Extracto
La quercetina y 2-Methoxyestradiol (2-ME) son prometedores contra el cáncer sustancias. Nuestra anterior
in vitro
estudio mostró que la quercetina sinergizada con 2-Methoxyestradiol que exhibe una mayor actividad antiproliferativa y proapoptótico en ambos LNCaP andrógeno-independientes y PC-3 líneas celulares de cáncer de próstata humano andrógeno-dependientes. En el presente estudio, se determinó si su combinación podría inhibir LNCaP y PC-3 xenoinjerto el crecimiento del tumor
in vivo
y exploramos el mecanismo subyacente. cáncer de próstata humano LNCaP y células PC-3 se inocularon por vía subcutánea en ratones machos BALB /c desnudos. Cuando los xenoinjertos de tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm
3, los ratones fueron asignados al azar para el control del vehículo, la quercetina o 2-Methoxyestradiol grupos tratados individualmente y tratamiento de combinación. Después de la intervención terapéutica durante 4 semanas, el tratamiento de combinación de la quercetina y 2-ME i) inhibió significativamente la próstata xenoinjerto de cáncer de crecimiento del tumor al 46,8% de LNCaP y 51,3% para la PC-3 en comparación con el grupo de control del vehículo, más eficaz que la quercetina (un 28,4% para LNCaP, 24,8% para PC3) o 2-ME (32,1% para LNCaP, 28,9% para PC3) por sí sola; ii) fue bien tolerada por los ratones BALB /c y no hay reacciones tóxicas evidentes fueron observadas; iii) condujo a una mayor relación de Bax /Bcl-2, se escindió expresión de la proteína caspasa-3 y la tasa de apoptosis; y iv) resultó en menor AKT fosforilada (pAKT) nivel de proteína, la proteína del factor de crecimiento endotelial vascular y la expresión de ARNm, la densidad microvascular y la tasa de proliferación que el tratamiento solo medicamento. Estos efectos fueron más notable en comparación con el grupo de vehículo. Por lo tanto, la combinación de la quercetina y 2-ME puede servir como una novela régimen de tratamiento clínico que posee el potencial de mejorar el efecto antitumoral en cáncer de próstata
in vivo
y la disminución de las dosis y los efectos secundarios de cualquiera de quercetina o 2-ME solo . Estos
in vivo
resultados se sentar una base sólida para más investigaciones posteriores sobre esta novela régimen terapéutico en el cáncer de próstata humano
Visto:. Yang M, L canción, Wang H, J Wang, Xu Z, Xing N (2015) Combinación de la quercetina y la 2-Methoxyestradiol aumenta la inhibición de cáncer de próstata humano LNCaP y células PC-3 el crecimiento del tumor de xenoinjerto. PLoS ONE 10 (5): e0128277. doi: 10.1371 /journal.pone.0128277
Editor Académico: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
Recibido: 9 de diciembre de 2014; Aceptado: April 23, 2015; Publicado: 26 de mayo de 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:.. el trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales Pekín (n. ° 7.122.075)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la segunda causa de mortalidad por cáncer en los hombres, con un estimado de 233.000 nuevos casos y 29.480 muertes en Estados Unidos en 2014 [1]. A pesar de que puede ser curada por la prostatectomía radical o la radiación en una etapa temprana, la mayoría de los pacientes sufren de recidiva local y metástasis a distancia más tarde [2]. Después de un tratamiento eficaz de la ablación de andrógenos en los primeros 1-3 años, por lo general se desarrolla en cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) caracterizado con elevada del antígeno prostático específico (PSA), una mayor tasa de metástasis, más agresividad, etc. [3]. La combinación de docetaxel y prednisona, la primera línea de quimioterapia sistémica estándar para CRPC, no es curativo y sólo prolonga el tiempo de supervivencia global por un período corto. Además, hace que los pacientes sufren de efectos secundarios graves [4]. Por lo tanto, es de necesidad urgente de desarrollar nuevas terapias con medicamentos que pueden superar estas deficiencias trabajar solos o en combinación para el CRPC.
La quercetina (3, 3 ', 4', 5, 7-pentahidroxiflavona, Que), un flavonoide abundante bioactivo en verduras y frutas, especialmente en las cebollas, manzanas, té y vino tinto, ha exhibido propiedad anti-tumor prometedora en muchas células cancerosas humanas incluyendo cáncer de próstata tanto in vitro como in vivo [5,6]. Sin embargo, debido a la baja biodisponibilidad, su efecto anti-tumor se ha restringido en gran medida. Con el fin de superar esta deficiencia, la quercetina se ha combinado con otros fármacos contra el cáncer para mejorar la inhibición de diversos tumores, incluyendo cáncer de próstata [6,7,8].
2-Methoxyestradiol (2-ME), una derivado endógeno natural de 17β-estradiol (E2) rara vez exhiben actividad estrogénica, se ha informado de demostrar la acción anti-cáncer en una amplia gama de tumores [9]. Como el cáncer de próstata, 2-ME puede inhibir las células cancerosas tanto andrógeno-dependientes e independientes de andrógenos in vitro e in vivo [10,11]. Sin embargo, 2-ME tiene la desventaja de la accesibilidad biológica limitada y rápida degradación [12]. Con el fin de resolver el problema, la combinación de fármacos se ha propuesto y despertado mayor efecto anticanceroso con menos efectos secundarios en comparación con el tratamiento farmacológico solo [10,13]
.
Por lo tanto, a pesar de la desventaja común de baja biodisponibilidad de tanto quercetina y 2-ME, parece optimista cuando se combinan con otras sustancias debido efecto cáncer tratado. Previamente, se realizó un uso combinado de quercetina y 2-ME, tanto en PC-3 líneas celulares de cáncer dependientes de andrógenos LNCaP y andrógeno-independiente de próstata humano y encontró un antiproliferativo sinérgico y el efecto proapoptótico en comparación con quercetina o 2-ME sola [14] . El presente estudio fue investigar el efecto combinado de la quercetina y 2-ME en LNCaP y PC-3 xenoinjertos de tumores in vivo y estudiar el mecanismo por primera vez.
Materiales y Métodos
Química reactivos
quercetina, 2-Methoxyestradiol, hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) y carboximetilcelulosa (CMC) fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). medio RPMI-1640, un 0,25% de tripsina-EDTA y suero bovino fetal se obtuvo de Hyclone (Logan, UT, EE.UU.), y Matrigel fue de BD Biosciences (Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.).
Líneas celulares y Cell Culture
cáncer de próstata humano LNCaP dependiente de andrógenos y PC-3 líneas de células independientes de andrógenos (dos líneas celulares de uso común que ha sido utilizado por muchos otros investigadores [15,16,17]), obtenido de Pekín Unión Medical College, se cultivaron en medio RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone) y se coloca en la incubadora que contiene 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C.
estudio de animales
Todos los procedimientos experimentales relacionados con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal y el Comité de ética de la Universidad médica de capital (Número de Permiso: 2013-X-83). Balb /c ratones desnudos macho de 4-6 semanas de edad fueron proporcionados por el ministerio de los animales experimentales de la Universidad Médica de capital y se mantienen en ambiente libre de patógenos con la luz de 12 horas de oscuridad, humedad /temperatura controlada y. Los ratones se les permitió familiarizarse con el nuevo entorno durante una semana antes del comienzo del experimento.
Antes del experimento formal en vivo, se evaluó la toxicidad de los dos fármacos combinados y vehículo que serían administrados simultáneamente utilizando dos grupos de hombres BALB /c ratones desnudos (n = 5 cada uno). Disolvente para la quercetina fue 25% de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD, w /v en ddH
2O) y para 2-Methoxyestradiol fue 25% HPβCD que contiene 0,5% de carboximetil celulosa (CMC, w /v en ddH
2O ) [10,18]. grupo de fármacos se les dio los dos fármacos, a saber, la quercetina disuelta y 2-ME, y el grupo de control del vehículo recibieron dos vehículos libres de drogas, a saber, el 25% HPβCD que contiene o no contiene un 0,5% de CMC. Después de la operación, se observó reacción tóxica en los ratones de ambos grupos representados estado mental como pobre, la ligera torsión del cuerpo, convulsiones y ocasional hematuria moderada que estaban en consonancia con la descripción de Ehteda A y se puede atribuir a la alta concentración de HPβCD [10 ]. Por esta razón, en el experimento posterior, la combinación de la quercetina y 2-ME se llevó a cabo de esta manera: la quercetina se le dio en el día 1, seguido de 2-ME administra el día 2.
Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea con 5 × 10
5 células PC-3 en suspensión en 100 pl de PBS y 2 × 10
8 células LNCaP suspendidas en 100 pl de matrigel y la mezcla de PBS (1: 1) en la parte posterior derecha. Cuando los tumores de xenoinjertos alcanzaron un volumen de aproximadamente 100 mm
3, los ratones fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos (n = 8 cada grupo) y se trataron por vía intraperitoneal. esquema terapéutico basado en nuestros resultados in vitro, experimentos preliminares y estudios de muchos otros investigadores fue el siguiente: (1) grupo de control de vehículo: vehículo de quercetina en el día 1, el vehículo de 2-ME en el día 2, (2) Grupo de quercetina tratada : quercetina 75 mg /kg el día 1, el vehículo de 2-ME en el día 2, grupo (3) 2-me trataron: vehículo de quercetina en el día 1, 2-ME 150 mg /kg el día 2, (4) grupo de tratamiento de combinación : quercetina 75 mg /kg el día 1, 2-ME de 150 mg /kg el día 2. Dos días fue un ciclo de tratamiento y todo el proceso de tratamiento se prolongó durante 4 semanas [13,19,20,21,22,23]. tamaños de los tumores fueron monitoreados se calcularon cada 2 días utilizando pinza y tumor volumen de acuerdo con la fórmula: L × S
2 × 0,5, en la que L representa el diámetro más largo y S representa el diámetro más corto del tumor [10]. Los ratones se pesaron también. Al final del procedimiento de tratamiento, en el día 29, los ratones se anestesiaron con hidrato de cloral y se sacrificaron por dislocación cervical. xenoinjertos de tumores fueron llevados a cabo con rapidez y se pesaron. Una parte de ella se puso en nitrógeno líquido inmediatamente para el análisis de biomarcadores futuro y la otra parte se fijó en formalina al 10% tamponada neutra para el análisis inmunohistoquímico. También se detectaron los parámetros bioquímicos séricos, tales como ALT, AST, creatinina y nitrógeno de urea que reflejaban la toxicidad del fármaco.
análisis de transferencia de Western
Los tejidos tumorales se mezclaron con tampón de lisis RIPA (Applygen Inc., Beijing , china) que contiene cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Suiza). Los lisados se centrifugaron y se recogió el sobrenadante. Después se cuantifica utilizando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, EE.UU.), 80 g de proteína se separó en un 6% a un 12% SDS-PAGE y transferidos al fluoruro de polivinilideno (PVDF) membrana (Pall, NY, EE.UU.), que fue entonces bloqueado por 5% de leche no grasa y se incubaron con anticuerpos primarios: Bcl-2 (1: 1000, Cell Signaling, Beverly, MA), Bax (1: 1000, Cell Signaling), caspasa-3 (1: 1000, Cell Signaling), AKT y pAKT (1: 1000, Cell Signaling), VEGF (1: 500, Abcam) a 4 ° C durante la noche, GAPDH (1: 10.000, Sigma) a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpos secundarios (1: 2000, Cell Signaling) de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas de complejos antígeno-anticuerpo se detectaron mediante kit de quimioluminiscencia (ECL-Plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.). GAPDH se utilizó como control de carga.
inversa de la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real de transcripción-cuantitativo (RT-qPCR)
RNA total de tejido tumoral se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y primera beta diana cDNA se sintetizó usando Transcriptor Primera Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Alemania) con oligo (dT) cebadores. Las secuencias de los cebadores VEGF y ß-actina fueron los siguientes: VEGF humano: Delantero: 5'-TCTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ', inversa: 5'-GATGATTCTGCCC TCCTCCTT-3'. β-actina: Delantero: 5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3 ', inversa: 5'-GTGGCCAT CTCTTGCTCGAA-3'. La exactitud de los productos PCR se verificó mediante secuenciación de ADN.
20 l total mezcla de reacción consistía en 10 l SYBR verde PCR Master Mix (Applied Biosystems), 8 l ddH
2O, plantilla 1μL ADNc y cebadores 1μL reaccionaron siguiendo las condiciones de ciclo térmico: un ciclo a 50 ° C durante 2 minutos, seguido de 95 ° C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos y 60 ° C durante 1 minuto, cada muestra fue por triplicado (VIIa 7 Sistema de PCR en tiempo real, Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). nivel de ARNm de VEGF se calculó de acuerdo con la 2
-. Método (ΔΔCt) y luego se normaliza a ß-actina expresión
La inmunohistoquímica
Los tejidos tumorales se fijan por primera vez en 10% de formalina tamponada neutra . Después de parafina se retiró usando series xileno, los portaobjetos se rehidrataron con serie de etanol y se incubaron con 3% de H
2O
2 a fin de eliminar la actividad peroxidasa endógena. Después de la recuperación de antígeno, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo primario CD31 (1:50, Abcam), CD34 (1: 100, Abcam), caspasa-3 (1: 500, Señalización Celular) y Ki67 (1: 500, Abcam) a 4 ° C durante la noche. Las secciones se lavaron con PBS 3 veces y se incubaron con anticuerpo de rábano picante conjugada con peroxidasa secundario (1: 100, la señalización celular) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron por la reacción de diaminobencidina y de contraste con hematoxilina. Número de CD31, CD34 vasos manchados y la caspasa-3, se analizaron las células Ki67 positivas a partir de 3 campos de alta potencia al azar de cada diapositiva. Las secciones con anticuerpo primario ausente y la misma concentración de anticuerpo secundario sirvieron como control negativo.
El análisis estadístico
Los datos del experimento se expresaron como media ± desviación estándar. SPSS 17.0 y 10.0 Sigma Plot se utilizaron para el análisis estadístico y la trama. Las comparaciones entre los grupos tratados y control del vehículo se realizaron con T para muestras independientes de prueba. Valor de p & lt; 0,05 fue considerado para ser significativamente diferentes.
Resultados
combinación de la quercetina y 2-ME aumento de la inhibición del crecimiento de tumores de xenoinjertos de cáncer de próstata
Hombre Balb /c ratones nude con PC células LNCaP -3 y xenoinjertos de tumores se trataron con vehículo, Que o 2-ME y su combinación y el procedimiento se prolongó durante 4 semanas. Cuando se sacaron los tumores, era obvio que ambos PC-3 y LNCaP xenoinjertos de tumores en Que o grupo de tratamiento 2-ME eran más pequeños que el control y la inhibición fue más notable en Que y 2-ME grupo de co-tratamiento (figuras 1A y 2A). tumores de xenoinjertos de PC-3 en Que, 2 ME-y la terapia de combinación grupos fueron inhibidas por 24,8%, 28,9% y 51,3% respectivamente, en comparación con el control del vehículo (Fig 1B y 1C), y para LNCaP, la tasa de inhibición fueron 28,4%, 32,1 % y 46,8%, respectivamente (figura 2B y 2C). Durante todo el proceso de intervención, Que, 2-ME y su combinación fueron bien toleradas por los ratones a la dosis seleccionada, la pérdida de peso en los tres grupos de tratamiento no fueron significativamente diferentes de control (figuras 1D y 2D). No hubo diferencias en la comida diaria y el consumo de agua entre grupos. Otra reacción tóxica relacionada con las drogas y vehículos tales como mal estado de metal, no se observó hematuria. No se encontraron diferencias significativas en los parámetros bioquímicos séricos tales como ALT, AST, creatinina y nitrógeno de urea que reflejan la toxicidad del fármaco en el hígado y el riñón entre antes y después del tratamiento.
(A) PC-3 xenoinjertos de tumores eran más pequeños en que o 2-ME grupo de tratamiento que el control del vehículo, y la inhibición fue más notable en que y grupo 2-ME co-tratamiento. El peso del tumor (B) y el volumen del tumor (C) se redujeron significativamente por la terapia de combinación, más obvio que Que o 2-ME solo. No hubo diferencia significativa en el peso del ratón entre los grupos (D). Los datos se representan como media ± SD. * P & lt; 0,05 en comparación con el control,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
.
(a), los tumores LNCaP xenoinjertos fueron menores en que o 2-ME grupo de tratamiento que el control del vehículo, y la inhibición fue más notable en el grupo de tratamiento de combinación. Que la terapia de combinación y 2-ME peso reducido del tumor (B) y el volumen del tumor (C) en gran medida, más eficaz que Que o 2-ME solo. No se observó una influencia significativa en el peso del ratón entre los grupos (D). Los datos se representan como media ± SD. * P & lt; 0,05 en comparación con el control,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
.
Efecto de quercetina con 2-ME tratamiento de combinación en Bax y expresión de la proteína Bcl-2
Western blot mostró que la combinación de que y 2-ME mejorada inducción de la apoptosis mediante la regulación de la proteína proapoptótica Bax y anti-apoptótica expresión de la proteína Bcl-2. Como muestra la figura 3A, Bax aumentó y Bcl-2 se redujo en los grupos individuales o combinados tratados con fármaco, tanto de los tejidos tumorales de xenoinjerto LNCaP PC-3 y. Efecto de la apoptosis inducida se determinó por la relación de Bax /Bcl-2, que se incrementó en Que o 2-ME grupo tratado en comparación con el control, y la terapia combinada llevó a un aumento adicional (Fig 3B y 3C).
(A) de transferencia Western detectó Bax y expresión de la proteína Bcl-2. (B, C) Relación de Bax /Bcl-2 se representa como media ± SD (media por triplicado). * P & lt; 0,05 en comparación con los controles no tratados,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
Efecto de quercetina con 2-ME tratamiento de combinación de la relación de exfoliados caspasa-3 /caspasa-3
Efecto de la quercetina y 2-ME en relación exfoliados caspasa-3 /caspasa-3 se determinó por Western blot. Como se muestra en la figura 4A y 4B, escindida relación de la caspasa-3 /caspasa-3 elevada en quercetina o tejido tumoral PC-3 2-ME tratada y este efecto fue más evidente en el grupo co-tratamiento. El mismo fenómeno se observó en el tejido tumoral LNCaP (Fig 4A y 4C).
(A) de transferencia de Western de expresión de proteínas detectado exfoliados caspasa-3 y caspasa-3. (B, C) Relación de exfoliados caspasa-3 /caspasa-3 fue representado como medias ± SD (media por triplicado). * P & lt; 0,05 en comparación con los controles no tratados,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
Efecto de la quercetina tratamiento con 2-ME combinación sobre la proliferación del tumor (Ki67) y la apoptosis (caspasa-3)
el análisis inmunohistoquímico mostró que la tasa de proliferación de tejido PC-3 y LNCaP tumores se redujeron en 36,2 % y 44,5%, respectivamente, en los grupos de co-tratamiento en comparación con el control (p & lt; 0,05 y 0,01, respectivamente), más obvio que la quercetina (22,6% para PC-3, 27,3% para LNCaP) y 2-ME (26,7% para PC-3 , 32% para LNCaP) solo (Fig 5A-5C). Mientras que la quercetina o 2-ME tratamiento único aumentaron en gran medida de la caspasa-3 células positivas (quercetina: 1,35 veces para PC-3, 1,77 veces mayor para LNCaP 2-ME:. 1,8 veces para PC-3, 1,95 veces mayor para LNCaP, en comparación con el control) , co-tratamiento resultó en más de caspasa-3 células positivas (2,43 veces para PC-3, 2,56 veces para LNCaP, en comparación con el control) (p & lt; 0,01) (Fig 5D-5F). Estos resultados indican que la quercetina combina con 2-ME inhibió la proliferación y promueven la apoptosis tanto de tejido PC-3 y LNCaP tumor en un grado mayor.
(A, D) Detección inmunohistoquímica mostró Ki67 y 3 caspasa-células positivas tanto en PC-3 y xenoinjertos de tumores LNCaP. Número de Ki67 (B, C) y la caspasa-3 (E, F) estuvieron representados células positivas como medias ± SD, el número fue de tres campos de alta potencia al azar por diapositiva (microscopía de luz, HPF, 400 ×). * P & lt; 0,05 en comparación con el control,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
.
Efecto de quercetina con 2-ME tratamiento de combinación en la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /vía de señalización AKT
Western blot reveló que no había diferencias significativas en la expresión de la proteína AKT entre grupos, tanto en PC-3 y LNCaP tejido tumoral de xenoinjerto (Fig 6A, 6D y 6E). Considerando que, proteína pAKT se redujo en gran medida en los grupos de monoterapia en comparación con el grupo tratado con el vehículo y la inhibición fue mucho más notable en quercetina y 2-ME grupo tratado combinación (Fig 6A-6C).
(A) y pAKT expresión de la proteína AKT se examinaron mediante transferencia Western. Los valores de pAKT (B, C) y AKT (D, E) se representan como media ± desviación estándar (valores de tres experimentos independientes). * P & lt; 0,05 en comparación con los controles no tratados,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
Efecto de la quercetina y 2-ME tratamiento combinado en la proteína VEGF y la expresión del ARNm
a partir de la figura 7A-7C, se pudo observar que la combinación de la quercetina y 2-ME redujo significativamente la expresión de la proteína VEGF en comparación con tratamiento individual, que a su vez exhibió una inhibición más fuerte que el control del vehículo. En cuanto a mRNA de VEGF, Q-PCR mostró un nivel inferior en los grupos de terapia individual por debajo de control, y el efecto de supresión se reforzó aún más en el grupo de co-tratamiento alguno en PC-3 o tejidos tumorales LNCaP (p & lt; 0,01) (Figura 7D y 7E ).
proteína VEGF (A) y ARNm) de expresión (D, e fueron examinados por Western blot y PCR cuantitativa en tiempo real. Los valores de proteína VEGF (B, C) y ARNm (D, E) se representan como media ± desviación estándar (valores de tres experimentos independientes). * P & lt; 0,05 en comparación con los controles no tratados,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
efecto de la quercetina con 2-ME tratamiento de combinación de la densidad de microvasos
efecto de inhibición sobre la densidad de microvasos representado por CD31 y CD34 en el tejido del tumor PC-3 y LNCaP xenoinjerto de quercetina y 2-ME se procedió a investigar por inmunohistoquímica. En los tejidos PC-3 de tumor, el tratamiento combinado dio como resultado una notable disminución de CD31 y CD34 (60,87% y 56,1%, respectivamente) expresión en comparación con el grupo tratado con vehículo (P & lt; 0,01), mientras que la tasa reducir eran 26,09% para CD31, 39.02 % para CD34 en quercetina grupo y 43,38% aplica para CD31, 36,59% para CD34 en 2-ME grupo utilizado (Fig 8A, 8B, 8D y 8E). En los tejidos tumorales LNCaP, CD31 y CD34 se redujeron en un 50% y 49,09%, respectivamente, en el grupo de tratamiento de combinación en comparación con el control del vehículo (P & lt; 0,01), y, al mismo tiempo, la quercetina o 2-ME solo también provocaron regulación por disminución de CD31 y CD34 (quercetina: 27,45% para CD31, CD34 30% de 2-ME:. 29,41% para CD31, CD34 32.73% para) (Fig. 8A, 8C, 8D y 8F)
(a, D) El examen inmunohistoquímico mostró CD31 y CD34 positivos los buques tanto en PC-3 y tejido tumoral de xenoinjertos de LNCaP. Número de CD31 (B, C) y CD34 (E, F) los vasos positivos se representan como media ± SD, el número fue de tres campos aleatorios de alta potencia por diapositiva (microscopía de luz, HPF, 400 ×). * P & lt; 0,05 en comparación con el control,#P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo tratado quercetina, ※ P & lt; 0,05 indica una diferencia significativa entre el grupo de tratamiento combinado y el grupo 2-me trató
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Discusión y Conclusiones
Con el aumento de la incidencia y mortalidad del cáncer de próstata y en base a la actual situación adversa tratamiento para el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC) [1,4], la combinación de fármacos ha atraído una gran atención debido a la ventaja de una mayor efecto contra el cáncer, la dosis menor de drogas, efectos secundarios reducidos, etc. en este documento, después de nuestra anterior investigación in vitro [14], se realizó un estudio de la combinación de la quercetina con 2-ME para actuar sobre el cáncer de próstata humana LNCaP y PC 3-xenoinjerto de tumor en ratones BALB c ratón macho /nude y se encontró que el uso combinado de inhibición del crecimiento del tumor de xenoinjerto que se atribuyó a la inducción de apoptosis, inhibición de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y la vía de señal /Akt y la angiogénesis aumentada.
La quercetina y 2-ME son prometedores sustancias contra el cáncer de próstata. Como agente único, la quercetina se ha verificado para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata tanto in vitro como in vivo [5,6]. Nuestro estudio anterior también encontró que la quercetina inhibe el crecimiento de células LNCaP a través de regulación a la baja de los receptores de andrógenos y sus inducible genes [24]. Lo que es más, la quercetina es de muy baja toxicidad y rara vez produce efectos secundarios, incluso a altas dosis de 200 mg /kg administrada a ratas y ratones SCID [19,20], y los ensayos clínicos mostraron que el consumo total de quercetina 1000 mg por día podría ser bien tolerado en humanos no está asociada con ningún efecto secundario [25,26]. 2-ME crecimiento también inhibe las células de cáncer de próstata y xenoinjertos de tumores que no produce toxicidad hematológica como otros MTA [10,11,13]. Alta dosis de 150 mg /kg para los animales en caminos preclínicos [13] y 1000 mg o 1500 mg por vía oral cuatro veces al día durante humano en fase I y II de los ensayos podrían ser bien tolerado sin efectos tóxicos evidentes [27,28].
Sin embargo, a pesar de estos resultados esperanzadores para el cáncer de próstata, la quercetina y 2-ME ambos tienen la desventaja de una baja biodisponibilidad que descuenta su efecto contra el cáncer de próstata. Por lo tanto, se han combinado con otros agentes, por ejemplo, la quercetina con el té verde, los fitoestrógenos en la dieta y el tamoxifeno [6,20,29,30], 2-ME con albendazol, docetaxel y eugenol [10,13,31], y todos mostraron mayor efecto contra el cáncer de próstata, incluso a dosis bajas, que en gran medida loco hasta la biodisponibilidad insuficiente. Chang et al informaron de que la combinación de la quercetina y 2-ME aumento del efecto citotóxico sobre las células de carcinoma hepatocelular (HCC), en comparación con quercetina o 2-ME sola [32]. Se especula que el uso simultáneo de la quercetina y 2-ME crearía mayor efecto contra el cáncer de próstata con más seguridad y menos toxicidad. Nuestra anterior experimento in vitro mostró que el uso combinado de quercetina y 2-ME exhibieron inhibición sinérgica de la proliferación y la inducción de apoptosis en ambas PC-3 líneas celulares de cáncer de próstata dependientes de andrógenos LNCaP y independientes de andrógenos humanos en comparación con un solo fármaco, y se se atribuyó a la detención del ciclo celular y la disminución de Bcl-2 relación /Bax [14]. Pero no se sabe sobre el efecto in vivo sobre el cáncer de próstata y los resultados in vitro no se puede aplicar directamente a clínica. Por lo tanto, se combinaron quercetina con 2-ME para actuar en LNCaP y xenoinjerto PC3 tumor y se encontró que el crecimiento de tratamiento de combinación inhibido tumor de xenoinjerto por 46,8% para LNCaP y 51,3% para PC3 en comparación con el control del vehículo, más eficaz que la quercetina (28,4% para LNCaP, 24,8% para PC3) o 2-ME (32,1% para LNCaP, 28,9% para PC3) por sí sola. Por otra parte, fueron bien toleradas y no se observó ninguna reacción tóxica obvia en todo el proceso de tratamiento. Está comprobado que la combinación de la quercetina y 2-ME podría inhibir el crecimiento del cáncer de próstata in vivo en un grado más grande con más efectividad y seguridad.
La terapia dirigida se ha considerado fundamental para efecto quimioterapéutico de los productos naturales y fitoquímicos [33 ]. La quercetina y 2-ME puede actuar sobre algunas vías de señalización que conducen a inhibir eficazmente el crecimiento del cáncer de próstata, especialmente cuando se combinan.
proteínas Bcl-2 la familia, incluyendo antiapoptótico Bcl-2 y Bax proapoptóticos, son importantes mediadores de la mitocondria vía de la apoptosis. Activado Bax ayuda segundo activador de las mitocondrias derivadas de la caspasa (SMAC) y la liberación de citocromo-c, que de ese modo activar la caspasa-3 en exfoliados caspasa-3 que conduce a la apoptosis celular, mientras que la proteína antiapoptótica Bcl-2 impide la activación de Bax mediante la unión y el secuestro que dejar que las células cancerosas escapar de la apoptosis [30,34]. Por lo tanto, la relación de Bax /Bcl-2 y el nivel de la caspasa-3 escinde indican la respuesta terapéutica y son muy importantes en la inducción de la apoptosis [33]. La quercetina aumentó relación de Bax /Bcl-2 por 1,3 veces de LAPC-4 tumor de xenoinjerto de células de cáncer de próstata sensible a andrógenos [6]. Kumar et al informaron de que la terapia de quercetina aumentó significativamente relación de Bax /Bcl-2 y la actividad de caspasa-3 en células PC-3 [30]. 2-ME inhibió la proliferación y la apoptosis inducida de LNCaP y células PC3 in vitro e in vivo a través de la fosforilación de Bcl-2 [35,36]. Nuestro presente estudio demostró que la quercetina y 2-ME utilizarse solos aumento de la proteína proapoptótica Bax, disminución de la proteína antiapoptótica Bcl-2 y elevado relación de Bax /Bcl-2 que conduce a la activación de caspasa-3, que a su vez induce la apoptosis y el crecimiento del tumor de xenoinjerto inhibido. Estos resultados fueron confirmados por análisis inmunohistoquímico de las células Ki67 positivas caspasa-3 y. Por otra parte, todos estos efectos fueron mejoradas por la combinación de la quercetina y 2-ME que resulta en la inhibición de tumores en mayor medida.
AKT, una proteína serina /treonina quinasa que pertenece a vía de supervivencia /AKT PI3K, juega un papel importante en la supervivencia celular y la apoptosis cuando se activa en AKT fosforilada (pAKT). pAKT es upregulated y juega un papel importante en la supervivencia y la proliferación de células de cáncer de próstata humano [37]. Alto nivel de pAKT está relacionada con el alto grado y de alta puntuación de Gleason de los tumores de próstata y sirve como un predictor independiente de recurrencia bioquímica [38]. Por lo tanto, AKT se ha considerado como una diana terapéutica prometedora para el cáncer de próstata. Kim et al mostraron que la quercetina reduce proteína pAkt facilitar apoptosis TRAIL inducida en líneas celulares de LNCaP y DU145 [39]. Lee et al puesto de manifiesto que la quercetina nivel reducido pAKT que resulta en la supresión de fosforilados inadecuado e influir relación entre Bcl-xL y Bax, que luego aumento de la actividad de Bax y finalmente condujo a la apoptosis de células LNCaP [40]. 2-ME sensibilizado células PC-3 a la apoptosis mediada por FAS a través de la inhibición de la pAKT [41]. En nuestro experimento, quercetina y 2-ME puedo disminución de expresión de la proteína, respectivamente pAKT tanto en LNCaP y PC-3 de tejido tumoral de xenoinjerto, pero pAKT disminuido mucho más obviamente cuando se aplicó el tratamiento de combinación. A través de la inhibición de la vía de señalización pAKT, el crecimiento del tumor fue suprimida de manera más eficaz.
La angiogénesis se refiere a la generación de nuevos vasos sanguíneos a partir sistema vascular asegurar tumores de obtener suficiente oxígeno y nutrientes y preexistente está regulada por muchos factores angiogénicos, entre los cuales factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es el más crucial [42]. Los fármacos anticancerosos pueden inhibir la angiogénesis mediante la regulación negativa de VEGF a través del cual se inhibe el crecimiento del tumor. Pratheeshkumar et al encontraron que quercetina redujo los niveles de VEGF en las células PC-3 y formación de vasos sanguíneos inhibido tanto in vitro como in vivo. De esta manera, se inhibieron las células PC-3 y los tumores de xenoinjertos [43]. La quercetina también redujo significativamente la secreción de VEGF en las células LNCaP [44]. Mabjeesh et al iluminado que 2-ME notablemente disminución del nivel de VEGF en una manera dependiente de la dosis en las células PC-3, y luego angiogénesis y el crecimiento tumoral se inhibió [45].