mediada por los efectos sobre la invasión a
a continuación, hemos querido investigar los mecanismos celulares y vías por las que la cistatina C ejerce su efecto sobre la invasión de células PC3. MAPK vías de señalización y vías de TGF han demostrado tener relación funcional con enzimas proteolíticas incluyendo la familia de las proteínas de catepsina para promover la degradación de la membrana basal, mejora la invasión de células y mantiene el crecimiento de células tumorales. Smad 2/3 proteínas son los efectores de señalización de TGFß y el blanco de las vías de MAPK /ERK, así, por lo tanto, queríamos investigar si la cistatina C puede tener una relación funcional directa de estas vías de señalización. Se examinó en primer lugar si la cistatina C puede mediar las actividades de MAPK y TGF vías mediante la regulación de la expresión y la fosforilación de Smad2 y Erk1 /2 en células PC3. Se examinó la fosforilación de Smad2 y Erk1 /2 en células PC3 transfectadas con cistatina C siRNA o ARNsi de control (Figura 6A). El análisis por inmunotransferencia reveló que se observó un aumento en el nivel de fosforilados Smad2 y Erk1 /2 en células PC3 transfectadas con cistatina C siRNA, lo que sugiere que tanto Smad2 y Erk1 /2 pueden ser los efectores corriente abajo inhibidas por la cistatina C (Figura 6A).
A). El análisis por inmunotransferencia de la P-Smad2 en las células PC-3 después de Smad2 silenciamiento. ANTES DE CRISTO). ensayo de invasión en las células PC-3 después de silenciamiento de Smad2 simultáneamente con caída de la cistatina C. Las imágenes representativas se muestran en la B y los resultados cuantitativos de 3 experimentos independientes se presentan en C * p & lt; 0,05 (prueba t de Student). RE). Inmunotransferencia con anticuerpo contra fosforilada (Ser383) -Elk1 y cistatina C en los lisados de células PC3 transfectadas transitoriamente con siARN de cistatina C y el control de siRNA y co-tratado con inhibidor de Erk2 (25 M). Tenga en cuenta que inhibidor bloquea la fosforilación de Erk2 aguas abajo de Elk1 un objetivo de ERK2 en células, con la eliminación de la cistatina C. Los datos son representativos de 2 experimentos. E-F). ensayo de invasión en las células PC-3 después de silenciamiento concomitante de la cistatina C y la inhibición de ERK2 con inhibidor selectivo. Las imágenes representativas se muestran en los resultados de D y cuantitativos de 2 experimentos independientes se presentan en E. * p & lt; 0,05,#p. & Lt; 0,01 (prueba t de Student) guía empresas
Para examinar el papel de los funcionalmente la activación Smad2 en las células PC3, hemos probado si desmontables Smad2 apuntado tenía algún efecto sobre la invasión de células tumorales. Hemos diseñado siRNA para dirigirse específicamente a Smad2. La inhibición de la fosforilación de Smad2 a través de Smad2 ARNsi mediada desmontables se logró en células PC3 y se confirmó mediante inmunotransferencia (datos no mostrados). Los ensayos in vitro de actividad invasivos revelaron que la proporción de la migración y la invasión de células PC3 fueron similares en células PC3 transfectadas con siRNA Smad2 y en células PC3 transfectadas con ARNsi de control (Figura 6B-C). A continuación realizó knockdown simultáneamente dirigida de Smad2 y cistatina C en células PC3. células PC3 que fueron co-transfectadas con cistatina C siRNA y Smad 2 siRNA o de control de siRNA se aplicaron adicionalmente en la cámara de invasión para el ensayo de invasión. No hubo diferencias en la tasa de invasión entre las células PC3 co-expresión de cistatina C siRNA y Smad 2 siRNA y células PC3 co-expresan la cistatina C siRNA y ARNsi de control (Figura 6B-C), lo que sugiere que la inhibición de Smad2 no tenía efectos adicionales sobre la modulación de la invasión de células PC3 que expresan la cistatina C siRNA y que Smad2 puede no involucrado en la cistatina C invasión de células tumorales mediada por
.
Debido a que un aumento en el nivel de fosforilados Erk1 /2 también se observó en las células PC3 transfectadas con cistatina C siRNA en los experimentos anteriores, por lo tanto, investigar más si la activación de Erk1 /2 mediado el efecto inhibidor de la cistatina C en la invasión de células PC3. El tratamiento con un inhibidor de MEK (PD98059), un inhibidor general de las vías de MAPK no tuvo efecto sobre el comportamiento invasivo de células PC3 que expresan la cistatina C siRNA o control siRNA (datos no presentados). Decidimos para inhibir selectivamente la actividad de ERK 1 o Erk2.
En primer lugar, se inhibió Erk 1 de expresión a través de siRNA dirigidos caída. La inhibición de Erk 1 no tuvo efecto sobre la invasión de células PC3 que expresan la cistatina C siRNA (datos no presentados), lo que sugiere que Erk1 puede no estar implicado en la cistatina C invasión de células tumorales asociada. A continuación, se utilizó inhibidor selectivo de la actividad de Erk2, que bloqueó la fosforilación de Elk-1, un objetivo corriente abajo de Erk2, en células PC3 que expresan la cistatina C siRNA (Figura 6D). Hemos observado que Erk 2 inhibidor inhibe significativamente la tasa de invasión en células que expresan la cistatina C siRNA en comparación con las células que expresan ARNsi de control (Figura 6E-F). El inhibidor de Erk2 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular en células PC3 en las mismas condiciones (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que Erk2 puede ser una diana aguas abajo de la cistatina C. Esto sugiere que las células PC3 que tienen baja de cistatina C y alto nivel de actividad Erk2 pueden llegar a ser más invasiva en comparación con células con nivel normal de la cistatina C y 2 la actividad de ERK. Además, la cistatina C puede mediar invasión de células tumorales a través de MAPK /Erk2 vías de señalización.
AR mejora la invasión celular en ausencia de cistatina C
AR es una importante diana en el sentido de las vías de MAPK /ERK, y la inhibición de la actividad de ERK1 /2 dará lugar a una disminución de expresión de AR en células de cáncer de próstata [41]. La sobreexpresión de AR en células PC3 se ha demostrado que influyen en la invasión de células y el crecimiento in vitro [42]. Ya que hemos establecido una relación funcional directa entre la cistatina C y la actividad Erk2, y hemos demostrado que los pacientes con CaP con bajos niveles de cistatina C y los altos niveles concomitantes de AR mostraron una tendencia hacia un peor resultado en comparación con los pacientes con alta cistatina C y alta los niveles de AR, por lo tanto, quisieron evaluar la asociación celular y molecular entre la cistatina C y AR. Empleamos las células PC3 que carecen de la AR funcional para investigar una función de cooperación entre las células PC3 AR y cistatina C. fueron co-transfectadas con AR vector que expresa junto con la cistatina C vector siRNA designado como "siCysC, AR" o con un vector de control designado como "sictr, AR". De manera similar, las células PC3 eran también co-transfectadas con un vector CMV y la cistatina C siRNA (designado como "siCysC, CMV") o un vector que expresa CMV y un control de siRNA ( "sictr, CMV"). Las células PC3 transfectadas se sometieron después para el ensayo de invasión. La sobreexpresión de AR con caída concomitante de la cistatina C resultó en un aumento significativo en la tasa de invasión de células PC3 en comparación con los controles (Figura 7A-B). Por lo tanto, estos resultados sugieren que las células PC3 que carecen de la cistatina C, pero que tienen alto nivel de AR puede ser más invasivo que las células de control con nivel normal de la cistatina C y AR.
A-B). ensayo de invasión de las células PC3 transfectadas con siRNA control o en contra de la cistatina C y AR co-expresar. Las fotos de experimento representativo se muestran en una y las absorciones cuantitativas de las células invasoras (* p & lt; 0,05, la cistatina C siRNA frente al control de siRNA,#p & lt; 0,05 AR frente a CMV, prueba t de Student) después de afirmar con solución de tinción de teléfono suministrado en el ensayo Transwell invasión (Chemicon, Millipore, CA) se muestran en B. los datos son representativos de 3 experimentos independientes.
Discusión
en el presente estudio, hemos demostrado que
in vitro
silenciamiento de la cistatina C por siRNA aumento de la invasión de las células cancerosas en cooperación con Erk2 y AR señalización. Hemos desentrañado nuevos mecanismos moleculares por los cuales la cistatina C afecta a la invasión de células tumorales demostrando que la expresión de cistatina C se downregulated en los tumores primarios de próstata en comparación con los tejidos benignos en 448 pacientes. El uso de un TMA que comprende muestras benignas y tumorales de 448 pacientes, se demostró una correlación inversa entre la cistatina C y la expresión de MMP2. Varios estudios han demostrado de forma convincente que la cistatina C es un inhibidor importante de la catepsina B y la invasión de células tumorales [43], [44]. Catepsina influencias B microambiente tumoral por la degradación de la matriz extracelular y por la activación de otras enzimas proteolíticas, tales como de tipo uroquinasa pro activador de plasminógeno (pro-uPA) y metaloproteasas de la matriz (MMPs), de modo que las células tumorales pueden invadir activamente y metástasis [45]. La sobreexpresión de la cistatina C se ha demostrado que inhiben el potencial invasivo de las líneas celulares de melanoma y glioblastoma humano [36], [43]. Nuestro hallazgo presente desde la investigación de materiales clínicos indica que hay una relación directa entre la cistatina C y la matriz extracelular MMP2 proteína en el cáncer de próstata. No hemos investigado el papel de la cistatina C en la modulación de las actividades de la catepsina B en células de cáncer de próstata, sin embargo, es una posibilidad abierta teniendo en cuenta las correlaciones similares en otro tipo de tumores. firmas Proteoma que son características de la proteolisis revelaron la escisión de muchos conocidos MMP-2 sustratos en el contexto celular. Se encontró evidencia proteómico de MMP-2 de procesamiento de nuevos sustratos. proteína cistatina C es una de sustrato que es escindido por la MMP-2 [40]. Proporcionamos evidencia adicional que soporta un papel propuesto anteriormente de la cistatina C para prevenir la tumorigénesis y la invasividad de células de cáncer, posiblemente debido a su capacidad para inhibir la actividad de proteínas de la matriz extracelular [46], [47].
Nuestro análisis funcional en células PC-3 demostraron además que la inhibición de la cistatina C a través de la precipitación mediada por siRNA resultó en un aumento significativo en la tasa de invasión de células PC3. Esta observación es consistente con la demostración anterior en los tumores prostáticos primarios donde los tumores más invasivos tenían expresión muy baja o indetectable cistatina C. Por lo tanto, la cistatina C puede ser funcionalmente importante para las células para mantener el comportamiento normal, lo que está en concordancia con nuestros resultados actuales de que las células PC3 que sobreexpresan la cistatina C a través de la transfección transitoria muestran fenotipos menos invasivos
.
La vía de ERK-MAPK es una mecanismo de señalización común para varios factores de crecimiento que están implicados en la diseminación metastásica y de resistencia a fármacos [48]. Mediante el empleo de siRNA contra la cistatina C, se demostró que la cistatina C se asoció inversamente con el comportamiento invasivo de las células PC3, y que la cistatina C estaba involucrado en la regulación de la actividad de la quinasa Erk.