Extracto

El humana es un no hemo estructurado, metaloenzima que contiene hierro que participan en la conversión de cisteína a cisteína sulfinato, y juega un papel clave en la biosíntesis de taurina. En nuestra búsqueda de nuevos promotores de genes metilados, se han analizado los perfiles diferenciales de expresión de ARN de las líneas celulares de cáncer colorrectal (CRC) con o sin tratamiento de 5-aza-2'- desoxicitidina. Entre los genes identificados, se encontró el
CDO1
promotor ser diferencialmente metilado en los tejidos de CRC primarias con alta frecuencia en comparación con tejidos de colon normales. Además, una diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia de
se observó CDO1
promotor de la metilación entre los tejidos normales y tumorales primarios derivados de mama, esófago, pulmón, vejiga y el estómago. Regulación a la baja de
se observaron CDO1
los niveles de ARNm y proteínas en líneas celulares de cáncer y tumores derivados de estos tipos de tejidos. La expresión de
CDO1
está estrechamente controlada por el promotor de la metilación, lo que sugiere que la metilación del promotor y el silenciamiento de
CDO1
puede ser un evento común en la carcinogénesis humana. Además, la expresión forzada de larga duración
CDO1 Hoteles en células humanas de cáncer disminuyó notablemente el crecimiento de células tumorales en un
in vitro
cultivo de células y /o un
in vivo de ratón
modelo, mientras que desmontables de
CDO1
aumentó el crecimiento de células en cultivo. Nuestros datos implican
CDO1
como un nuevo gen supresor de tumores y un marcador molecular que puede ser valiosa para el cáncer humano

Visto:. Brait M, S Ling, Nagpal JK, Chang X, Parque HL, Lee J, et al. (2012) La cisteína dioxigenasa 1 es una genes supresores de tumor silenciados por la metilación del promotor en los cánceres humanos múltiples. PLoS ONE 7 (9): e44951. doi: 10.1371 /journal.pone.0044951

Editor: Chun-Ming Wong, Universidad de Hong Kong, Hong Kong

Recibido: 20 de enero de 2012; Aceptado: August 14, 2012; De publicación: septiembre 27 de, 2012

Copyright: © Brait et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del cáncer (CA84986-U01 Early Detection Research Network) y el asistente de vuelo Instituto de Investigación médica (Myoung S. Kim). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. En virtud de un acuerdo de licencia entre OncoMethylome Ciencias y la Universidad Johns Hopkins, D. Sidransky es derecho a una parte de las regalías recibidas por la universidad en las ventas de los productos descritos en este artículo. D. Sidransky posee OncoMethylome Ciencias, SA de valores, que está sujeto a ciertas restricciones en virtud de la política universitaria. D. Sidransky es un consultor pagado a las Ciencias OncoMethylome, SA y es un miembro pagado del Consejo Asesor Científico de la compañía. La Universidad Johns Hopkins, de acuerdo con su conflicto de intereses políticas es la gestión de los términos de este acuerdo. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

El cáncer es causado por la regulación aberrante de genes, incluyendo la inactivación de reguladores negativos de la proliferación celular ( incluidos los genes supresores de tumores; ETG) y la activación de los reguladores positivos (tales como oncogenes). Además de las alteraciones genéticas que implican mutaciones de oncogenes y ETG, proceso carcinogénico puede ocurrir a través de cambios epigenéticos en los promotores de genes [1]. Los cambios epigenéticos, cambios heredables en la expresión génica que se producen sin cambios en la secuencia de ADN, contribuyen al desarrollo y la progresión de las células tumorales [2] y se considera que son características del cáncer. metilación del ADN y la acetilación de histonas son los cambios epigenéticos más frecuentes y estudiados [1]. Hay regiones ricas en CG conocidas como islas CpG que se pueden encontrar dentro de la región del extremo 5 'incluidos el promotor, la región no traducida y el exón 1 del formulario o los genes con actividad TSG [3]. islas CpG no están generalmente metiladas en las células normales [3], pero la hipermetilación aberrante de las islas CpG que conduce a la inactivación de la transcripción y el silenciamiento de genes puede ser eventos tempranos en la carcinogénesis y se considera que es un mecanismo común de pérdida de la función TSG en los cánceres humanos [1], [4]. En la actualidad, es bien aceptado que las alteraciones epigenéticas incluso predisponen a alteraciones genéticas durante la tumorigénesis [5]. Clínicamente, TSG metilación se puede utilizar como un biomarcador epigenético para el diagnóstico de tumores y la predicción del pronóstico. Por lo tanto, el conocimiento de los patrones de metilación en todo el genoma puede ayudar a identificar las ETG clave inactivadas durante la formación de tumores [6], [7], [8].

Mamíferos
cisteína dioxigenasa gratis (
CDO
, EC 1.13.11.20) es una enzima esencial para la salud humana implicada en la biodegradación de cisteína tóxico y por lo tanto la regulación de la concentración de cisteína en el cuerpo. Es un no hemo estructurado, metaloenzima que contiene hierro implicada en la conversión de la cisteína al sulfato inorgánico, y juega un papel clave en la biosíntesis de la taurina [9]. El marco de lectura abierto de
CDO
gen codifica una proteína de 200 aminoácidos (peso molecular de 23 kD, que se une uno Fe
2
- ion por molécula). Ratón
cdo
y la rata
cdo
tiene una secuencia de aminoácidos idéntica que es 92% idéntico al humano
CDO
, y la mayoría de las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras. El gen
CDO
se extiende por cerca de 15 kb y contiene 5 exones. La región flanqueante 5 'del ser humano
CDO
gen contiene varias consenso putativa
cis-actuando
secuencias reguladoras, en particular para la unión del factor nuclear hepático-3 (HNF-3) y su homólogos, que son conocidos por estar involucrados en la transcripción génica específica del hígado. La presencia de estos sitios de unión de consenso es consistente con el más alto nivel de
CDO
mRNA encuentran en extractos de hígado en comparación con otros extractos de tejidos (riñón, pulmón y cerebro) [10]. Hay dos tipos de CDO; citosólica (CDO1) y unida a la membrana (CDO2) y murino CDO1 ha postulado estar implicado en la regulación de la función de las proteínas y los mecanismos de defensa antioxidantes a través de su capacidad de oxidar los residuos de cisteína [11].

El humana
CDO1
gen se localiza en el cromosoma 5 q23.2 que se elimina con frecuencia en el cáncer de pulmón avanzado [12]. Staub et al. [13] supone que la supresión o el silenciamiento epigenético de la región cromosómica q23.2 5 donde
CDO1
se encuentra es un mecanismo frecuente que contribuye a la tumorigénesis colorrectal;
poliposis adenomatosa coli gratis (
APC
) y
mutado en el cáncer colorrectal gratis (

MCC) están situados en el barrio de 5 q23 [12]. Es altamente expresado en el hígado y la placenta, y débilmente en el corazón, el cerebro y el páncreas [14]. La cisteína regula el volumen de negocios CDO1 través Ubiqutin-26S proteasoma mediada por la degradación de [15], y un alto nivel de la cisteína es citotóxico y puede causar artritis reumatoide [16], [17], [18], la enfermedad de Parkinson [17], la enfermedad de Alzheimer [ ,,,0],17], el aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular [19] y los resultados adversos del embarazo [20]. Recientemente, se describió la sobreexpresión de CDO1 para el síndrome de Sézary, un linfoma cutáneo de células T agresivas [21].

Anteriormente, se informó de un conjunto de genes candidatos que forman parte de la emergente "metiloma cáncer" mediante el uso de un nuevo dato algoritmo estructura del promotor y de microarrays generados a partir de líneas celulares de cáncer de 22 derivados de 5 tipos principales de cáncer [22], [23]. En nuestros estudios anteriores, hemos examinado recientemente identificado los genes metilados específicos del cáncer en un panel de 300 tumores primarios que representan 13 tipos de cáncer;
oncostatina M del receptor β-gratis (
OSMR
) y
β-1,4-galactosiltransferasa-1 gratis (
B4GALT1
) eran dos de los nuevos genes identificados en el estudio a ser metilados en los tejidos de CRC primarias pero rara vez en correspondiente mucosa adyacente normal y en tejidos de colon normales no malignas [23]. Además, una combinación de desenmascaramiento farmacológica y el análisis de microarrays de oligonucleótidos [24], [25], [26] nos permitió encontrar nuevos genes metilados en carcinoma esofágico de células escamosas (CECA) y las líneas celulares de CRC y tejidos primarios.
NEFH
[27],
DFNA5
[26],
OSMR
[23],
LIFR
[28] y
NMDAR2B
[25] eran representante genes que hemos encontrado para ser epigenetically inactivada en CECA humana y la CRC a alta frecuencia. expresiones de ARNm de estos genes en los tejidos de cáncer también fueron significativamente regulados hacia abajo en comparación con los tejidos normales. Por otra parte, los estudios funcionales sugieren funciones supresoras tumorales de estos genes en líneas celulares de CRC y CECA humanos.

En este estudio, mostramos que
CDO1
fue uno de los genes candidatos identificados por la combinación de estrategia de desenmascaramiento farmacológico y microarrays de expresión de los análisis. Hemos observado frecuente metilación promotor y regulación a la baja de
CDO1
en múltiples tipos de cáncer humano. Los estudios funcionales revelaron que
CDO1
alberga actividad supresora de tumores.

Resultados


CDO1
es inactivada epigenético en cáncer de colon humano

nuestra búsqueda de genes silenciados en epigenetically CRC humana, se realizó una combinación de desenmascaramiento farmacológica y posterior análisis diferencial de microarrays utilizando microarrays que contienen 22.284 transcripciones (Affymetrix) [26]. Se utilizó el agente de desmetilación 5-Aza-2'- desoxicitidina (5-aza-DC) para reactivar los genes silenciados epigenetically en tres líneas celulares de CRC (HCT116, HT29 y DLD-1). Hemos informado anteriormente de criterios de selección para la identificación de genes inactivados con frecuencia en el cáncer de colon en un promotor de la metilación del ADN [26]. Nos volvieron a analizar los genes supresores de tumores candidato en nuestra lista de genes y se encontró que la expresión de
cisteína dioxigenasa 1 gratis (
CDO1
) estaba "ausente" antes de un tratamiento farmacológico y "presente" después de 5- tratamiento aza-dC en las tres líneas celulares de CRC probadas. El ausente y reactivado
CDO1
expresión por 5-aza-DC en cinco líneas celulares de CRC (HCT116, HT29, DLD-1, RKO y SW480) fueron validados por el análisis de RT-PCR (Fig. 1A ).

a, Expresión de
CDO1 Hoteles en líneas celulares de CRC se examinó mediante análisis de RT-PCR. Ninguna expresión basal de
CDO1
se observó en todas las líneas celulares de CRC, y todas estas líneas celulares albergaba
CDO1
metilación (M). Silenciado
CDO1
se reactivó después del tratamiento con el agente de desmetilación, 5-aza-DC, lo que indica que
CDO1
metilación se correlaciona fuertemente con la pérdida de la expresión de genes en líneas celulares de CRC. β-actina se utilizó como control de carga. m, las células tratadas con el único vehículo; a, las células tratadas con 5-Aza-dC (5 mM durante tres días). L, 1 escalera de ADN Plus Kb. Se muestra B, estado de metilación de CpG individuales de la isla en 5 líneas celulares de CRC y 21 pares de CRC primaria (PT) y sus correspondientes tejidos de colon normales (PN). Un total de 38 GC fueron contados a partir de la primera a la última CG en las secuencias como se indica. círculo negro, la metilación; círculo blanco, no metilación; círculo gris, co-existencia de alelos metilados y no metilados; círculo discontinuo, no determinado. C, Análisis de
CDO1
actividad promotora de ensayo indicador de luciferasa en
CDO1
-negativo (HCT116) y células positivas (HEK293). Las construcciones del promotor (pGL2-
CDO1 CD -#1 y -#2) fueron tratadas previamente con o sin
Sss
I metilasa durante 8 horas antes de la transfección. Alta actividad de la
se detectó CDO1
promotor en HEK293 donde
CDO1
se expresó. Los datos se expresan como veces de incremento sobre la actividad pGL2-básico. Los experimentos se realizaron por triplicado y los valores indican las medias ± SD. Se presentan los valores medios. D. parcela de dispersión de
CDO1
los niveles de metilación en tejidos y líneas celulares (CL) (izquierda). Los valores de metilación TaqMan (TaqMeth V) se describe en Materiales y Métodos. TaqMan-MSP se realiza en formato duplicado, y los experimentos se repitieron dos veces. Los datos mostraron resultados reproducibles y concordantes. PT, CRC primaria; PN, emparejado tejidos de colon normales de pacientes con cáncer de colon; NN, el epitelio de colon normal a partir de pacientes sin cáncer. Línea indica el valor de corte óptimo para
CDO1
ha calculado a partir del análisis ROC. el número de muestras que muestran TaqMeth V sobre la línea de corte se indican. El TaqMeth V global detectado en PT fue significativamente mayor que la de PN (derecha). valor TaqMan de dos NN (22%, 2/9) estaba por encima del valor de corte (24,56 y 17,86 cada uno), lo que sugiere que un bajo nivel de CDO1 metilación puede ser causada por otros mecanismos desconocidos. E, análisis de la curva ROC de TaqMeth V de
CDO1
en el CCR. El área bajo la ROC (curva ROC) transmite la precisión en la distinción de colon normal correspondiente (PN) de CRC (PT) en términos de su sensibilidad y especificidad (
P & lt; 0,001
). línea continua,
CDO1
; línea discontinua, sin discriminación. F, los niveles de metilación de lo normal (PN) y los tejidos tumorales (PT) en pacientes individuales.

Para investigar si
CDO1
expresión está regulada por la metilación del promotor, se realizaron búsquedas de las islas CpG en el
CDO1
promotor mediante el uso del software accesible en línea Methprimer (http://www.urogene.org/methprimer/index1.html).
CDO1
alberga una isla CpG en el promotor proximal al sitio de inicio de transcripción (TSS) (Fig. S1 A). Se analizó el estado de metilación de la isla CpG en 5 líneas celulares (CRC HCT116, HT29, DLD-1, SW480 y RKO) y 4-tejidos tumorales adyacentes normales que aparecen (PN) de bisulfito-secuenciación. La isla CpG fue metilado densamente en las líneas celulares de CRC, pero no en tejidos de colon normales (Fig S1B & amp;. 1B). La desmetilación parcial de la isla CpG después de 5-Aza-dC tratamiento en las líneas celulares también se confirmó por análisis de bisulfito-secuenciación (datos no mostrados). También se realizó COBRA en paralelo con el bisulfito de secuenciación para corroborar
CDO1
metilación en 10 pares de seleccionados al azar corresponde tumor (PT) y tejidos de colon normales (PN) (Fig. S1C). La frecuencia de
CDO1
metilación en tumores (7/10, 70%) fue mayor que en los tejidos normales (1/9, 11,11%) correspondiente. Para analizar la
CDO1
estado de metilación en tumores primarios, se examinaron 21 pares de PT y PN por bisulfite secuenciación. De acuerdo con nuestros criterios para determinar
CDO1
metilación en líneas celulares y tejidos de bisulfito-secuenciación (se describe en Materiales y Métodos), la frecuencia de
CDO1
metilación en tumores fue del 100% (21 /21) y que en la metilación normales fue del 0% (0/21), lo que indica que
CDO1
se hypermethylated en el CCR (fig. 1B). Representante resultados de secuenciación con bisulfito de
CDO1
se muestran en la Figura S1D.

Para dilucidar el papel de la metilación del ADN en la regulación de
CDO1
expresión, hemos hecho dos indicador de luciferasa construcciones (pGL2-
CDO1 CD -#1 y -#2) que contiene diferentes partes de la
CDO1
secuencias promotoras (posición -1100 pb a 104 pb para#1, y -430 pb a 104 pb para el#2) (Fig. 1C, superior). plásmidos pGL2-luciferasa vacías fueron transfectadas para la actividad de simulacro. Estamos transfectadas estas construcciones en dos líneas celulares;
células HCT116 CDO1
-negativos y las células
CDO1
-positivo HEK293. Actividad de la
CDO1
promotor fue mínimo en las células HCT116, pero se detectó un alto nivel de actividad promotora en células HEK293 (Fig. 1C, inferior). Además, tanto pGL2-
CDO1 CD -#1 y -#2 construcciones tenían niveles similares de
CDO1
actividad promotora en células HEK293, pero la inducción de la metilación de CpG con
Sss
I metilasa antes de la transfección disminución de la actividad a un nivel mínimo. Estos resultados indican que la metilación del ADN de la isla CpG juega un papel importante en el silenciamiento de genes de
CDO1
.

Para estudiar la metilación del promotor de la
CDO1 fotos: por cuantitativa TaqMan-MSP análisis, hemos diseñado cebadores y una sonda dirigido específicamente a la isla CpG en el
CDO1
promotor (Fig. S1 a). Hemos aumentado el número de muestras a 100 pares de CRC primaria (PT) y los correspondientes tejidos normales del colon (PN). Nueve tejidos normales mucosa del colon de pacientes sin cáncer (NN) se incluyeron para comparar la especificidad de metilación entre los pacientes con cáncer y no cancerosas. También se incluyeron 5 CRC líneas celulares que fueron analizadas previamente en el análisis TaqMan-MSP. La distribución de los valores de metilación (valores de metilación TaqMan, TaqMeth V) muestran un patrón específico de cáncer clara; siendo estadísticamente diferente entre PT y PN (Fig. 1D, izquierda). Debido a los parches clonales heterogéneos conocidos expandirse más allá de los límites del tumor, también se observa con frecuencia un bajo nivel de metilación en el PN. El nivel de metilación global de
CDO1
detectó en PT (38.42 ± 22.97, media ± DE, n = 100) fue significativamente mayor que los de PN (5,00 ± 6,51, media ± DE, n = 100) (
P & lt; 0,0001, Wilcoxon-Mann-Whitney
) (figura 1D, derecha).. La metilación del
CDO1
gen en el tejido mostraron perfiles característicos de la curva altamente discriminativo receptor-operador (ROC), distinguiendo claramente PT de la NP (Fig. 1E). El área bajo la ROC (curva ROC) fue 0,962 ± 0,0138 (
P & lt; 0,001
). Con el fin de maximizar la sensibilidad y especificidad, el punto de corte óptimo para la metilación del
CDO1
gen se calculó a partir del análisis ROC (valor, 12.50) (PT
vs
. PN). En este punto de corte, la especificidad óptima fue de 93% y la sensibilidad fue del 91% (
P & lt; 0,001
,
exacta
test de Fisher). Además de una frecuencia simple, la comparación de los niveles de metilación de PN y PT de los mismos pacientes individuales reveló que la mayoría de PT albergaba valores mucho más altos de PN (
P & lt; 0,0001, Wilcoxon-pares-filas firmados
prueba) (Fig. 1F). Un alto nivel de
CDO1
promotor de la metilación también se encontró en líneas celulares de CRC (5/5, 100%), en consonancia con el bisulfito de secuenciación y los resultados de COBRA. Estos resultados indican que
CDO1
es el cáncer, específicamente metilado en el CCR con alta frecuencia.


CDO1
está metilado en múltiples tipos de cáncer humano

Para investigar el estado de metilación de
CDO1 Hoteles en otros tipos de tejidos, se realizó TaqMan-MSP en el
CDO1
promotor en los tejidos primarios derivados de mama, esófago, pulmón, vejiga y estómago. Como se muestra en la Figura 2A, el
CDO1
promotor fue altamente metiladas en los tumores de todos los tipos de tejidos analizados. muestras de mama consistieron en un no tumorigénicos (MCF-12A) y 5 líneas celulares de cáncer (BT20, MDA-MB-231, MCF-7, Hs748.T, Hs578.T), y 3 tipos de tejidos primarios (34 PT, 10 PN, y 10 NN). Veinte y siete de cada 34 (79%) PT mama valores albergaron por encima del valor de corte óptimo de 10, y no tejidos normales de mama de pacientes con (PN) o sin cáncer (NN) estaban por encima del valor (0%). El nivel de
CDO1
metilación en las células MCF-12A estaba por debajo de la línea de corte.
CDO1
promotor fue también muy metilado en el cáncer de vejiga. Cuarenta y tres de cada 55 (78%) de la vejiga PT valores albergaron por encima del valor de corte óptimo de 5, y sólo dos muestras de los 32 (6,2%) los tejidos normales de la vejiga estaban por encima del valor de corte. análisis de la curva ROC genera los valores óptimos de corte (Fig. 2B), así como la máxima sensibilidad y especificidad para cada tipo de cáncer. El valor medio de TaqMeth V, AUROC, valores de corte,% de sensibilidad y especificidad, y los valores de p de análisis estadístico en cada tipo de muestras se muestran en la Tabla 1. La sensibilidad y la especificidad de
CDO1
había terminado 78% en PT y más de 90% en PN, respectivamente, en todos los tipos de tejidos probados. Estos resultados muestran que
CDO1
es comúnmente metilado en múltiples tipos de cáncer humano. Las características clínico-patológicas de los pacientes analizados en este estudio no estaban disponibles.

, los niveles de metilación cuantitativos de
CDO1
se determinaron en los tejidos primarios derivados de mama, esófago, pulmón, vejiga y estómago. Los valores de metilación TaqMan (TaqMeth V) se describe en Materiales y Métodos. PT, tumor primario; PN, corresponde tejidos normales; NN, los tejidos normales de los pacientes que no tienen cáncer; CL, las líneas celulares. Las líneas indican el valor de corte óptimo para cada tejido. Flecha, MCF-12A, una línea de células no tumorigénicas, albergaba un bajo nivel de
CDO1
metilación (TaqMeth V, 6,2). Todos los ensayos se realizaron en formato duplicado, y los experimentos se repitieron dos veces. Los datos mostraron resultados reproducibles y concordantes. B, el análisis ROC (PT
vs
. PN) de
CDO1 Hoteles en múltiples cánceres humanos. línea continua,
CDO1
; línea discontinua, sin discriminación.


CDO1
es silenciada en líneas celulares de cáncer y re-activado por Farmacológica La desmetilación

A continuación, examinó el nivel transcripcional de
CDO1
por RT-PCR y QRT-PCR análisis en líneas celulares de cáncer derivadas de mama, esófago, pulmón, vejiga, y el estómago, y en líneas de células no tumorigénicas (HEK293 y MCF-12A). La expresión basal de
CDO1
fue apenas detectable en líneas celulares de cáncer, pero se observó la expresión más fuerte en HEK293 y débilmente en líneas celulares MCF-12A (Fig. 3A). También se examinó el estado de metilación de la
CDO1
promotor en cada línea celular mediante secuenciación con bisulfito, y encontraron que las líneas celulares de cáncer con
CDO1
pérdida albergaban una metilación densa en el
CDO1
promotor (indicado como M).
CDO1
metilación no se observó en las células HEK293 (U), y los alelos metilados y no metilados fueron encontrados en las células MCF-12 (M /T). Además, el 5-aza-DC tratamiento reactivó el
CDO1
expresión en la mayoría de las líneas celulares de cáncer (las excepciones fueron A549 y H1828), lo que indica que la expresión transcripcional de
se correlaciona fuertemente con CDO1
promotor metilación.

, la expresión de
CDO1 Hoteles en líneas celulares fue examinado por RT-PCR o QRT-PCR análisis. m, el tratamiento simulado. a, tratamiento con 5-Aza-dC (5 M durante tres días). β-actina se utilizó como control de carga. estado de metilación de
CDO1
promotor en cada línea celular se examinó y se indica como M para la metilación, U para no metilación, y M /T para la co-existencia de alelos metilados y no metilados.
CDO1
era completamente metilado en todas las líneas celulares de cáncer ya que sólo se observaron picos de citosina en CpG secuenciados (100% de metilación), mientras que no fue metilado en HEK293 ya que sólo se observaron picos de timidina (0% de metilación).
CDO1
fue parcialmente metilado en las células MCF-12A ya que se observaron alelos metilados y no metilados tanto en 10 CpG de la
CDO1
promotores examinados. Cuando un pico citosina se compararon con un pico de timidina en cada CpG de los 10 CpG, los picos de citosina eran dominantes (metilado), pero dado que estos "CpG metilados" se encontraron en menos de 50% de CpG totales (10/34), se fue considerado como "metilación-negativo" de acuerdo con los criterios descritos en Materiales y Métodos. B. QRT-PCR se realizó en ADNc derivados de pacientes con cáncer de colon, de mama, esófago, vejiga y estómago (T) y los pacientes sin cáncer (NN) (superior). expresión relativa (veces) se calculó mediante la comparación de las proporciones de la expresión de ARNm de
CDO1
a un gen de control interno, β-actina. El
CDO1
nivel de expresión se determinó en 10 pacientes con cáncer de pulmón y 10 pacientes sin cáncer (inferior). 2 - () * 100, la expresión de
CDO1
en relación con ß-actina calculada en base al ciclo umbral (C
t) 2
-ΔCt (Ct = C
t,
CDO1 CD - C
t, β-actina). Los experimentos se realizaron por duplicado, y los valores indican las medias ± SD. *,
P & lt; 0,05 Hoteles en
T-
prueba. C, La
CDO1
nivel de expresión se examinó en cinco pares (A ~ E) de ADNc emparejados preparados a partir de pacientes con cáncer de colon y cáncer de pulmón. PT, tumor primario; PN, igualó los tejidos normales.

Para examinar la expresión de
CDO1
en el cáncer primario, se realizó un análisis de QRT-PCR con ADNc derivados de pacientes con cáncer de colon, mama, esófago, vejiga y el cáncer de estómago (T, n = 1 para cada tumor) y pacientes sin cáncer (NN, n = 1 para cada normal).
CDO1
fue drásticamente reducido regulado en T en comparación con NN (Fig. 3B, superior). El valor medio global de la
CDO1
nivel de expresión de cada 10 pacientes sin cáncer fue de alrededor de 2,5 veces más alta (19,14 ± 21,56) que en 10 pacientes con cáncer de pulmón (8,03 ± 9,20) (Fig. 3B, inferior). También se realizó qRT-PCR en 5 pares de cDNA preparado a partir de tumor emparejados (PT) y los tejidos normales correspondientes (PN) de colon y cáncer de pulmón. Los cinco casos de tumores de tejido del colon exhibido
CDO1
regulación a la baja, y 3 de 5 casos de tejido pulmonar visualizan los niveles de
CDO1 reducidos Hoteles en comparación con PT PN (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que la disminución específica de
CDO1
ARNm es un evento común en el desarrollo del cáncer humano.


CDO1
expresión también se examinó el uso de perfiles cáncer de matriz II, que incluye ADNc normalizado de los tejidos emparejados no cancerosas (normales) para 19 tipos diferentes de cánceres de tumores y. Como se demuestra en la Figura 4,
CDO1
expresión se detectó claramente en la mayoría de los tejidos normales correspondientes (N) de la matriz, y regulados hacia abajo en los tumores en más de 50% de los pacientes con cáncer de colon, estómago, páncreas, tiroides , piel, riñón, vejiga, pulmón, mama, ovario, útero, cuello uterino y cáncer de vulva. A la inversa, un aumento de
CDO1
en los tumores se observó en menos de 20% de los pacientes con estos tipos de cáncer (Tabla 2). En el cáncer de pulmón, los tumores (100%, 10 de 10) muestran baja regulación de
CDO1 gratis (Fig. 4, parte superior), mientras que la expresión de
CDO1
en el hígado era demasiado alto para comparar entre los tejidos normales y tumorales (no determinado, s /f). Además, una alta frecuencia de
CDO1
baja regulación (& gt; 80%). Se observó principalmente en las muestras procedentes de pacientes de sexo femenino con cáncer (de mama, ovario, útero, cuello del útero y vulva) (Fig 4, menor ). Por lo tanto,
CDO1
es downregulated en varios cánceres humanos, particularmente en cánceres de los órganos femeninos.

Cáncer matrices de perfiles II se realizó para comparar
CDO1
expresión entre el tumor (T) y el control normal correspondiente (N) tejidos de múltiples tipos de tejidos. La matriz se hibridó con el
CDO1
sonda de ADNc marcada con
32P-α-desoxicitidina trifosfato de acuerdo con el protocolo del fabricante. El tipo de tejido y el número de casos con baja regulación de
CDO1 vs.
se indican el total de casos. Flecha, regulación a la baja de
CDO1
en el tumor en comparación con el tejido normal. La ubiquitina cDNA (Ubi) se utilizó como control. n /d, no determinado.

Para investigar la expresión de proteínas de
CDO1
, se realizó inmunohistoquímica (IHC) tinción utilizando tanto las matrices de tejido de colon y esófago normal y con cáncer tejidos. En la matriz de tejido normal de múltiples órganos que incluyen tejidos no malignos (NN) derivado de esófago, estómago, hígado, colon, pulmón y mama (# BN00011), se observó la expresión de la proteína CDO1 en todos los tejidos no malignos; CDO1 expresión fue positiva en 6 de cada 6 casos para todos los tipos de tejidos con una sola excepción en el pecho (4 de cada 6 casos) (datos no mostrados). Figura 5A y Figura S2A muestran los resultados representativos de tres casos positivos de cáncer de colon no maligno (NN1 ~ NN3). Además, entre los 36 grupos de muestras consistentes de los adenocarcinomas (AD), emparejado cáncer adyacente de tejido de aspecto normal (NAT) y los tejidos adyacentes cáncer emparejado (adyacente) en cada grupo que se deriva de 36 pacientes con cáncer de colon individuales (# BC05021 y#BC05022 ), la baja regulación de CDO1 se observó en 25 casos de EA en comparación con NAT o tejido adyacente (69%) (figura 5B & amp;.. figura S2 B). Cinco casos de 36 AD muestran sobre regulación de CDO1, pero los otros seis casos mostraron ninguna diferencia entre AD, NAT y los tejidos adyacentes (datos no mostrados). La alta frecuencia de disminución de la expresión CDO1 también se observó en 33 de los 40 casos de la CECA (PT) en comparación con los tejidos normales emparejados que aparecen (PN) (82%) (Fig 5C & Amp;. Figura S2C). Sólo dos casos de la CECA exhiben una mayor expresión CDO1, y cinco casos no mostraron diferencias entre PT y PN (datos no mostrados) (# ES801). entonces la expresión CDO1 se analizó en el adenocarcinoma de colon con diferentes grados de tumor y NAT (# BC05118 y#CO1922). proteína CDO1 se detectó en 41 de 41 casos (100%) de NAT, mientras que AD presentan CDO1 positividad fue de un 40% (37% & amp; 44%, respectivamente) (Fig 5D & amp;. Tabla 3). expresión débil o ausente de CDO1 en el año fue estadísticamente significativa cuando se compara con NAT en ambas matrices (
P & lt; 0,001
), y la expresión ausente de CDO1 en AD mucinoso (84%, 32/38) también fue estadísticamente significativo (
P & lt; 0,001
). expresión CDO1 se detectó en 30 de 30 casos (100%) de los tejidos no malignos de esófago (normal, la inflamación y la hiperplasia), mientras que no se observó expresión ausente o débil del CDO1 en 35 de los 49 casos (71%) de los tejidos neoplásicos (Tabla 4) (# ES804). Cuando se compara con tejido del esófago normal, la expresión negativa de CDO1 en AD esofágico (80%, 16/20) (
P & lt; 0,001
), SCC (55%, 9/20) (
P & lt; 0,001
), y el cáncer metastásico (89%, 8/9) (
P & lt; 0,001
) fue estadísticamente significativa, pero esto no fue el caso en la hiperplasia (100%, 10/10) (fig. 5E).

, fuerte expresión de
CDO1
en tejidos de colon no malignas. La expresión de
CDO1
proteína fue positiva en 6 de cada 6 pacientes. NN1, un paciente sin cáncer, y dos más de los casos se muestran en la Figura S2A. B, un grupo de muestras se obtuvieron a partir de un único paciente consistirá en adenocarcinomas de colon (AD), el cáncer de los tejidos adyacentes emparejado apariencia normal (NAT) y los tejidos adyacentes cáncer emparejados (adyacente).
CDO1
expresión se investigó en un total de 36 grupos de muestras. Los pacientes fueron numerados arbitrariamente (Pt1 ~ PT3). CRC Pt1, un paciente con CRC. Dos más casos se muestran en la Figura S2B. C,
CDO1
expresión en CECA. PT, la CECA; PN, igualó tejidos de apariencia normal. CECA Pt1, un paciente con CECA. Otros tres casos se muestran en la Figura S2C. D,
CDO1
expresión en adenocarcinoma de colon (AD) con diferentes grados de tumor. Mu-AD, adenocarcinomas mucinosos. E,
CDO1
expresión en CECA con diferentes grados de tumor. EAD, adenocarcinoma esofágico; Me-CECA, la CECA metastásico.


CDO1
Controles tumorigenicidad de células de cáncer humano
in vitro
y
in vivo

Para conocer la función de
CDO1
y la consecuencia de una pérdida de
actividad CDO1
, lo primero que examinó las propiedades de crecimiento de líneas celulares de cáncer con o sin expresión forzada de
CDO1
. HCT116 y DLD-1 de células líneas, que no expresan
CDO1
gen al inicio del estudio, se seleccionaron para
CDO1
la entrega de genes transitoria. Se realizó el ensayo de MTT para comparar el crecimiento celular con o sin expresión de
CDO1
. Las células de control que no expresaban
CDO1
crecieron consistentemente durante 3 días de incubación, pero el crecimiento de
CDO1
que expresan las células HCT116 y DLD-1 disminuyó al 42% y el 27% del control células, respectivamente (Fig. S3A). Sin embargo, la expresión ectópica de
CDO1
no tuvo ningún efecto sobre la morfología celular (datos no presentados). β-actina se utilizó como control de carga.
P-valores
& lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa.