Extracto
A pesar de los recientes avances en el tratamiento de cáncer de colon humano, la eficacia de la quimioterapia contra el cáncer de colon es todavía insatisfactoria. En el presente estudio, los efectos de la inhibición concomitante del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y ADN metiltransferasa se examinaron en células de cáncer de colon humano. Hemos demostrado que la decitabina (un inhibidor de la ADN metiltransferasa) sinérgica con gefitinib (un inhibidor de EGFR) para reducir la viabilidad celular y la formación de colonias en SW1116 y las células LOVO. Sin embargo, la combinación de los dos compuestos está representada una toxicidad mínima para las células NCM460, una mucosa de colon línea celular epitelial humana normal. La combinación fue también más eficaz en la inhibición de la vía de AKT /mTOR /quinasa S6. Además, la combinación de la decitabina con gefitinib marcadamente inhibida la migración de células de cáncer de colon. Además, gefitinib sinérgicamente reforzada citotoxicidad decitabina inducido fue principalmente debido a la apoptosis como se muestra por medio del etiquetado Anexina V que fue atenuada por z-VAD-fmk, un inhibidor de la caspasa pan. Al mismo tiempo, la apoptosis de células resultante de la co-tratamiento de gefitinib y decitabina fue acompañada por la inducción de BAX, caspasa 3 escindida y la PARP escindida, junto con la reducción de Bcl-2 en comparación con el tratamiento con cualquiera de los fármacos solos. Curiosamente, el tratamiento combinado con estos dos fármacos aumentó la expresión de XIAP asociada a factor de 1 (XAF1), que desempeñan un papel importante en la apoptosis celular. células de cáncer de colon Además, el agotamiento de pequeños ARN de interferencia (siRNA) de XAF1 atenuó significativamente la apoptosis inducida por la combinación de los dos fármacos. Nuestros hallazgos sugieren que el gefitinib en combinación con decitabina ejerce una mayor apoptosis de las células en células de cáncer de colon estaban involucrados en la vía y la inducción de la expresión XAF1 mitocondrial mediada. En conclusión, basándose en las observaciones de nuestro estudio, hemos sugerido que la administración combinada de estos dos fármacos podría ser considerado como un nuevo régimen terapéutico para el tratamiento del cáncer de colon
Visto:. Lou Yf, Zou Zz, Chen Pj , Huang Gb, Li B, Zheng Dq, et al. (2014) Combinación de gefitinib y metilación del ADN Inhibidor Decitabine Ejerce sinérgica actividad anticancerígena en células de cáncer de colon. PLoS ONE 9 (5): e97719. doi: 10.1371 /journal.pone.0097719
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Enero, 2014; Aceptado: April 23, 2014; Publicado: 29 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Lou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por el Fondo del Sur de china normal University ciencia para jóvenes Investigadores (Grant No. 13KJ19 a Zheng Zhi-Zou), la Oficina de Dongguan la ciencia y la tecnología de la ciudad de 2010 Fondos clave del proyecto (subvención No. 201028 con Xiao Yong-Luo). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de colon es uno de los tumores que se presentan con mayor frecuencia y una causa importante de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo, lo que acentúa la necesidad de estrategias eficaces para la prevención y tratamiento de esta patología. Terapias disponibles para el tratamiento de cáncer de colon incluyen cirugía, terapia de radiación, quimioterapia, terapia inmunomoduladora, y terapias dirigidas molecularmente tales como anti-vascular del receptor del factor de crecimiento endotelial (VEGFR) y la terapia de receptor del factor de crecimiento anti-epidérmico (EGFR) [1], [ ,,,0],2]. Entre estos tratamientos dirigidos molecularmente, la terapia de EGFR como una de las estrategias clínicas importantes ha sido cada vez más ampliamente aplicado en los pacientes con cáncer de colon metastásico [3].
EGFR es una glicoproteína transmembrana con un dominio de unión a EGF extracelular y una región intracelular que contiene el dominio de tirosina quinasa que regula vías para controlar la sensibilidad proliferación celular, la diferenciación, fármacos y la radiación de señalización, y la angiogénesis [4]. La expresión de un alto nivel de EGFR se ha encontrado en varios tipos de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cáncer de mama, y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello [5], [6], [7], [8], [9], [10]. La sobreexpresión y activación constitutiva de EGFR se han asociado con un mal pronóstico en pacientes con cáncer de colon. Como la activación de EGFR se correlaciona con la progresión del cáncer de colon, el EGFR ha sido el objetivo de los esfuerzos de desarrollo de fármacos contra el cáncer. Estas estrategias dirigidas a EGFR incluyen el uso de anticuerpos monoclonales tales como cetuximab, y los inhibidores de pequeñas molecular de tirosina quinasa (TKI) tales como gefitinib y erlotinib. Gefitinib es un anilinoquinazolina sintético y activo por vía oral selectivo EGFR-TKI que bloquea la vía de transducción de señales implicadas en la proliferación y supervivencia de las células cancerosas. En un entorno clínico, el tratamiento gefitinib ha sido aprobado para varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer de colon [11]. Sin embargo, la experiencia clínica emergente ha puesto de manifiesto que a pesar de decepcionantemente gefitinib que demuestran cierta actividad antitumoral en cáncer de colon, hay un alto nivel de
de novo
resistencia a tal tratamiento [12]. Por lo tanto, se están realizando esfuerzos para el desarrollo de los regímenes contra el cáncer de colon que combinen gefitinib con otros fármacos.
Las modificaciones epigenéticas, principalmente la metilación del ADN y las histonas acetilación, ahora son reconocidos como los principales mecanismos que contribuyen a fenotipos malignos tumores [13]. Como consecuencia, varios fármacos que afectan las vías epigenéticos han sido aprobados para el tratamiento del cáncer y más están actualmente en ensayos clínicos [14], [15]. En particular, la reversibilidad de las modificaciones epigenéticas por los inhibidores de molécula pequeña significa que desactivar los efectos de destino deben ser mínimos y reversibles tras la interrupción del tratamiento. Recientemente, los inhibidores de la ADN metiltransferasa se encuentran en una etapa más avanzada de desarrollo clínico de los inhibidores de histona desacetilasas o histonas methyltransferases, habiendo sido ampliamente probado en ensayos clínicos de fase I-III [16]. El inhibidor de la decitabina arquetípica ADN metiltransferasa (es decir, 5-aza-2'- desoxicitidina), un análogo de la desoxirribosa de 5-azacitidina, se utiliza actualmente para tratar el síndrome mielodisplásico (MDS), y se encuentra bajo investigación para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda (LMA) y otro tipo de cáncer sólido [17], [18]. Por otra parte, la decitabina y ácido suberanilohydroxamic (SAHA, un inhibidor de la histona deacetilasa) cooperan para sensibilizar a las células de cáncer de colon a Fas ligando inducida por la apoptosis [19].
En la actualidad, se han hecho importantes esfuerzos para desarrollar algunas terapias contra el cáncer basadas en las pequeñas moléculas que se dirigen específicamente a la proteína EGFR o desmetilación del ADN, mientras que, no se conoce mucha información acerca de los efectos combinados de los inhibidores de EGFR y agentes demethylating en el cáncer de colon. Estudios anteriores mostraron gefitinib podrían disminuir la resistencia a la quimioterapia mediante la inhibición de los transportadores transmembrana de la familia ABC, incluyendo la P-glicoproteína (P-gp), la proteína de resistencia a múltiples fármacos 1 (MRP1) y la proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) [20]. Sobre la base de estas premisas, decidimos determinar si la combinación de gefitinib y decitabina tiene actividad sinérgica en las células de cáncer de colon.
En el presente estudio, hemos proporcionado los datos preclínicos que muestran la combinación de gefitinib y decitabina fue sinérgica en inhibición de la proliferación celular, la migración y la inducción de apoptosis en células de cáncer de colon humano cultivadas. Por otra parte, hemos proporcionado las evidencias que gefitinib combinan con decitabina regulada apoptosis de las células estaban involucrados en la vía y la inducción de la expresión XAF1 mitocondrial mediada. Tomados en conjunto, estos datos acumulados pueden guiar el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer de colon.
Materiales y Métodos
cultivo celular, reactivos y medicamentos para el tratamiento
Las líneas celulares de cáncer de colon derivados SW1116 y LOVO se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio DMEM (Gibco; Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) (GIBCO; Life Technologies, Carlsbad, CA) a 37 ° C en 5% de CO
2 incubadora. Las células fueron cultivadas en monocapa y se pasaron rutinariamente 2-3 veces a la semana. decitabina y gefitinib fueron adquiridos de Selleck Químicos LLC (Houston TX, EE.UU.). MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio], dimetil sulfóxido (DMSO), Z-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona (z-VAD-fmk), necrostatin-1 , necrostatin-5 fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Para el tratamiento de drogas, decitabina, gefitinib, z-VAD-FMK, necrostatin-1, y necrostatin-5 se disolvieron en DMSO, respectivamente, las alícuotas se almacenaron a -80 ° C. Las soluciones madre se diluyeron a las concentraciones finales deseadas con medio de crecimiento justo antes del uso. Antes del tratamiento de drogas, se incubaron las células durante al menos 12 h y después se reemplazó con medio que contenía la droga; Se utilizaron células tratadas con DMSO como un control simulado.
Viabilidad de las células, Clonigénicas supervivencia celular y la apoptosis ensayos
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT estándar. Brevemente, las células se sembraron a una densidad de 0,5 a 1 × 10
4 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 12 h en un CO 5%
2 atmósfera a 37 ° C antes del tratamiento de expuestos a fármacos. Los medios se retiraron entonces, y las células se trataron con la decitabina y /o gefitinib. Después las células se incubaron durante 48 h, 100 l de soluciones MTT se añadieron (2 mg /ml) a cada pocillo y la placa se incubó durante otras 4 horas a 37 ° C. Los cristales de formazano formados se disolvieron en DMSO (200 l por pocillo) con agitación constante durante 5 min. La absorbancia de la solución a continuación, se midió utilizando un lector de microplaca (Bio-Rad, Hercules, CA) a 495 nm. Este ensayo se llevó a cabo por triplicado
Para los experimentos de supervivencia de células clonogénicas, las células unidas de la misma placa de cultivo de 10 cm que se tripsinizaron con 1 ml de tripsina-EDTA. (Gibco; Life Technologies, Carlsbad, CA) y se inactiva con medios que contienen 10% de FBS. Las células se contaron usando un hemocitómetro y se sembraron a baja densidad (1.000 por pocillo en seis placa de pocillos). Después de 24 h, se añadieron los fármacos a la concentración indicada por 24 h. Después de la retirada de drogas, se permitió que las células de proliferar en un humidificado 5% de CO
2, 37 ° C ambiente durante 15 días en medio fresco. Las células se fijaron en etanol al 70% y se tiñeron con cristal violeta al 0,005% (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) para el análisis de la supervivencia celular clonogénico como se describe anteriormente [21]. La unidades formadoras de colonias con más de 100 células fueron contadas usando un microscopio de luz.
Medición de la apoptosis fue realizado por Anexina V-FITC (isotiocianato de fluoresceína) /PI (yoduro de propidio) el análisis como se describe anteriormente [22]. Brevemente, las células se sembraron y se tratan con los fármacos durante 48 h. Después, las células se lavaron dos veces con PBS y 1 × 10
6 células se resuspendieron en 1 ml de tampón de unión 1 × Anexina V. Las células que sufren muerte celular apoptótica se analizaron por recuento de las células que se tiñeron positivas para Anexina V-FITC y negativas para PI, y la etapa tardía de la apoptosis como la anexina V-FITC y PI positivo utilizando flujo FACS Calibur citómetro (BD Biosciences, San Jose, CA , EE.UU.).
índice de combinación
para tratamiento de combinación de la decitabina y gefitinib, los datos de ensayo de MTT se convirtieron a fracción de crecimiento afectada por la que las células tratadas de combinación individual del medicamento o en comparación con las células no tratadas y analizados mediante el software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO, EE.UU.) para determinar si la combinación es sinérgica. Este programa se basa en la ecuación Chou-Talalay [23], que calcula un índice de combinación (CI). La ecuación general para el isobolograma clásico está dado por: IC = (D)
1 /(Dx)
1 + (D)
2 /(Dx)
2. Donde Dx indica la dosis de un compuesto solo se requiere para producir un efecto, (D)
1 y (D)
2 son las dosis de los compuestos 1 y 2, respectivamente, necesarios para producir el mismo efecto en combinación. A partir de este análisis, los efectos combinados de los dos compuestos se pueden resumir como sigue: CI & lt; 1, CI = 1, CI & gt; 1 indican efectos sinérgicos, aditivos y antagónicas, respectivamente
análisis de transferencia Western
.
Las células se lisaron en hielo durante 30 min en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS, ácido desoxicólico al 0,5%, 0,02% de azida de sodio, 1% NP-40, 2,0 mg /ml de aprotinina, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM). Los lisados se centrifugaron a 12.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. La concentración de proteína se determinó por el método de colorante de Bradford. Cantidades iguales (30 a 60 g) de extracto de células se sometieron a electroforesis en 6-12,5% de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Darmstadt, Alemania) para la transferencia de anticuerpos. Las membranas se bloquearon y después se incubaron con p-mTOR (Ser2448), mTOR, AKT1, PARP p-AKT (Ser473), p-S6K, S6K, BAX, Bcl-2, se escindió de la caspasa 3 (Asp175), troceados (Asp214) y anticuerpos de actina (todos de Tecnologías de señalización Celular, Massachusetts, EE.UU.). Y los anticuerpos XAF1, XIAP se adquirieron de Abcam (Cambridge, U.K). Posteriormente, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (Protein Tech Group, Chicago, IL) a temperatura ambiente durante 1 h. La detección se realizó con el kit ECL (GE Healthcare; Munich, Alemania)., De acuerdo con las instrucciones del fabricante
Ensayo de actividad de caspasa
ensayos fluorométricos de la actividad de caspasa se llevaron a cabo utilizando el sustrato Ac -DEVD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) para la caspasa 3 y Ac-IETD-AMC (BD Pharmingen, San Diego, CA) para la caspasa 8. brevemente, las células se lisaron en tampón de lisis (HEPES 10 mM, 142 mM KCl, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, 0,2% NP-40 y pH 7,2) con DTT 10 mM. Después de la incubación durante 30 min en hielo, las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm durante 30 min a 4 ° C y el contenido de proteína en los sobrenadantes se determinó por el método de colorante de Bradford. Las alícuotas de 10 mg 100 volumen de ensayo /ml se incubaron con 140 mM tetrapéptido específica del sitio sustratos Ac-DEVD-AMC para la caspasa 3 y Ac-IETD-AMC para la caspasa 8 en un tampón de ensayo de caspasa (HEPES 20 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, 0,01% CHAPS (v /w), 10% de sacarosa y pH 7,2) con DTT 10 mM durante 30 min (v /w). Se determinó la liberación del grupo fluorogénico AMC a 37 ° C en un fluorómetro VersaFluor (Bio-Rad, Hercules, CA) con excitación a 380 nm y emisión a 440 nm.
ARN de interferencia
pequeños ARN de interferencia (siRNA) para la expresión génica XAF1 abajo de la regulación se realizó mediante transfección de oligonucleótidos de ARN con lipofectamina 2000 (Invitrogen, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Un día antes de la transfección, las células SW1116 y LOVO se sembraron en una placa de cultivo de 35 mm en medio RPMI-1640 medio completo. Después las células alcanzaron 50% -60% de confluencia, se transfectaron con siRNAs tal como se describe anteriormente [24]. Brevemente, las células se colocaron en 1 ml de siRNA mezcla con 100 nM siRNA y 5 l de lipofectamina 2000. Después de 8 h de la transfección, se añadió 1 ml de RPMI-1640 medio completo, y los experimentos se llevaron a cabo 48 h después de la transfección. Los niveles de proteína se analizaron por Western blot. El control negativo (NC) siRNA y siRNA contra XAF1 se sintetizaron por Shanghai GenePharma Co. Para XAF1: 5'-AUGUUGUCCAGACUCAGAG-3 '[25];
Extracción de ARN total y cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa PCR
el ARN total se extrajo con el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Se preparó ADNc a partir de ARN total usando cebadores aleatorios (Promega, Madison, EE.UU.) y el kit Omniscript RT (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Los niveles relativos de ARNm se determinaron mediante cuantitativa en tiempo real de transcripción inversa-PCR (RT-PCR) utilizando un Eppendorf Mastercycler realplex (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y kit Quantitect SYBR Green PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). secuencias XAF1 de cebadores utilizados fueron los siguientes: 5'-ATGGAAGGAGACTTCTCGGT-3 'y 5'-TTGCTGAGCTGCATGTCCAG-3' [26]. Actina (Biovision, Palo Alto, CA, EE.UU.) se utilizaron los niveles de ARNm para la normalización.
Estadísticas
Todos los experimentos se repitieron tres veces y se expresaron como media ± desviación estándar.
Los valores P
se calcularon utilizando la prueba t de Student y
P
valor & lt; 0,05 fue considerado significativo. El análisis estadístico se analizaron mediante el paquete estadístico para Ciencias Sociales (SPSS) software (versión 16.0).
Resultados
sinérgicos efectos antineoplásicos inducidas por Decitabine y gefitinib en células de cáncer de colon
para determinar los efectos del tratamiento de combinación de ADN metiltransferasa decitabina inhibidor y gefitinib inhibidor de EGFR en colon humano viabilidad de células tumorales, SW1116 [27] y las células LOVO [28] que lleva de tipo salvaje
EGFR
gen fueron expuestos a diferentes concentraciones de la decitabina o solos o en combinación para un máximo de 48 h gefitinib, seguido de la determinación de la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT. Como se muestra en la Fig. 1A y B, decitabina o gefitinib solos causaron una inhibición dependiente de la concentración de la viabilidad celular con IC
50 valores de 24,2 M (decitabina) y 4,71 M (gefitinib) en las células SW1116, y IC
50 valores de 21,9 M ( decitabina) y 5,33 m (gefitinib) en células LOVO. Además, la Fig. 1A y B mostró que una combinación de la decitabina y gefitinib tenía un efecto inhibidor más fuerte sobre la viabilidad celular de las células SW1116 y LOVO que cualquier compuesto solo. Además, la Fig. 1A indicó que el tratamiento de las células SW1116 con concentraciones fijas de la decitabina se redujo la IC
50 valores de gefitinib desde 4,71 M (en ausencia de la decitabina) a 1,25 M (en presencia de 5 mM decitabina) y 0,19 M (en el presencia de 10 decitabina M). Del mismo modo, el tratamiento de células LOVO con concentraciones fijas de la decitabina se redujo la IC
50 valores de gefitinib desde 5,33 M (en ausencia de la decitabina) a 0,63 M (en presencia de 10 mM decitabina) y 0,12 M (en presencia de 20 mM decitabina) (Fig. 1B).
(a) y (B) las células SW1116 y LOVO se cultivaron en condiciones de control (DMSO) o en presencia de las concentraciones indicadas de la decitabina (DAC) y gefitinib (GEF), solo o en combinación, durante 48 h, y luego evaluados para la viabilidad por el ensayo de MTT. Los resultados son la media de las evaluaciones de duplicados de uno de cada tres experimentos independientes. (C) y se sembraron las células SW1116 y LOVO células (D), se trató, y se procesaron como en A y B. Se determinó la curva de dosis-respuesta de cada fármaco y el índice de combinación (CI) valores para los coeficientes de concentración DAC /GEF (2,5 :1 en las células SW1116, 02:01 en células LOVO) se calcularon según el método de la de Chou-Talalay en el punto de tiempo de 48 h, con la respuesta biológica se expresa como la fracción de células afectadas. símbolo de rectángulo y rombo designan el valor de CI para cada fracción afectada (efecto). CI & lt; 1, CI = 1, CI & gt; 1 indican efectos sinérgicos, aditivos y antagónicas, respectivamente. El efecto varía de 0 (sin inhibición) a 1 (inhibición completa). Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (E) Influencia de las células SW1116 y las células LOVO en el número de células formadoras de colonias, según se evaluó mediante el ensayo clonogénico. Para el ensayo de formación de colonias, el ensayo clonogénico se realizó como se describe en materiales y métodos. Columnas, con una media de tres determinaciones; bares, Dakota del Sur. Los resultados mostrados representan tres experimentos independientes. **,
P Hotel & lt; 0,01, ***,
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con las células tratadas-DAC. ##,
P Hotel & lt; 0,01, ###,
P
. & Lt; 0,001, en comparación con las células tratadas-GEF
Estos datos sugirieron que la dos compuestos, la decitabina y gefitinib, pueden sinergizar para inhibir la viabilidad celular en células de cáncer de colon. Para confirmar este sinergismo, se trataron las células con una combinación de los dos agentes en una relación constante entre sí y utilizó el software Calcusyn para calcular el índice de combinación (CI) siguiendo el procedimiento Chou y Talalay de como se describe en Métodos. Higo. 1C y D revelaron una sinergia significativa entre los dos agentes (CI & lt; 1) en células SW1116 y LOVO. Además, mediante el ensayo clonogénico de supervivencia celular, se encontró que la decitabina y gefitinib ejercieron efectos sinérgicos de inhibir la actividad clonogénico de SW1116 y las células LOVO (Fig. 1E). Además, las pocas células supervivientes decitabina más gefitinib generaron colonias que eran mucho más pequeños en tamaño que los generados por las células supervivientes cualquiera de estos agentes solos (datos no mostrados). En particular, cuando se usan juntos, el tratamiento de células NCM460, un colon humano normal de la mucosa línea de células epiteliales, con la decitabina y gefitinib mostró un efecto mayor que cuando se utilizó cada compuesto individualmente, pero los efectos eran menos de aditivo que sugiere antagonismo (Fig. S1A y B ). Por otra parte, la combinación de una baja concentración de la decitabina (2,5 M) y gefitinib (1 M para las células LOVO y 0,5 M para las células SW1116) la migración de células abrogada eficientemente de una manera sinérgica (Fig. S2A). Mientras tanto, hemos detectado la viabilidad celular de las células de cáncer de colon tratados con los dos agentes solos o en combinación (Fig. S2B), y se encontró que la combinación de baja concentración de la decitabina y gefitinib no disminuyó significativamente la viabilidad celular. Estos resultados indican que la reducción de la migración de las células causado por los dos fármacos no estaba implicado en la inhibición de la viabilidad celular.
Decitabine y combinación gefitinib tratamiento es más eficaz en la inhibición de AKT y mTOR vías de señalización en células de cáncer de colon
decitabina y gefitinib inhibieron significativamente el crecimiento de dos tipos de células de cáncer de colon en comparación con el tratamiento con cualquier agente solo. Como AKT y mTOR vías de señalización desempeñan un papel crítico en el crecimiento celular y la apoptosis de las células, determinamos los efectos de la decitabina y gefitinib en la activación de estas vías. Se calcularon los valores de CI para encontrar además que la combinación de 10 decitabina mu M con 5 M gefitinib en las células SW1116 o 4 gefitinib mu M en células LOVO fue el más efectivo. células SW1116 y LOVO fueron tratados con decitabina y gefitinib solos o en combinación. Después de 48 h, las células fueron procesadas para transferencia Western como se describe en los métodos. Como se muestra en la Fig. 2 A y B, decitabina (10 M) no podían dar lugar a alteraciones significativas en AKT, o la actividad de mTOR, tal como se evaluó mediante Western blot para la fosforilación de AKT, mTOR y S6K. Además, hemos observado reducciones mínimas de la fosforilación de AKT, mTOR y S6K con 5 M gefitinib en SW1116 y 4 M en las células LOVO. Sin embargo, la combinación de los dos fármacos abrogó completamente las actividades de AKT y mTOR en SW1116 y células LOVO (Fig. 2A y B).
(A) y se sembraron las células SW1116 y LOVO (B), se trató para 48 h con decitabina (DAC) y gefitinib (GEF) ya sea solo o en combinación, y los niveles de expresión de AKT, mTOR, S6K, y la fosforilación se determinó mediante análisis de transferencia Western como se describe en Métodos. La expresión de β-actina sirvió como control de carga. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
Decitabine Mejora Sinérgicamente gefitinib inducida por apoptosis en células de cáncer de colon
Para determinar si los efectos citotóxicos de gefitinib en combinación con decitabina eran debido a la inducción de la apoptosis, las células SW1116 y LOVO se trataron con los dos compuestos, solos o en combinación, durante 48 h y luego celular apoptosis se determinó por Anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) tinción y citometría de flujo análisis. Como se muestra en la Fig. 3A y C, el tratamiento con gefitinib (2 M o 5 M) o decitabina (10 M) solo tuvieron efectos débiles sobre la apoptosis en las células SW1116. Sin embargo, hubo una tasa de apoptosis significativamente más alto encontrado después del tratamiento con la combinación de gefitinib y decitabina (Fig. 3A y C). Se encontraron resultados similares en células LOVO (Fig. 3B y C). Además, la apoptosis celular se midió mediante la detección de población sub-G1 con tinción con PI y citometría de flujo análisis. Como se muestra en la Fig. S3, los porcentajes de población sub-G1 inducidas por los tratamientos con la combinación de dos drogas fueron mayores que los inducidos por los fármacos individualmente.
(A) y (B) SW1116 y las células LOVO se cultivaron en condiciones de control ( DMSO) o en presencia de las concentraciones indicadas de la decitabina (DAC) y gefitinib (GEF), solo o en combinación, por 48 h. Y a continuación, las células se tiñeron con yoduro de Anexina V-FITC y de propidio (PI) y se analizaron por citometría de flujo. Este experimento se realizó por triplicado y los diagramas representativos de los ensayos de Anexina V-FITC se muestran. (C) La medición cuantitativa de flujo de Anexina V-FITC citometría de análisis mostró células apoptóticas positivas en respuesta a DAC y GEF, solo o en combinación. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. **,
P Hotel & lt; 0,01, ***,
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con las células tratadas-DAC. ##,
P Hotel & lt; 0,01, ###,
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con las células tratadas por el FMAM. (D) y (E) las células SW1116 y LOVO se trataron previamente con 10 mM z-VAD-fmk (zVAD) o 20 mM necrostatin-1 (Nec1) o necrostatin-5 (Nec5) durante 1 h seguido de tratamiento con el concentraciones indicadas de DAC y GEF, solo o en combinación, para adicional 48 h. Y a continuación, las células apoptóticas se determinaron por Anexina V-FITC /PI tinción y citometría de flujo análisis. Este experimento se repitió tres veces. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. **,
P
. & Lt; 0,01
Para determinar si o no gefitinib más decitabina causó cascada de caspasas, se utilizó el inhibidor de caspasa sartén z-VAD-FMK (10 M) para pretratar las células SW1116 o LOVO antes del tratamiento de gefitinib más decitabina. Como se muestra en la Fig. 3D y E, z-VAD-FMK pudo contenerse notablemente la apoptosis celular inducida por gefitinib más decitabina. Sin embargo, la apoptosis de las células provocada por los dos compuestos en combinación no pudo ser bloqueado por necrostatin-1 o necrostatin-5, una nueva clase de inhibidores de moléculas pequeñas potentes de necrosis celular. Estos resultados revelaron que la ruta apoptótica estaba involucrado en la muerte celular inducida por gefitinib combinado con decitabina, en células de cáncer de colon.
Decitabine y gefitinib Terapia Combinada altera los niveles de expresión de factores reguladores de apoptosis en células de cáncer de colon
Dado que la apoptosis está estrechamente regulada por miembros pro y anti-apoptóticas de la familia de proteínas Bcl-2, los factores pro-apoptóticos BAX, BID y BIM, así como las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-XL se estudiaron en SW1116 y LOVO las células después del tratamiento con decitabina o gefitinib o su combinación por análisis de transferencia Western. células SW1116 y LOVO que responden a la decitabina más gefitinib manifiestan una mayor cantidad de la proapoptótico BAX, así como reducción importante en los niveles de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 (Fig. 4A y B). Sin embargo, los dos compuestos en combinación no afectaron los niveles de expresión de otros miembros de la familia de proteínas Bcl-2, incluyendo las proteínas pro-apoptóticos de la DIS y BIM, así como la proteína antiapoptótica Bcl-XL (datos no mostrados).
células SW1116 y LOVO se sembraron, tratado por 48 (DAC) y gefitinib (GEF) ya sea solo o en combinación. (A) y (B) los niveles de expresión de caspasa 3 escindido con, escindido con PARP, XAF1, XIAP, Bax, Bcl-2 se determinaron por análisis de transferencia Western como se describe en Métodos. La expresión de β-actina sirvió como control de carga. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. (C) y (D) La actividad de la caspasa 3 se cuantificó como se describe en los métodos. Este experimento se repitió tres veces. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
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P Hotel & lt; 0,001. (E) y (F) La actividad de la caspasa 8 se cuantificó como se describe en Métodos. Este experimento se repitió tres veces. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. *,
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inhibidor de la proteína de la apoptosis (IAP) es una familia de proteínas que actúan a través de la inhibición de la actividad de caspasa. El IAP ligada al cromosoma X (XIAP), un miembro de IAP, y asociada a XIAP factor de 1 (XAF1) se examinaron en las células de cáncer de colon estimulado con decitabina junto con gefitinib. Higo. 4A y B indicaron que no hay cambios en los niveles de proteína XIAP se encontraron en células SW1116 y LOVO tratados por la decitabina y gefitinib solos o en combinación. En particular, el tratamiento combinado con ambos fármacos se incrementó notablemente la expresión de XAF1 comparación con el tratamiento de agente único (Fig. 4A y B).
Para probar la capacidad de gefitinib se combina con la decitabina para activar las caspasas, caspasa 3 escindida y se escindió PARP se estudió en células SW1116 y LOVO después del tratamiento con gefitinib o decitabina o su combinación por análisis de transferencia Western. Aumento significativo de las cantidades tanto de caspasa 3 escindida y PARP escindida se observaron en las células del cáncer de colon tratados con dos medicamentos combinados en comparación con el tratamiento con los fármacos solos (Fig. 4A y B). Por otra parte, se analizaron las células de cáncer de colon tratados por los dos compuestos para la caspasa 3 y caspasa 8 actividades de escisión de sustrato fluorogénico. Como se muestra en la Fig. 4C y D, las células de cáncer de colon tratados con dos compuestos en combinación mostraron aumento significativo en la actividad de caspasa 3. Además, la decitabina más gefitinib ejercidas caspasa 3 inducciones de actividades dependientes del tiempo en SW1116 y las células LOVO (Fig. 4C y D). Por el contrario, no se encontraron cambios en la caspasa 8 actividades (Fig. 4E y F).
XAF1 desempeña un papel fundamental en la apoptosis celular desencadenada por Decitabine combinado con gefitinib
Los datos se muestra arriba indicada que decitabina combinado con gefitinib aumentó los niveles XAF1 en células SW1116 y LOVO. Luego preguntamos si los dos fármacos en combinación podrían aumentar los niveles de mRNA XAF1 en células de cáncer de colon. Como se muestra en la Fig. 5A y B, los niveles de mRNA XAF1 se incrementaron de manera significativa por la decitabina más gefitinib. Además, las células de cáncer de colon fueron tratados con los dos fármacos en combinación para diferentes intervalos de tiempo. Hemos demostrado que la proteína y los niveles de mRNA XAF1 se incrementaron en más gefitinib decitabina en una forma dependiente del tiempo (Fig. 5C, D, E y F)
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(A) y células SW1116 y LOVO (B) eran tratadas durante 48 h con las concentraciones indicadas de la decitabina (DAC) y gefitinib (GEF) ya sea solo o en combinación. Los niveles de expresión de ARNm de XAF1 se determinaron mediante PCR en tiempo real cuantitativa. La expresión de β-actina sirvió como control. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. **,
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P Hotel & lt; 0,001. (C) y (D) SW1116 y las células LOVO se trataron durante los intervalos de tiempo indicados con las concentraciones indicadas de DAC y GEF en combinación. Los niveles de expresión de XAF1 se determinaron por análisis de transferencia Western como se describe en los métodos. La expresión de β-actina sirvió como control de carga. Los datos son representativos de tres experimentos independientes. bares, Dakota del Sur. bares, Dakota del Sur. Como se muestra en la Fig. bares, Dakota del Sur.