Extracto
Antecedentes
IQ-dominio de la proteína GTPasa de la activación 1 (IQGAP1) se une a Dishevelled (Dvl) y funciona como un modulador de Dvl de localización nuclear en embriones de Xenopus. Sin embargo, la relación entre IQGAP1 y Dvl en los tejidos tumorales no está claro.
Materiales y Métodos
Se utilizó inmunohistoquímica para evaluar las expresiones de IQGAP1 y Dvl en una cohorte de 111 no microcítico de pulmón de células cáncer (NSCLC). También se analizó la asociación de sus expresiones de localización con factores clínico-patológicos.
Resultados
La tasa positiva de IQGAP1 en tumores primarios fue del 48,6% (54/111) para su expresión cytoplamic, 9,0% (10 /111) para la expresión nuclear y 31,5% (35/111) para la expresión membranosa; la tasa positiva de Dvl fue 65,8% (73/111) para la expresión cytoplamic, 9,9% (11/111) para la expresión nuclear y el 10,8% (12/111) para la expresión membranosa. tasa de coexpresión de IQGAP1 y Dvl fue 77,8% (42/54) en el citoplasma, 80,0% (8/10) en el núcleo y 8,6% (3/35) en la membrana. La coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y el núcleo se correlacionó significativamente (P & lt; 0,05), pero no en la membrana (P & gt; 0,05). Las tasas de expresión positivos de ciclina D1 y c-myc fueron significativamente mayores en el grupo de IQGAP1 y Dvl coexpresión en el núcleo que en el citoplasma. tasa de coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y el núcleo fue significativamente mayor en los ganglios metástasis nodales (63,3%, 19/30) que en crecimientos primarios (38,3%, 31/81), que se correlaciona con mal pronóstico. el tiempo de supervivencia de cinco años después de la resección en el grupo con su co-expresión en el citoplasma y núcleo era significativamente menor que sin la co-expresión (44.705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 meses, p & lt; 0,05).
Conclusiones
la coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y el núcleo se correlaciona con la metástasis de ganglios ganglionar y el mal pronóstico de NSCLC, y la co-expresión en el núcleo podría desempeñar un papel crítico en la activación de la vía Wnt canónica.
cita: Zhao H, Xie C, Lin X, Y Zhao, Han Y, Ventilador C, et al. (2014) La coexpresión de IQ-dominio GTPasa de la proteína activadora 1 (IQGAP1) y Dishevelled (Dvl) se correlaciona con mal pronóstico en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (12): e113713. doi: 10.1371 /journal.pone.0113713
Editor: John D. Minna, Univesity de Texas Southwestern Medical Center en Dallas, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Julio, 2014; Aceptado: 27 Octubre 2014; Publicado: Diciembre 1, 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:.. Los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
proteínas de la familia Introducción
IQGAP se encuentran en numerosos organismos, incluyendo la levadura, pescado y mamíferos. Hay tres isoformas de IQGAP en los seres humanos: IQGAP1, IQGAP2 y IQGAP3. IQGAP1 es el mejor caracterizado y el miembro más estudiado de la familia IQGAP. Es un andamio de proteínas que se une a actina y funciones filamentoso para reticular y estabilizar los filamentos de actina a través de su dominio calponin homología (CH) en el extremo N-terminal [1]. Se ha demostrado la influencia IQGAP1 motilidad celular en el borde de ataque de las células que migran, mediante el aumento de los niveles de Rac1 y Cdc42 activa [2]. IQGAP1 muestra niveles elevados en una variedad de tipos de cáncer, incluyendo el cáncer [3] de páncreas. La expresión y la localización subcelular de IQGAP1 en el adenocarcinoma de pulmón se asoció con la diferenciación histológica y se pueden utilizar para predecir la supervivencia en pacientes [4]. Investigaciones recientes sugieren que IQGAP1 es un factor de riesgo de metástasis en los ganglios linfáticos pulmonares de carcinoma de células escamosas [5].
Dvl ha sido identificado como un regulador clave de la señalización de Wnt (incluyendo las vías canónicas y no canónicas), que es una componente clave del proceso fisiológico involucrado en el desarrollo y progresión del tumor embrionario [6], [7]. Muchos informes han demostrado el papel de Dvl en los tumores. DVL sobreexpresión se correlaciona significativamente con pobre diferenciación y la metástasis de los ganglios linfáticos en el CPNM [8]. Dvl-1 y Dvl-3 afectan a la invasión de células NSCLC principalmente a través de vías de Wnt canónicos y no canónicos, respectivamente [9]. Wnt5a promueve la migración de células de cáncer de mama a través de Dvl-2 [10].
funciones IQGAP1 como un modulador de Dvl de localización nuclear en Wnt de señalización [11]. Sin embargo, la correlación entre IQGAP1 y Dvl en los tumores no está claro. En el presente estudio, se realizó un análisis inmunohistoquímico para identificar las expresiones y las ubicaciones de IQGAP1 y Dvl en el CPNM. Por otra parte, analizamos su asociación con parámetros clínico.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los tejidos humanos se obtuvieron de acuerdo con los protocolos investigación con seres humanos aprobados por la medicina china Junta de Revisión de la Universidad. Los tejidos tumorales se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de los pacientes adultos con NSCLC.
Las muestras de tejido y los datos del paciente
Se recogieron 111 muestras de pacientes con CPNM que fueron sometidos a resección completa en el Primer Hospital Afiliado de la medicina china Universidad de enero a diciembre de 2008. Ninguno de los pacientes había recibido radioterapia o quimioterapia antes de la resección quirúrgica. La información de seguimiento se obtuvo de la revisión de la historia clínica de los pacientes. Se utilizó el sistema pTNM puesta en escena de la Unión Internacional Contra el Cáncer (7ª edición) en nuestro estudio. Este estudio se llevó a cabo con la aprobación de la junta de revisión institucional local de la Universidad Médica de China. Las principales variables clínicas y patológicas de todos los pacientes son los siguientes: 46 casos de carcinoma de células escamosas, 65 casos de adenocarcinoma; 38 casos de diferenciación, así 73 casos de moderada diferenciación de los pobres; 67 casos en estadio I, 20 casos en estadio II, 24 casos fueron en estadio III; 70 casos de pacientes del sexo masculino, 41 casos de pacientes de sexo femenino; la edad media es de 57 años.
La inmunohistoquímica
muestras de tumores extirpados quirúrgicamente se fijaron con formalina neutra al 10%, se incluyeron en parafina y se prepararon 4 micras de grosor. La tinción inmunohistoquímica se realizó mediante el método del complejo avidina-biotina-peroxidasa (UltrasensitiveTM, Maixin, Fuzhou, China). Las secciones se desparafinaron en xileno, se rehidrataron en alcohol graduado, y luego a ebullición en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 2 min con un autoclave. se aplicó peróxido de hidrógeno (0,3%) para bloquear la actividad de peróxido endógeno y las secciones se incubaron con suero de cabra normal para reducir la unión no específica. Las secciones de tejido se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios (ratón anti-humanos) son los siguientes: anticuerpo monoclonal IQGAP1 (1:40, sc-376021, Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.), anticuerpo monoclonal Dvl (1:25, sc-166303, Santa Cruz), ciclina D1 monoclonal anticuerpo (1:100, sc-20044, Santa Cruz), anticuerpo monoclonal c-myc (1:500, cat.ab32, Abcam). Biotinilado de cabra anti-ratón IgG en suero se utilizó como anticuerpo secundario. Como un control de isotipo, IgG de ratón (Maixin Biotechnology, Fuzhou, Fujian, China, a la misma concentración del anticuerpo primario) en lugar del anticuerpo primario (Figura S1). Después del lavado, las secciones se incubaron con estreptavidina-biotina conjugado con peroxidasa de rábano picante, y la reacción de la peroxidasa se desarrolló con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina. Contratinción se realizó con hematoxilina, y las secciones se deshidrataron con etanol antes de ser montado.
Evaluación de la tinción
La intensidad de la tinción y el porcentaje de células teñidas en zonas representativas de cada diapositiva se evaluaron de forma independiente y anotó por dos investigadores, que fueron cegados a los datos clínicos sobre pacientes. Cinco miradas fueron examinados por diapositiva, y no se observaron 100 células por visión a 400 × magnificación. Para IQGAP1 o Dvl, los resultados de inmunohistoquímica demostraron que la tinción positiva localizada en la membrana núcleo, citoplasma, y (o). Los tumores se definen como expresión citoplásmica cuando 20% o más células tumorales mostraron tinción citoplásmica; tumores fueron definidas como expresión nuclear cuando 20% o más células tumorales mostraron tinción nuclear, si tinción citoplásmica o no; tumores fueron definidas como expresión membranosa cuando 20% o más células tumorales mostraron tinción membranosa, si tinción citoplásmica o no. Las regiones con expresión positiva eran de color amarillo o marrón-amarillo, y las regiones con expresión negativa no eran manchas. Para ciclina D1 o c-myc, los resultados inmunohistoquímicos demostraron que la tinción positiva localizada en el núcleo o núcleo /citoplasma.
El análisis estadístico
SPSS versión 16.0 para Windows fue utilizado para todos los análisis. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para examinar diversas correlaciones posibles. Se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para estimar la probabilidad de supervivencia de los pacientes, y las diferencias de supervivencia entre los subgrupos de pacientes. El modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para estimar el posible significado pronóstico de variables clinicopatológicas. Todos los valores de p se basan en el análisis estadístico de dos caras, y P & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativa en la diferencia
Resultados
1.. La coexpresión de IQGAP1 y Dvl principalmente en el citoplasma y núcleo
La tasa de expresión positiva de IQGAP1 era 89,2% (99/111) y 48,6% (54/111) para su expresión cytoplamic, 9,0% (10 /111) para la expresión nuclear y 31,5% (35/111) para la expresión membranosa. La tasa de expresión positiva de Dvl fue del 86,5% (96/111) y 65,8% (73/111) para la expresión cytoplamic, 9,9% (11/111) para la expresión nuclear y el 10,8% (12/111) para la expresión membranosa (Tabla S1).
tasa de coexpresión de IQGAP1 y Dvl fue 77,8% (42/54) en el citoplasma (Tabla 1, Figura 1), 80,0% (8/10) en el núcleo (Tabla 1, Figura 2A -RE). La coexpresión en el citoplasma se correlacionó de manera significativa (Tabla 1, P = 0,009, r = 0,246), también en el núcleo (Tabla 1, P = 0,000, r = 0,738); tasa de coexpresión de IQGAP1 y Dvl en la membrana fue sólo 8,6% (3/35), y co-expresión en la membrana no se correlacionó (Tabla 1, P & gt; 0,05, Figura S2)
A-B:. adenocarcinoma ; C-D: carcinoma de células escamosas. Aumento original, 400 ×; barra de escala, 20 micras.
La coexpresión de IQGAP1 (A) y Dvl (C) en el núcleo de adenocarcinoma de pulmón. La coexpresión de IQGAP1 (B) y Dvl (D) en el núcleo de carcinoma de células escamosas de pulmón. Expresión positiva de ciclina D1 (E) y c-myc (G) en el adenocarcinoma de pulmón. Expresión positiva de ciclina D1 (F) y c-myc (H) en el pulmón carcinoma de células escamosas. Aumento original, 400 ×; barra de escala, 20 micras.
La expresión de ciclina D1 y c-myc fue significativamente positivo en el grupo de IQGAP1 y Dvl co-expresión en el núcleo (Figura 2E-H), y su tasas de expresión positivos fueron del 100% (8/8) y 87,5% (7/8), respectivamente. En el grupo de IQGAP1 y Dvl coexpresión en el citoplasma, las tasas de expresión positiva de ciclina D1 y c-myc fueron 52,4% (22/42) y 35,7% (15/42), respectivamente. Las tasas de expresión positivos de ciclina D1 y c-myc en el grupo de co-expresión nuclear fueron significativamente más altos que el de la co-expresión citoplásmico (P & lt; 0,05)
2.. La coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma o el núcleo se correlaciona con la metástasis linfática de NSCLC
Como se muestra en la Tabla 2, la tasa de coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y núcleo era 63,3% (19/30) en el grupo con ganglios metástasis ganglionares (N1-3), y el 38,3% (31/81) en el grupo con crecimientos primarios (N0). Las metástasis ganglionares presentaron mayor tasa de coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y núcleo de crecimientos primarios (P & lt; 0,05). Sin ritmo diferente estadísticamente significativa se muestra entre el grupo de T1 y T2-4 (estado del tumor) (P & gt; 0,05, Tabla S2), también entre el grupo de adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas (tipos histológicos) (P & gt; 0,05, Tabla S3 ).
3. La coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma o el núcleo se correlaciona con mal pronóstico de NSCLC
de Kaplan-Meier análisis de supervivencia mostró un tiempo de supervivencia significativamente menor en los pacientes con co-expresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y núcleo que aquellos con sin co-expresión. el tiempo de supervivencia de cinco años después de la resección en el grupo con su co-expresión en el citoplasma y núcleo era significativamente menor que sin coexpresión (44.705 ± 3.355 vs 58.403 ± 2,543 meses, p & lt; 0,05, Figura 3A), y el grupo de co-expresión nuclear fue significativamente menor que el de la co-expresión citoplásmica (36.000 ± 6.329 vs 46.528 ± 3.758 meses, P & lt; 0,05, Figura 3B).
(a) A. el grupo con IQGAP1 y Dvl noncoexpression en el citoplasma y el núcleo ( 61 casos); B. El grupo con IQGAP1 y Dvl coexpresión en el citoplasma y núcleo (50 casos) (B) A. El grupo con IQGAP1 y Dvl noncoexpression en el citoplasma y el núcleo (61 casos); B. El grupo con IQGAP1 y Dvl coexpresión en el citoplasma (42 casos); C.El grupo con IQGAP1 y co-expresión Dvl en el núcleo (8 casos).
Para aclarar si la coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y el núcleo se asoció independientemente con el pronóstico de los pacientes con CPNM, se empleó el modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. El resultado mostró que coexpressions citoplásmicos y nucleares eran factores de riesgo independientes para el pronóstico de los pacientes con NSCLC (P & lt; 0,05; Tabla 3).
Discusión
Como un importante efector de Rho GTPasas, IQGAP1 es una proteína de andamiaje y desempeña la función fundamental en el movimiento celular mediante la modulación del citoesqueleto de actina a través de Rac1 y Cdc42 [12] - [14]. DVL es un mediador esencial de la vía canónica de señalización Wnt, y es necesario para su localización nuclear canónica de señalización Wnt [15], [16]. En los embriones de Xenopus, IQGAP1 interactuó con Dvl y regulada su localización nuclear para moderar la expresión de Wnt genes diana durante la embriogénesis temprana [11]. Sin embargo, no se ha descrito la relación entre IQGAP1 y Dvl en los tumores.
El presente estudio investigó la expresión IQGAP1 y Dvl del NSCLC (adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas). Se encontró que IQGAP1 y Dvl se localizaron principalmente en el citoplasma. tasa de coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma o núcleo fue significativamente mayor que la de la membrana; coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y el núcleo se correlacionó significativamente (P & lt; 0,05), pero no en la membrana (P & gt; 0,05). La co-expresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y el núcleo se asoció con metástasis en los ganglios linfáticos y mal pronóstico en NSCLC. La supervivencia en el grupo de co-expresión nuclear era significativamente peor que el de la co-expresión citoplasmática. La coexpresión membranosa de IQGAP1 y Dvl no se correlacionaron (P & gt; 0,05). Estos resultados sugieren que IQGAP1 interactuó con Dvl en el citoplasma y núcleo de NSCLC, y el papel en el citoplasma podría ser uno de los pasos críticos en la modulación de Dvl de localización nuclear, pero no en la membrana. Estos resultados son consistentes con estudios previos [11].
Se requiere la localización nuclear de Dvl para la señalización de Wnt canónica [15]. Dvl coopera con c-Jun para regular la transcripción de genes estimulados por la vía canónica de señalización Wnt en el núcleo [16]. En este estudio, se encontró que los genes diana de la señalización de Wnt canónica, ciclina D1 y c-myc, las tasas positivas de ellos en el grupo con IQGAP1 y Dvl coexpresión en el núcleo eran mucho más alta que en el citoplasma. El análisis de supervivencia también mostraron que los pacientes con coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el núcleo tenían un tiempo de supervivencia significativamente menor que los pacientes con que en el citoplasma (P & lt; 0,05). Estos resultados sugieren que la co-expresión nuclear de IQGAP1 y Dvl se asocia con la activación de la vía Wnt canónica.
Sobre la base de los resultados anteriores se concluye que la coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y el núcleo se correlaciona con la metástasis de los ganglios linfáticos y un mal pronóstico en NSCLC. IQGAP1 modula Dvl de localización nuclear en el citoplasma, pero no en la membrana. La coexpresión de IQGAP1 y Dvl en el núcleo se asocia con la expresión de ciclina D1 y c-myc, lo que sugiere que la co-expresión nuclear de IQGAP1 y Dvl está asociada con la activación de la vía Wnt canónica. Por lo tanto, la inhibición de la unión de IQGAP1 y Dvl en el citoplasma y la prevención de Dvl translocación nuclear, podría ser una de las estrategias para la prevención y tratamiento del cáncer de pulmón.
Apoyo a la Información
Figura S1.
La validación de anticuerpo (IQGAP1, A y D; Dvl, B y E) para inmunohistoquímica. A-C: adenocarcinoma; D-F: el carcinoma de células escamosas; C y F: IgG de ratón se utilizó en lugar del anticuerpo primario. Aumento original, 400 ×; . Barra de escala, 20 micras
doi: 10.1371 /journal.pone.0113713.s001 gratis (TIF)
figura S2.
coexpresión de IQGAP1 (A, C) y Dvl (B, D) en la membrana del NSCLC. A-B: adenocarcinoma; C-D: carcinoma de células escamosas. Aumento original, 400 ×; . Barra de escala, 20 micras
doi: 10.1371 /journal.pone.0113713.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
IQGAP1 y expresión Dvl en CPNM
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113713.s003 gratis (DOC) sobre Table S2.
IQGAP1 y Dvl co-expresión en diferentes estado del tumor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113713.s004 gratis (DOC) sobre Table S3.
IQGAP1 y Dvl co-expresión en diferentes tipos histológicos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113713.s005 gratis (DOC)
Reconocimientos
Los autores desean agradecer El Dr. Li Weinan, por su excelente asistencia técnica.