Extracto
factor de crecimiento epidérmico inhibidores de la tirosina quinasa del receptor (EGFR-TKIs), incluyendo gefitinib, son eficaces para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) pacientes con
EGFR
mutaciones. Sin embargo, estos pacientes eventualmente desarrollan resistencia a EGFR-TKI. El objetivo del presente estudio fue investigar la implicación de la autofagia en la resistencia a gefitinib. Desarrollamos células resistentes a gefitinib-(PC-9 /GEF) a partir de células PC-9 (que contienen el exón 19 de eliminación
EGFR
) después de la exposición a largo plazo en el gefitinib. gef células PC-9 /(B4 y E3) eran 200 veces más resistentes a gefitinib que PC-9 /WT células. En comparación con 9 PC-células WT /, tanto 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 y demostraron niveles más altos basales LC3-II que fueron inhibidas por 3-metiladenina (3-MA, un inhibidor de la autofagia) y potenciar por cloroquina ( CQ, un inhibidor de la formación de autophagolysosomes), lo que indica la autofagia elevada en 9 PC-GEF /células. 3-MA y CQ dependiente de la concentración de la supervivencia celular inhibida tanto de PC-9wt y 9 PC-GEF /células, lo que sugiere que la autofagia puede ser pro-supervivencia. Por otra parte, aumentó los niveles de gefitinib LC3-II y autolysosome formación tanto en PC-9 células /peso y PC-9 /GEF células. En 9 de PC-células /wt, CQ potenció la citotoxicidad por una baja gefitinib (3 nM). Por otra parte, CQ superó la resistencia a gefitinib adquirida en-9 PC /células gef mediante la mejora de la citotoxicidad inducida por gefitinib, la activación de la caspasa 3 y poli (ADP-ribosa) polimerasa de escisión. El uso de un
in vivo
modelo de xenoinjerto con PC-9 /peso y /gefB4 células, la administración oral de gefitinib (50 mg /kg) 9 PC-inhibió completamente el crecimiento de tumores de PC-9 /peso pero no PC -9 /gefB4cells. Combinación de CQ (75 mg /kg, i.p.) y gefitinib fue más eficaz que gefitinib solo en la reducción del crecimiento del tumor de PC-9 /gefB4. Nuestros datos sugieren que la inhibición de la autofagia puede ser una estrategia terapéutica para superar la resistencia adquirida de gefitinib en
EGFR
mutación pacientes con CPNM
Visto:. Tang MC, Wu MI, Hwang MH, Chang YT, Huang HJ, Lin AM-Y, et al. (2015) La cloroquina Mejora gefitinib citotoxicidad en células no pequeñas células resistentes a gefitinib del cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (3): e0119135. doi: 10.1371 /journal.pone.0119135
Editor Académico: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: 1 de mayo de 2014; Aceptado: 26 Enero 2015; Publicado: 25 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Tang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. NSC 101-2314-B-002 -090 -MY3 por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la autofagia, conocido como un mecanismo de auto-comer, se caracteriza por la síntesis de novo autofagosomas de doble membrana que secuestran componentes celulares, tales como la proteína excesiva o innecesaria y orgánulos [1-3]. La fusión de los lisosomas autofagosomas con los informes, se degrada el contenido citosólico en componentes esenciales para reciclar. Fisiológicamente, un nivel basal de autofagia es vital para la homeostasis celular. Por otra parte, según los informes, la autofagia se indujo a hacer frente a las tensiones tales como la hipoxia, así como la privación de nutrientes y considerada como una estrategia de supervivencia [1-3]. Por el contrario, un papel pro-muerte de la autofagia se propone como una muerte programada de las células de tipo II por el exceso de activación de auto-comer [4]. De hecho, se encontró que los inductores autofagia para reducir el volumen del tumor [5-7]. Sin embargo, la inhibición de la autofagia informes, induce la muerte de células de cáncer [8-10], lo que sugiere que la autofagia juega un papel citoprotector de las células cancerosas. En apoyo de esta noción, la inhibición de la autofagia por 3-metiladenina (3-MA), cloroquina (CQ, un agente para inhibir lysosomotropic autophagolysosome formación) y la autofagia (ATG) del gen -related 5 silenciamiento fue encontrado para aumentar los efectos citotóxicos de la quimioterapia y La terapia de destino [11-16]. En consecuencia, la autofagia se convierte en un blanco potencial para tratamientos contra el cáncer.
La resistencia a fármacos ha sido un foco de interés en el estudio de la terapia del cáncer. Varias líneas de evidencia han sugerido la participación de la autofagia en resistencia a los medicamentos, tanto resistencia a los medicamentos innato y adquirido resistencia a los medicamentos. Por ejemplo, CQ ha demostrado para superar la resistencia primaria del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) en A549 células de cáncer de pulmón [16] y trastuzumab en HER-2 positivo cáncer de mama [17]. Varios
in vitro
estudios han demostrado que la CQ y bafilomycin A1 restaurar la sensibilidad a crizotinib y trastuzumab en las células resistentes adquiridas, respectivamente [18-19]. Además, 3-MA se encontró para mejorar el efecto citotóxico de cisplatino en las células resistentes al cisplatino [20], lo que indica que la inhibición de la autofagia parece ser una diana terapéutica para la resistencia a fármacos adquirida.
no microcítico de pulmón de células cáncer (NSCLC) es el cáncer más común en el mundo. Actualmente, los receptores de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) inhibidores de tirosina quinasa (TKIs), incluyendo gefitinib, erlotinib y afatinib, son muy eficaces en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón con específica
EGFR
mutaciones en sus muestras de tumores, tales como el exón 19 deleción o exón 21 L858R mutación [21-23]. A pesar del éxito de la utilización de EGFR-TKI en el tratamiento de pacientes con CPNM de Asia Oriental, todos los pacientes que respondieron finalmente desarrollados adquieren resistencia a EGFR-TKI [24-27]. En el presente estudio, la participación de la autofagia en la resistencia a gefitinib adquirida en
EGFR
mutación células de NSCLC se investigó el uso de células PC-9 /peso que transportan
EGFR
exón 19 y la eliminación gefitinib- adquirida resistente al PC-9 /GEF (células PC-9 /gefB4 y PC-9 /gefE3).
Materiales y Métodos
Reactivos y anticuerpos
Los productos químicos utilizados fueron gefitinib (una especie de regalo de Astrazeneca, Alderley Park, Reino Unido), difosfato de cloroquina (CQ; Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), 3-metiladenina (3-MA; Sigma), y Cremophor EL (Sigma). Los anticuerpos primarios incluyen la proteína 1 de la cadena ligera asociada a los microtúbulos 3 (LC3; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.,#2775), caspasa 3 (Cell Signaling Technology,#9668), y PARP (Cell Signaling Technology,#9542) , α-tubulina (Tecnología de Señalización celular,#2144) y el anticuerpo β-actina (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios fueron peroxidasa de rábano conjugada secundaria de IgG (Chemicon, Temecula, CA, EE.UU.).
Desarrollo de gefitinib resistentes a las células PC-9
gefB4 y PC9 células PC9 //gefE3 eran desarrollado en nuestro laboratorio y publicado anteriormente [26]. PC-9 /WT células, una línea celular de adenocarcinoma de pulmón humano que alberga una deleción en el exón 19 del
EGFR
[28], se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C en RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medio que contiene 10% de suero bovino fetal, 4,5 g /L de glucosa y 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina. WT células PC-9 /se hicieron crecer en medios de cultivo que contiene concentraciones crecientes de gefitinib. Después de 6 meses de pasajes, las células que pueden crecer en concentraciones micromolares de gefitinib se mantuvieron en un medio libre de drogas durante 2 semanas y se clonaron. Se obtuvieron dos clones (PC-9 /gefB4, y PC-9 /gefE3) para estudios futuros.
Crecimiento ensayo de inhibición
Las soluciones madre de gefitinib y 3-MA se prepararon de dimetilo sulfóxido mientras estaba en CQ DDSH
2O. Se colocaron quince cientos de células en placas de 96 pocillos de fondo plano y se cultivaron durante 24 h. Para establecer IC
50 de gefitinib, varias concentraciones de gefitinib se incluyeron en el medio de cultivo para 96 h. Uso de sulforrodamina B de ensayo [29], la viabilidad celular se determinó dividiendo los valores de absorbancia de las células tratadas con el de las células no tratadas. IC
50 calculado a partir de la curva de concentración-respuesta se definió como la concentración de gefitinib que se obtuvo una inhibición del crecimiento del 50%. Para los efectos de 3-MA y CQ, la inhibición del crecimiento se midió después de 96 h de incubación de 3-MA (0,1, 0,3 o 1 mM) o CQ (5, 10 o 15 mM). Para el efecto de CQ en la muerte celular inducida por gefitinib, se determinó la inhibición del crecimiento después de 96 h de incubación de gefitinib más CQ (5 o 10 mM).
ensayo de transferencia Western de proteínas
para evaluar la implicación de la autofagia de células PC-9 /peso y gefitinib resistente, las células se trataron con gefitinib plus 3-MA o CQ para 24 h. se recogieron las células tratadas, se lavaron con tampón fosfato salino (PBS), y se lisaron en ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) de tampón de lisis que contiene 20 mM Tris HCl, NaCl 150 mM, 1% (v /v) NP-40, 1% (w /v) de desoxicolato de sodio, mM etilendiaminotetraacetatos 1 (EDTA), 0,1% (w /v) de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS) y 0,01% (w /v) de azida de sodio (pH 7,5) durante 20 min en hielo. Los lisados se centrifugaron a 12.000 rpm durante 10 min, y las concentraciones de proteína de sobrenadante se determinaron mediante Kit de ensayo de proteínas BCA. Las muestras de proteína (30 mg) se realizaron en la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS 12 a 13,5% y después se transfirieron a un difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad, EE.UU.) a 90 V durante 120 min. Las transferencias se sondearon con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación del anticuerpo primario, la membrana se lavó y se incubó con un anticuerpo secundario (1: 3000) durante 1 h a temperatura ambiente. La inmunorreacción se visualizó usando Amersham aumento de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.). Después de esta detección, los anticuerpos primario y secundario unidos se eliminan mediante la incubación de la membrana en tampón de extracción (100 mM 2-mercaptoetanol, 2% SDS) a 50 ° C durante 45 min. La membrana se volvió a sondear con un anticuerpo primario contra la β-actina (1: 5.000) /α-tubulina (1: 5000).
fluorescente y ensayo de tinción de inmunofluorescencia
autolisosomas de tinción: Las células se trataron con gefitinib durante 24 h y luego se sustituyó el medio por medio fresco que contiene 50 nM Lysotracker Red (LysoTR, LysoTracker Red DND-99, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se incubó a 37 ° C durante 30 min. Después, se lavaron las células en PBS y se fijaron con 3,5% de paraformaldehído (en PBS) durante 10 min, se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en TBS durante 30 min, y se tratan con 2% de BSA en TBS durante 1 h, a temperatura ambiente . Las muestras luego se incubaron con anticuerpo LC3 (1: 200) durante la noche a 4 ° C, se enjuagaron tres veces con Triton X-100 en TBS, y se incubaron durante 30 min con un anticuerpo secundario (IgG de conejo conjugado con FITC 0,01% a 1: 250 ) a 37 ° C. Posteriormente, las células se tiñeron con DAPI y se observaron bajo una microscopía confocal (Olympus FV1000, Olympus America Inc., Center Valley, PA, EE.UU.).
xenoinjerto de ratón modelo
El sesenta y tres 6 -Semana de edad, de sexo masculino ratones Balb /c desnudos, con un peso 25-30 g, se utilizaron. El protocolo animal fue aprobado por el Comité Institucional de animales Cuidado y Uso de Taipei el Hospital General de Veteranos de Taipei, Taiwán. (Número de Permiso: 2011-037) .Tumors fueron inducidos mediante la inyección de PC-9 /peso y PC-9 /gefB4 células (10
7 células en 100 l de PBS) por vía subcutánea en la parte posterior de los ratones. Para obtener la curva de crecimiento del tumor, se realizó la medición diaria de tumor. diámetro perpendiculares con un calibre digital y los volúmenes se calcularon (largo x ancho
2) /2. Cuando los tumores crecieron hasta 200 mm
3, los ratones fueron asignados al azar a 4 grupos tratados por vía oral con vehículo (10% Cremophor EL /10% de etanol /4% de dextrosa en ddH
2O), gefitinib solo (50 mg /kg, por una sonda), CQ solo (75 mg /kg, ip) y gefitinib más CQ. Gefitinib se preparó en 10% Cremophor EL /10% de etanol /4% de dextrosa y CQ se disolvió en PBS.
Estadísticas
Todos los datos se expresan como la media ± S.E.M. Las comparaciones estadísticas de la viabilidad celular se realizaron con muestras independientes prueba de la t de SPSS. valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
autofagia basal elevada en PC-9 /GEF células
Para estudiar la autofagia y la resistencia a los medicamentos, el nivel de LC3-II, una proteína característica de la autofagia, se midió en /wt, células PC-9 /gefB4 y PC-9/9 gefE3 PC. ensayo de transferencia Western mostró niveles basales más elevados de LC3-II en PC-9 /células gef (B4 y E3), mientras que en comparación con las células WT PC-9 /(Fig. 1A). En consonancia con el ensayo de transferencia Western, el estudio demostró inmunotinción más LC3 inmunofluorescencia puntos lagrimales en el PC-9 /gefB4 células en comparación con PC-9 /WT células (fig. 1B). Además, se emplearon 3-MA y CQ para caracterizar la autofagia. Se encontró que el 3-MA disminuyó (Fig. 1C), mientras que CQ aumentó los niveles basales LC3-II en PC-9 /peso,-9 PC /gefB4 células y PC-9 /gefE3 después de los tratamientos de drogas de 24 h (Fig. 1D ). Estos datos indican que el PC-9 /GEF células (E3) B4 y tienen un nivel basal más alto de la autofagia de 9 PC-células WT /. Además, se empleó el ensayo de supervivencia de células para delinear el papel de la autofagia usando 3-MA y CQ. ensayo de SRB mostró que 3-MA y CQ dependiente de la concentración reducen la supervivencia celular en PC-9 /peso, PC-9 /gefB4 y 9 PC-células /gefE3 (Fig. 2), lo que sugiere que la autofagia juega un papel pro-supervivencia en la proliferación celular.
(A) Western blot datos representativos mostraron los niveles basales LC3-II-9 en células PC /GEF (B4) y E3 PC-9 /peso y. Se llevaron a cabo (B) Estudios de la tinción de inmunofluorescencia usando anticuerpos LC3 LC3 para mostrar puntos lagrimales en el PC-9 /peso y PC-9 /gefB4 células. (C y D): PC-9 /peso, 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 y se trataron con 3-metiladenina (3-MA, 10 mM) y la cloroquina (CQ, 1 y 10 mM) para 24 marido. Se recogió la proteína total de las células tratadas; niveles LC3-I y II se analizaron con el ensayo de transferencia Western. Cada carril contenía 30 g de proteína para todos los experimentos. Los resultados se repitieron en experimentos independientes.
PC-9 /p, 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 y fueron tratados con (A) 3-MA (0,1-1 mM) y (B) CQ (5-15 mM) durante 96 h. La viabilidad celular se determinó usando el ensayo de SRB. Los valores son la media ± S.E.M. (N = 3). *
P Hotel & lt; 0,05 estadísticamente significativas en el 3-MA o tratada CQ-grupos en comparación con los controles.
autofagia inducida por gefitinib
in vitro
La participación de la autofagia en las se investigó la citotoxicidad inducida por gefitinib. ensayo de transferencia Western mostró que la concentración de manera dependiente de gefitinib aumento de los niveles LC3-II de la PC-9 /peso, PC-9 /gefB4 y 9 PC-células /gefE3 (Fig. 3A). Los estudios de tinción de inmunofluorescencia demostraron que 24 h de incubación de gefitinib (con 1 m) elevados puntos lagrimales LC3 tanto en PC-9 /gefB4 células PC-9 /peso y (Fig. 3B). Además, se observó co-localización de inmunofluorescencia LC3 y la fluorescencia LysoTR en PC-9 /gefB4 células PC-9 /WT y gefitinib tratados (Fig. 3B), lo que indica que gefitinib es capaz de inducir la autofagia y autolysosome formación.
(a) PC-9 /peso, las células PC-9 /gefB4 y PC-9 /gefE3 fueron tratados con gefitinib (nM) a diversas concentraciones durante 24 h. Se recogió la proteína total de las células tratadas; niveles LC3-I y II se analizaron con el ensayo de transferencia Western. Cada carril contenía 30 g de proteína para todos los experimentos. Los resultados se repitieron en experimentos independientes. (B) PC-9 /peso y PC-9 /gefB4 células fueron tratados con gefitinib (1 M) durante 24 h. La tinción inmunofluorescente y los estudios de tinción fluorescente se realizaron con anticuerpo LC3 y rojo LysoTracker (LysoTR), respectivamente para mostrar puntos lagrimales en las células. Verde, LC3 marcado con FITC; rojo, LysoTR; azul, marcado con DAPI núcleo.
Debido a la autofagia gefitinib-elevado, se investigó el efecto de CQ en la citotoxicidad inducida por gefitinib. Veinticuatro horas después de los tratamientos con fármacos, CQ aumentaron aún más los niveles LC3-II gefitinib inducida en PC-9 /peso y PC-9 /gefB4 células (Fig. 4A). estudios de supervivencia celular demostraron que gefitinib (100 nM) solo indujo la muerte celular profunda de 9 PC-células WT /; sin embargo, CQ (5 y 10 mM) fue incapaz de mejorar aún más la citotoxicidad inducida por gefitinib (Fig. 4B). En cuanto a PC-9 /gefB4 células, gefitinib (100 nM) solo indujo un ligero muerte celular; CQ potenció significativamente la citotoxicidad inducida por gefitinib (Fig. 4C), es decir, CQ superó la resistencia a gefitinib en /gefB4 células PC-9. A fin de probar la potenciación de CQ en el PC-9 /peso de las células, baja dosis de gefitinib (3 nM) fue empleado. Mientras que 96 h de incubación de gefitinib (3 nM) indujo una citotoxicidad significativa en PC-9 /células WT, co-incubación con CQ (10 nM) y gefitinib reduce profundamente la supervivencia de las células (Fig. 4D). La potenciación CQ-inducida de la citotoxicidad inducida por gefitinib se investigó adicionalmente mediante la medición de las proteínas relacionadas con la apoptosis, incluyendo los niveles (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) caspasa-3 y poli. Se encontró que el gefitinib (0,1 M) que muestra la apoptosis inducida por la activación de la caspasa 3 y la escisión de PARP en células PC-9 WT /; CQ (10 M) consistentemente no aumentar la apoptosis inducida por gefitinib en-9 PC /células WT (Fig. 5). En contraste, cuando gefitinib o CQ solo fue incapaz de inducir la apoptosis en PC-9 /gefB4 y-9 PC /gefE3 células, CQ más gefitinib inducida significativamente activación de caspasa 3 y PARP escisión tanto en las células /GEF PC-9 (Fig. 5 ).
(a) de PC-9 /peso y PC-9 /gefB4 fueron tratados con gefitinib (100 nM) y la cloroquina (CQ, 5, 10 mM) durante 24 h. Se recogió la proteína total de las células tratadas. niveles LC3-II se analizaron con el ensayo de transferencia Western. Cada carril contenía 30 g de proteína para todos los experimentos. Los resultados se repitieron en experimentos independientes. (B) PC-9 /peso y (C) PC-9 /gefB4 células se cultivaron con gefitinib (100 nM) y CQ (5, 10 mM) durante 96 h. (D) PC-9 /WT células se cultivaron con gefitinib (3 nM) y CQ (5, 10 mM) durante 96 h. La viabilidad celular se determinó usando el ensayo de SRB. Los valores son la media ± S.E.M. (N = 3). *
P Hotel & lt; 0,05 estadísticamente significativa en el gefitinib o grupos CQ tratados en comparación con los controles;#P & lt; 0,05 estadísticamente significativa en gefitinib más grupos CQ tratados con gefitinib en comparación con sólo grupos.
PC-9 /p, 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 y fueron tratados con gefitinib (100 nM ) y la cloroquina (CQ, 10 M) durante 24 h. Se recogió la proteína total de las células tratadas. Procaspasa 3, caspasa activa 3, los niveles de escisión de PARP se analizó con el ensayo de transferencia Western. Cada carril contenía 30 g de proteína para todos los experimentos. Los resultados se repitieron en experimentos independientes.
potenció la actividad antitumoral inducida por gefitinib gefitinib más CQ en xenoinjertos PC-9 /gefB4
La potenciación inducida por CQ del antitumoral actividad de gefitinib se investigó adicionalmente usando ratones Balb /c ratones desnudos con 9 PC-xenoinjertos de tumores humanos /gefB4 PC-9 /peso y (Fig. 6). CQ solo no alteró el crecimiento del tumor de 9 PC-xenoinjertos de tumor PC-9 /WT y /gefB4 humanos (Fig. 6). En comparación con el crecimiento del tumor tratado con vehículo, la monoterapia gefitinib inhibió significativamente el crecimiento tumoral de xenoinjertos en peso de PC-9 /; co-administración de CQ fue incapaz de aumentar el efecto anti-tumor por gefitinib en PC-9 /xenoinjertos WT (Fig. 6A). La inhibición completa del crecimiento tumoral de xenoinjertos en peso de PC-9 /duró hasta el final del experimento (Fig. 6A). Por el contrario, gefitinib reduce de forma insignificante el crecimiento de tumores de xenoinjertos de PC-9 /gefB4 en comparación con la de xenoinjertos de PC-9 (Fig 6B;. P = 0,07). PC-9 /gefB4 tumores crecieron de nuevo después de 15 días de la administración de gefitinib (Fig. 6B). Sorprendentemente, CQ más gefitinib suprimió significativamente el crecimiento del tumor de PC-9 /gefB4 xenoinjertos en comparación con gefitinib solamente (Fig 6B;. P & lt; 0,05)
/c ratones desnudos Balb teniendo PC-9 /peso (A. ) y PC-9 /gefB4 (B) xenoinjertos fueron tratados con vehículos como control (○, n = 4 para PC-9 /peso y PC-9 /gefB4, respectivamente), gefitinib (50 mg /kg /día por una sonda nasogástrica , ◆; n = 5 para gefB4 PC-9 /peso y PC-9 /, respectivamente), cloroquina (CQ, 75 mg /kg, ip ▲; n = 4 por peso y PC-9 PC-9 //gefB4, respectivamente), o una combinación de ambos (■; n = 5 para PC-9 /peso y PC-9 /gefB4, respectivamente) se les permitió .Tumors a crecer a 200 mm
3 antes de los tratamientos de drogas. Los valores son la media ± S.E.M. (N = 4-5). ** P & lt; 0,001, estadísticamente significativa en gefitinib y grupos gefitinib más CQ en comparación con el grupo vehículo en xenoinjertos-9 PC /tumorales en peso. * P & lt; 0,05, estadísticamente significativa en gefitinib más CQ grupo en comparación con el grupo de vehículo;#P & lt; 0,05 estadísticamente significativa en gefitinib más CQ grupo en comparación con gefitinib solo en PC-9 /gefB4 xenoinjertos de tumores por T para muestras independientes de prueba. (C) Los datos representativos muestran 4 ratones con xenoinjertos PC-9 /peso y 4 ratones con xenoinjertos PC-9 /gefB4 que fueron tratadas con vehículo, CQ solamente, gefitinib solamente y gefitinib más CQ.
discusión
la autofagia y la resistencia a los medicamentos
para desarrollar estrategias terapéuticas para la resistencia adquirida inducida por gefitinib, se utilizó PC-9/9 gefB4 y PC-células /gefE3 que poseen IC
50 de gefitinib aproximadamente 200 veces más que la de PC-9 /WT células [26]. Western blot y el estudio de inmunofluorescencia demostraron niveles más altos basales de la autofagia en tanto 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 y. El uso de 3-MA y CQ para impedir la formación y la función de la autofagia, se propone el mecanismo para la autofagia basal elevada en células gefitinib-resistente. Para hacer frente a las tensiones desfavorables, es decir, la exposición constante a gefitinib, las células cancerosas aumentan la autofagia para mantener la homeostasis metabólica y el crecimiento celular apropiado [4]. ensayo de viabilidad celular reveló que la autofagia era pro-supervivencia, ya 3-MA y CQ disminución de la supervivencia celular de las células PC-9 GEF /PC-9 /peso y (B4 y E3). Además de la resistencia gefitinib, estudios anteriores han informado de que las células de cáncer de mama refractario trastuzumab y células de cáncer de pulmón resistentes al cisplatino tienen mayor autofagia en comparación con las células cancerosas sensibles [19-20]. Del mismo modo, se encontraron 3-MA y bafilomicina A1 (un inhibidor de la maduración autolysosome) para reducir la viabilidad celular de estas células resistentes [19-20]. En contraste con la diferencia de 200 veces en la IC
50 de gefitinib [26], 3-MA y CQ muerte celular inducida en un grado similar en PC-9 células /GEF PC-9 y, lo que indica PC-9 /gefB4 las células no eran resistentes a la 3-MA y la citotoxicidad inducida por CQ.
El papel de la autofagia en la citotoxicidad inducida por gefitinib
Las diferentes terapias que incluyen la terapia de radiación [20], [30] quimioterapias y terapias diana [16, 31] han informado de inducir la autofagia. Nuestro estudio confirma la noción de que la autofagia gefitinib aumentó de una manera dependiente de la concentración de PC-9 /GEF células (B4 y E3) PC-9 /peso y. El papel de la autofagia en la citotoxicidad inducida por gefitinib fue delineado aún más por la combinación de CQ y gefitinib. De acuerdo con nuestro estudio anterior [26], gefitinib (100 nM) por sí sola inducida marcada citotoxicidad en PC-9 /células WT. El mecanismo citotóxico de gefitinib es conocido para competir en el sitio de unión de ATP en las células PC-9 /peso que llevan el
EGFR
exón 19 eliminación [32] y por lo tanto inducir la citotoxicidad a través de la apoptosis [26, 33-35]. Se observó la potenciación por CQ más gefitinib en 9 PC-/células WT sólo cuando gefitinib se redujo a 3 nM, lo que indica que CQ se puede utilizar para aumentar la apoptosis inducida por gefitinib en PC-9 /células WT. Un ensayo clínico de gefitinib y hidroxicloroquina está experimentando en el Sistema Avanzado NSCL pacientes pacientes [36], nuestros datos sugieren que cuando se co-administración con CQ y sus análogos, dosis más bajas de gefitinib puede ser suficiente para los pacientes que tienen cáncer de pulmón gefitinib sensibles con menos cara efectos [37].
la autofagia y adquirido resistencia a los medicamentos
en comparación con 9 PC-células WT /, una diferencia de 200 veces en la CI
50 de gefitinib fue identificado en PC-9 /células gefB4 [26]. Nuestro estudio anterior encontró que los inhibidores de MEK (AZD6244 y CI1040) invirtieron profundamente las resistencias adquiridas a gefitinib en PC-9 células /gefB4 [26]. Consistentemente, gefitinib (100 nM) por sí solo no fue capaz de inducir citotoxicidad significativa en PC-9 /gefB4 (Fig. 4C), PC-9 /gefE3 y PC-9 /gefE7 [26]. Sin embargo, el presente estudio mostró que gefitinib más CQ indujeron significativamente la activación de caspasa 3 y la escisión de PARP en ambos 9 PC-células /gefE3 PC-9 /gefB4 y, lo que indica que CQ sensibilizado PC-9 /células gef (B4 y E3) a gefitinib . En comparación con la diferencia de 200 veces en la CI
50 de gefitinib, gefitinib no mostró diferencias significativas en la elevación y la muerte celular LC3-II en /de las células wt 9 PC-células /gefE3 9 PC-PC-9 /gefB4 y , lo que indica la autofagia puede no ser responsable de la resistencia a gefitinib adquirida. Sin embargo, nuestros
in vitro
datos demostraron que CQ atenuada supervivencia de PC-9 /gefB4 células, lo que indica que gefitinib y CQ pueden ser eficaces para superar la resistencia a gefitinib. Además, varios
in vitro
estudios informaron que la inhibición de la autofagia, parece potenciar la citotoxicidad en las células resistentes a crizotinib [18], las células resistentes a trastuzumab [19] y las células resistentes al cisplatino [20]. Hasta ahora, limitada
in vivo
estudios se han centrado en el efecto terapéutico de CQ en la resistencia a fármacos adquirida [18]. Nuestros hallazgos de
in vivo
modelo de xenoinjerto apoyan los
in vitro
datos en forma consistente que el gefitinib inhibe el crecimiento de PC-9 /peso del tumor y CQ no mejoran el efecto anticancerígeno de gefitinib. En cuanto al crecimiento de los tumores de PC-9 /gefB4 xenoinjertos, CQ además gefitinib retrasado significativamente el crecimiento del tumor de PC-9 /gefB4 xenoinjertos en comparación con la monoterapia con gefitinib, lo que indica que CQ es capaz de sensibilizar a los-9 PC gefB4 células /a gefitinib y a continuación, reduce el crecimiento tumoral de PC-9 /gefB4 xenoinjertos humanos.
En conclusión, EGFR-TKI, como gefitinib, se sabe que el tratamiento de los cánceres de pulmón con eficacias significativas. Nuestro estudio anterior combinación de gefitinib y los inhibidores de ERK y potenciales terapéuticos significativos demostrado con éxito emplea para la resistencia adquirida a gefitinib [26]. En el presente estudio, hemos demostrado que la autofagia puede jugar un papel citoprotector en la tumorigénesis y la resistencia adquirida. Además, CQ parece ser terapéuticamente útil para NSCLC tanto gefitinib sensibles y resistentes a, lo que sugiere que CQ y sus análogos puede ser una terapia prometedora cáncer [38-39] para pacientes con cáncer de pulmón con
EGFR
mutación que desarrollan una resistencia adquirida después de recibir tratamiento con gefitinib.