Extracto
Las células tumorales circulantes (CTC) han surgido como un biomarcador potencial en el diagnóstico, pronóstico, el tratamiento y la vigilancia del cáncer de pulmón. Sin embargo, la detección de CTC no sólo es costoso, pero su sensibilidad es también baja, lo que limita su uso y la recogida de datos fiables en cuanto a la importancia de las CTC en el cáncer de pulmón. El objetivo fue buscar variables clínicas que mejoran la predicción de las CTC en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Las muestras clínicas y patológicas de datos se obtuvieron de 169 pacientes con CPNM. CTC se detectaron mediante marcadores tumorales CellSearch y se detectaron utilizando el ensayo Luminex xMAP. Los análisis univariados revelaron que la histología, estadio tumoral, tamaño tumoral, invasión, grado del tumor y antígeno carcinoembrionario (CEA) se asociaron con la presencia de los CTC. Sin embargo, el nivel de CTC no se asoció con el grado de afectación ganglionar (N) o tumor marcadores de pronóstico Ki-67, CA 125, CA 19-9, Cyfra21-1, y SCCA. Utilizando el análisis de regresión logística, hemos encontrado que la combinación de las CTC con marcador tumoral CEA tiene una mejor predicción de la enfermedad. pacientes con CPNM avanzado fase con elevación de CEA tenían un mayor número de CTC. Estos datos sugieren un modelo de predicción útil mediante la combinación de las CTC con el CEA en suero en pacientes con CPNM
Visto:. Chen X, Wang X, El H, Z Liu, Hu JF, Li W (2015) Combinación de células tumorales circulantes con suero antígeno carcinoembrionario mejora la predicción clínica de células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 10 (5): e0126276. doi: 10.1371 /journal.pone.0126276
Editor Académico: Jeffrey Chalmers, La Universidad Estatal de Ohio, Estados Unidos |
Recibido: 1 Noviembre 2014; Aceptado: March 31, 2015; Publicado: 21 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM) (RT2-01942), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (CN) (# 81071920, 81372835 #,#.#81272294, 31430021), Jilin Provincial de Ciencia y Tecnología del Departamento (11ZDGG003,#20120720), y de Salud Nacional y de la Comisión de Planificación Familiar de la República Popular de China (CN) (# 2001133): perfil
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa el 75-80% de los casos de cáncer de pulmón. CPNM normalmente no se diagnostica hasta que la enfermedad ha llegado a la etapa avanzada, lo que lleva a las bajas tasas de supervivencia, con una tasa de supervivencia a 5 años del 20% [1,2]. Un número de marcadores biológicos se han usado en la clínica como marcadores de pronóstico para los pacientes de NSCLC. Estos incluyen el antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer (CA) -199, CA-125, antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC-Ag), y citoqueratina-19 fragmentos de antígeno 21-1 (CYFRA21-1). Los niveles elevados de estos marcadores se han asociado con un mal pronóstico [3-12]. Entre ellos, CEA y CYFRA 21-1 son los marcadores tumorales más sensibles en NSCLC [13,14].
Las células tumorales circulantes (CTC) células tumorales son que dejan el sitio del tumor primario y entran en el torrente sanguíneo, donde que pueden extenderse a otros órganos. CTC se pueden identificar en la sangre periférica mediante tinción histológica para marcadores epiteliales y específicos del cáncer. En la actualidad, el único kit de detección aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA) es el sistema CellSearch (Veridex, NJ), que utiliza anticuerpos específicos para identificar y cuantificar las CTC en una muestra de sangre ml 7.5.
Para fecha, el papel de las CTC en el CPNM sigue sin estar clara. Por ejemplo, mientras que algunos estudios se correlacionan CTC con mal pronóstico [15-18], otros no encontraron ninguna correlación [19]. Un reciente meta-análisis de 20 estudios con un total de 1576 pacientes reveló que la presencia de las CTC se asocia con un mal pronóstico en pacientes con NSCLC [20]. Es de destacar que el valor pronóstico de las CTC sigue siendo controvertido. Estudios previos han informado que alrededor del 30% de los pacientes con CPNM tener al menos un CTC por 7,5 ml de sangre, y alrededor de 15% de los pacientes con CPNM tener cinco o más CTC por 7,5 ml de sangre, con niveles de CTC más altos en pacientes con metástasis a distancia [ ,,,0],15, 21-22]. Además de su baja sensibilidad, el alto costo de la detección de CTC ha hecho que sea difícil para convertirse en una prueba clínica de rutina para el NSCLC, sobre todo en las poblaciones chinas.
Para lograr una mejor comprensión de la importancia de las CTC en el CPNM, hemos iniciado un estudio prospectivo de una sola institución para caracterizar las CTC en pacientes con CPNM y se examinó la relación entre la CTC y otros factores clínicos. El objetivo fue probar la hipótesis de que la presencia de CTC en combinación con biomarcadores tumorales podría predecir mejor la invasividad tumoral en pacientes con CPNM.
Materiales y Métodos
Estudio de la población
Este estudio se llevó a cabo en el primer hospital de la Universidad de Jilin (Changchun, china). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Primer Hospital de la Universidad Médica de Jilin, y llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de los principios de Helsinki. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes reclutados antes de cualquier intervención. Los pacientes con diagnóstico histológico de CPNM fueron elegibles. Antes del tratamiento, tumor nodo metástasis (TNM) (7ª edición) fue evaluada por Computated de Positrones (TC) [23].
Análisis CTC
El sistema CellSearch (Veridex, Nueva Jersey, EE.UU.) se utilizó para cuantificar las CTC en 7,5 ml de muestras de sangre tomadas de los pacientes dentro de los siete días antes del tratamiento (definido como la línea de base). Las muestras de sangre se recogieron en tubos de 10 ml conservantes CellSave (Veridex), almacenado a temperatura ambiente, y procesada dentro de las 96 horas de la recogida, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. CTC se definen como células con ronda a la morfología oval, a, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) núcleo positivo de 4 mM o mayor, tinción citoplásmica positiva para citoqueratinas (CK-8, CK-18, y CK -19), y la ausencia de expresión de CD45.
análisis de marcadores tumorales
los sueros fueron separados de un ml de muestra de sangre coagulada 2 de cada paciente. Un ensayo Luminex xMAP (Luminex, Austin, TX, EE.UU.) fue el uso de detectar marcadores tumorales del antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer (CA) -199, CA-125, antígeno de carcinoma de células escamosas (SCC-Ag), y citoqueratina -19 fragmentos de antígeno 21-1 (CYFRA21-1). El nivel de cada marcador se comparó con los valores de referencia normales de 5 ng /mL CEA, 35 U /ml CA19-9, 35 U /ml CA125, 1,5 ng /ml SCC, y 5 ng /mL CYFRA21-1. Debido al límite de volumen de suero, sólo 109 pacientes tuvieron su suero se analizó para los niveles de CEA, 70 pacientes para CA125, 76 pacientes de CA 19-9, 107 pacientes para CYFRA21-1, y 75 patentes de SCCA.
espécimen de patología e inmunohistoquímica
Tumor especímenes fueron obtenidos de pacientes con estadio IIIB o IV NSCLC para el análisis patológico. Las muestras tumorales fueron fijadas en formalina, embebido en parafina, cortado en secciones de 4 mm, y se fijan a portaobjetos de vidrio. La proliferación celular se evaluó mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal contra Ki-67 (Maixin-BIO Inc., China). Ki-67 tinción en menos del 25% de las células se considera negativa, mientras que la tinción en & gt; 25% de las células se considera que es positivo Ki-67 [24].
El análisis estadístico
Las variables individuales se evaluaron mediante análisis univariado utilizando la prueba Chi cuadrado. Los índices de riesgo se calcularon para cada variable para evaluar el valor predictivo de las CTC. Se utilizó un análisis de regresión logística para evaluar las relaciones entre los conteos CTC y los datos clínico-patológicas. Todos los análisis se realizaron utilizando el software SPSS v19.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Para todos los análisis, un
p-valor
inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Características de los pacientes
Ciento sesenta y nueve pacientes con CPNM fueron reclutados entre julio de 2012 y enero de 2014, y sus características se registraron (Tabla 1). CTC se cuantificaron a partir de una muestra de sangre ml 7,5 para cada paciente (Fig 1). La duración mediana de seguimiento fue de 1,1 años. Por lo tanto, el análisis de supervivencia no se llevará a cabo en esta población cohorte. En general, la predicción de NSCLC por CTC fue relativamente baja en nuestras muestras de cohortes. En un total de 169 pacientes con CPNM, sólo 40 (23,7%) pacientes presentaron detección de CTC positivo (& gt; 1 por 7,5 ml de sangre), en un acuerdo similar con la reportada en poblaciones occidentales [15, 21-22]
.
selección inmunomagnética positiva con anti-EpCAM Ab fue seguido por la confirmación morfológica con la tinción para citoqueratinas (citoplasma), DAPI (núcleo) y CD45 (negativo).
Curiosamente, nuestra muestras de cohortes mostraron un porcentaje relativamente bajo de pacientes de sexo femenino (33,7%) en comparación con los países occidentales, donde NSCLC es más frecuente en las mujeres [1-2]. Podría ser posible que las diferencias en el origen étnico y etiológicos factores de pacientes con NSCLC pueden explicar esta discrepancia. Por ejemplo, la tasa de fumadores es relativamente bajo en las mujeres chinas.
El análisis univariante de CTC cuenta con datos clínicos y patológicos
En los análisis de correlación, hemos encontrado ninguna asociación significativa de CTC cuenta con el género, la edad, el tabaquismo, y la ubicación del tumor primario (Tabla 2). Sin embargo, el tipo histológico se asoció positivamente con el CTC (p & lt; 0,05 para CTC umbrales ≥ 1 y ≥ 2CTC /7,5 ml de sangre). Ninguno de los pacientes en la etapa I NSCLC tenido CTC CTC ≥ 1 /7.5 ml de sangre, mientras que el 15,8% (6/38) de los pacientes en estadio II-III A y el 29,1% (34/117) de los pacientes etapa IIIB-IV se encontró que tenían ≥ CTC 1 CTC /7,5 ml de sangre. estadificación TNM clínico se asoció positivamente con el CTC, cuando se divide en estadio I, estadio II, estadio III y estadio IV (p & lt; 0,05 para CTC umbrales ≥ 1 y 2 CTC /7,5 ml de sangre). Incluso cuando la clasificación TNM clínica se divide en estadio I-IIIA y IIIB-IV, quedó asociado CTC (p & lt; 0,05 para CTC umbrales ≥1, 2 y 5 CTC /7,5 ml de sangre).
Para entender mejor si el tamaño del tumor, invasión, o linfática y metástasis a distancia tienen un impacto en el recuento de CTC, la relación entre la CTC y el estadio TNM también se evaluó. Se encontró que el 28,1% (9/32) de la T1, 12,1% (8/66) de T2, 29,4% (5/17) de la T3, y el 34,9% (15/43) de los pacientes tenían T4 CTC CTC ≥ 1 /7,5 ml de sangre, lo que constituye una significativa correlación entre el tamaño del tumor y la presencia de al menos 1 CTC /7,5 ml de sangre. Sin embargo, no hubo correlación entre otros recuentos de CTC umbral y el tamaño del tumor. Del mismo modo, no hubo relación entre cualquier umbral de recuento de CTC y los ganglios linfáticos metástasis. Sin embargo, metástasis a distancia se correlacionó con CTC recuentos en los umbrales de ≥ 1, 2 y 5 CTC /7,5 ml (p & lt; 0,05).
El análisis multivariante demuestra que las CTC se correlaciona con enfermedad en estadio avanzado
Para aumentar el valor de predicción de la CTC en el CPNM, se realizó un análisis multivariante incluyen edad, sexo, antecedentes de tabaquismo, la histología, clínica-puesta en escena y la localización del tumor primario. Hemos encontrado que los pacientes con enfermedad en estadio IIIB-IV tuvieron una alta incidencia de CTC en comparación con aquellos en estadio I-IIIA. (P & lt; 0,05; Tabla 3).
Asociación de CTC cuenta con Ki-67 y el grado tumoral en pacientes NSCLC
El análisis anatomopatológico indicó que los tumores pobremente diferenciados se correlacionaron con una mayor conteos CTC CTC (≥ 2 /7.5 ml de sangre, p & lt; 0,05, Tabla 4), en comparación con los tumores moderadamente diferenciados. Los pacientes con tumores Ki-67-positivas parecía tener mayor CTC cuenta, pero esto no alcanzó significación estadística.
recuentos de CTC se correlacionan con el CEA
El marcadores tumorales CEA, Cyfra21- 1, CA 19-9, CA-125, y SCC-Ag se analizaron también en pacientes con CPNM. Cada marcador sérico se comparó de forma independiente con CTC cuenta para identificar las posibles relaciones. El único marcador que se encuentran asociados con las CTC se CEA en suero. CEA sérico elevado se asoció positivamente con el CTC cuenta en los umbrales de ≥ 1, 2 y 5 CTC /7,5 ml de sangre, en comparación con los niveles de CEA normales (tabla 5).
Además, se realizó un análisis estadístico para investigar si existía alguna correlación entre la presencia de CTC, estadificación TNM y la concentración sérica de CEA. Después del ajuste para la estadificación TNM (I-IIIA y IIIb IV), el suero CEA se sigue una asociación positiva con la presencia de CTC (OR IC del 95% = 4.263 [1,194 a 15,226], p = 0,026.
Suero CEA aumenta el poder de predicción de los CTC en el tumor de la agresividad
la detección de CTC en nuestros pacientes con CPNM fue relativamente baja, con sólo el 23,7% de los pacientes que muestran & gt;. 1 CTC por 7,5 ml de sangre por lo tanto nos propusimos examinar si la adición de una variable clínica barato aumentaría su poder de predicción de la enfermedad. para ello, se utilizó un análisis de regresión logística para analizar la capacidad de los CTC en combinación con suero CEA en la predicción de la agresividad NSCLC, incluyendo la estadificación TNM (I-IIIA y IIIb IV), nivel de Ki-67, y el grado del tumor. como se ve en la Tabla 6, se encontró que la capacidad de predicción de la tarde puesta en escena y Ki-67 se incrementó en el grupo con el modelo CTC y CEA combinado en comparación con el modelo CTC.
Discusión
Las células tumorales circulantes (CTC) se han estudiado como potenciales biomarcadores para mejorar el diagnóstico de NSCLC, pronóstico, tratamiento y vigilancia. Sin embargo, a nuestro conocimiento, nuestro estudio es el primero en utilizar el sistema para evaluar CellSearch CTC en una gran cohorte de pacientes con CPNM china.
En el análisis univariante, encontramos que CTC cuenta en pacientes con CPNM se asociaron con etapa tardía, adenocarcinomas, el grado del tumor pobremente diferenciado, y niveles elevados de CEA. Utilizando el análisis de regresión logística, se encontró que el modelo CTC y CEA combinado tenía una mejor predicción de la agresividad de NSCLC (estadificación tarde y Ki-67). Nuestros datos sugieren que las variables clínicas, particularmente suero CEA, pueden mejorar el poder de predicción de los CTC en pacientes con CPNM
Los estudios anteriores han informado de que el 30% de los pacientes tienen & gt;. 1 CTC por 7,5 ml de sangre, tal como se mide por CellSearch, y que el 15% tiene cinco o más CTC [15,21-22]. En nuestro estudio, el 23,7, el 11,8 y el 7,7% de los pacientes demostraron al menos 1, 2 y 5 CTC /7,5 ml de sangre, respectivamente. Aunque estos niveles son algo inferiores a los de los estudios se informó anteriormente, las diferentes poblaciones de pacientes puede explicar estas discrepancias. En particular, los estudios anteriores han incluido poblaciones heterogéneas de metastásica y operable NSCLC
.
factores de pronóstico comunes en NSCLC incluyen Ki-67 positividad y el grado del tumor. [25-28]. El grado tumoral se correlaciona con los niveles de apoptosis y la proliferación celular en adenocarcinomas de pulmón, con más rápida renovación de las células tumorales en los tumores pobremente diferenciados [29]. Consistente con este concepto, se encontró que los altos recuentos de CTC se asociaron con tumores poco diferenciados. En particular, un grado del tumor pobremente diferenciado se asoció significativamente con un recuento de CTC de ≥ 1 o 2 CTC /7,5 ml de sangre. Por otra parte, la tinción de alta Ki-67 en el tumor primario también se asoció con alta CTC cuenta en todos los umbrales, aunque estos datos no fueron estadísticamente significativos, debido al pequeño tamaño de cohorte. La relación entre la proliferación y la CTC en el CPNM se requieren más estudios utilizando una cohorte más amplia
.
Los estudios previos han evaluado la relación entre la CTC y los marcadores tumorales en tumores sólidos [30-32]. Sin embargo, los datos de los pacientes con cáncer de pulmón siguen faltando, sobre todo en la población china. Se investigó la relación entre CTC y marcadores utilizados comúnmente a tumores de NSCLC, incluyendo CEA, CA19-9, CA-125, SCC, y CYFRA21-1. Curiosamente, nuestros datos muestran que los niveles de CEA en suero se correlacionan con CTC cuenta en pacientes con CPNM. CEA, una glicoproteína que normalmente se produce durante el desarrollo fetal, está presente en un nivel muy bajo en el suero de adultos sanos. los niveles séricos elevados de CEA se asocian con el desarrollo, por supuesto, el escenario y el pronóstico de NSCLC [4-5, 12]. Los datos de nuestro estudio sugieren que la combinación de CTC recuentos y suero CEA se asoció con más agresivo NSCLC. Sin embargo, no está claro por qué otros biomarcadores séricos no tienen asociaciones similares con las CTC en pacientes con CPNM. Otros estudios utilizando muestras de mayor tamaño son necesarias para determinar si era útil para incluir estos marcadores en el modelo de predicción.
A pesar de los avances en años recientes, la tecnología CellSearch todavía tiene muchas limitaciones. La detección de CTC por el sistema CellSearch se basa en marcadores de superficie celular tales como EpCAM. Por lo tanto, puede potencialmente perder CTC que no expresan el antígeno diana [33-34]. Del mismo modo, las células tumorales agresivas pierden marcadores epiteliales debido a epitelio-mesenquimal transición (EMT) y no serán detectados por CellSearch. Debe tenerse en cuenta que el campo se está alejando de CTC cuenta a la caracterización molecular y funcional de CTC y el uso de CTC como biopsias líquidos para probar si ciertos pacientes son más propensos a beneficiarse de centro de terapias biológicas [35-36]. Por ejemplo, la caracterización fenotípica de las CTC mediante la inclusión de un gen marcador "específico de tumor", como CEA por RT-PCR, tiene una ventaja de aumentar la sensibilidad.
El ensayo CellSearch es muy costoso en China. El hallazgo de nuestro estudio puede sugerir un método rentable para los pacientes con CPNM para decidir quién debe ejecutar para este ensayo caro. Los marcadores tumorales son siempre utilizados como biomarcadores para el diagnóstico precoz, la eficacia del tratamiento y el pronóstico en NSCLC [4-5, 12, 37-38]. Como CEA en suero está asociada con CTC, puede ser posible recomendar el ensayo CellSearch para aquellos pacientes de NSCLC que son positivo para CEA. Alternativamente, podemos explorar si los pacientes con CPNM tanto CTC positivo y elevado CEA son diferentes de otros subtipos en la respuesta terapéutica.
Debe destacarse que este estudio sólo incluyó 169 pacientes con CPNM en el análisis de correlación. Además, debido al límite de muestras de suero, no pudimos completar todos los ensayos de biomarcadores para cada paciente, lo que lleva al bajo poder estadístico para algunas variables en los subgrupos estratificados. Esperamos que la recogida continua de biopsias de tumores de este proyecto en curso será la fuerza de nuestros hallazgos.
En resumen, un método sencillo y fiable para la identificación de pacientes con CPNM con CTC tendría un gran valor pronóstico. Hemos encontrado que la presencia de las CTC se asocia con la fase crónica y tumores poco diferenciados, adenocarcinomas y CEA elevado. La combinación de CTC cuenta con valores séricos de CEA se asoció con una mayor agresividad del tumor en pacientes con CPNM. Se requerirá a largo plazo de seguimiento para determinar la mayor importancia de las CTC en el CPNM.