Extracto
Se evaluó la capacidad de paclitaxel, uno de los taxanos, para inducir la muerte en dos líneas de cáncer de próstata, LNCaP y PC3. Paclitaxel condujo una vía apoptótica en LNCaP, pero no en células PC3, en respuesta a la detención G2 /M. Un examen de los niveles de proteínas anti-apoptóticas Bcl-reveló que xl fue mucho mayor en las células PC3 que en las células LNCaP y Bcl2 podría ser detectado sólo en las células PC3, no en las células LNCaP. El derribo de Bcl-XL de la apoptosis inducida por el paclitaxel-mejorado en las células LNCaP, mientras que no fuimos capaces de derribar a Bcl-XL eficientemente en células PC3. Significativamente, una comparación de ABT-263, un inhibidor específico de Bcl2 y Bcl-XL, con ABT-199, un inhibidor selectivo Bcl2, reveló que sólo ABT-263, no ABT-199, podría inducir la apoptosis en células LNCaP y PC3. Los resultados indican que la Bcl-XL tiene un papel protector contra la apoptosis paclitaxel inducida en las células LNCaP y PC3, y su sobreexpresión hace que la resistencia a paclitaxel observada en las células PC3. Curiosamente, paclitaxel combinado con ABT-263 para el tratamiento de LNCaP y células PC3 demostró activación apoptosis sinérgica, lo que indica que ABT-263 podría potenciar la apoptosis paclitaxel inducida en las células LNCaP y superar la sobreexpresión de Bcl-XL para desencadenar la apoptosis inducida por paclitaxel en células PC3. También se observó que la activación de la apoptosis en las células LNCaP fue más eficiente que en las células PC3 en respuesta a paclitaxel más ABT-263 o a ABT-263 solo, lo que sugiere que la vía de la apoptosis en células PC3 podría tener otras diferencias de que en las células LNCaP incluso después de que la sobreexpresión de Bcl-XL se representó
Visto:. Wang C, Huang SB, MC Yang, Lin YT, Chu IH, Shen YN, et al. (2015) La combinación de paclitaxel con ABT-263 tiene un efecto sinérgico sobre las células del cáncer de próstata resistente a paclitaxel. PLoS ONE 10 (3): e0120913. doi: 10.1371 /journal.pone.0120913
Editor Académico: Andreas Villunger, Universidad Médica de Innsbruck, Austria |
Recibido: 3 Mayo 2014; Aceptado: 9 Febrero 2015; Publicado: 26 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por Grant EX99-9935EI (a CHC) de los Institutos nacionales de investigación de Salud de Taiwán; Grant UGC-M103005 (CW) de la Universidad Médica de Kaohsiung. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la resistencia adquirida a la quimioterapia relacionada taxano sigue siendo un problema importante para los tumores malignos que muestran un beneficio terapéutico inicial del tratamiento taxano. Las células cancerosas con resistencia taxano pueden sobreexpresar un gen de resistencia a múltiples fármacos codificados para la bomba P-glicoproteína para aumentar el flujo de salida de taxano, que conduce a concentraciones intracelulares de taxano mínimos [1]. Además, la alteración de las características de los microtúbulos, principalmente por el aumento de la actividad dinámica de los microtúbulos después del tratamiento taxano, podría también cambiar la capacidad de respuesta a taxanos y disminuir su eficacia [2,3]. Las mutaciones de genes de tubulina en el sitio de unión a microtúbulos de taxanos podrían alterar la afinidad de unión de taxano, dando como resultado una pérdida significativa de eficacia [4,5]. Ganancia de la función de contrarrestar las vías de apoptosis también puede contribuir a la resistencia a múltiples fármacos en cáncer [6,7].
El patrón de regulación específicos de la apoptosis en células de cáncer podría ser un factor crucial para determinar la sensibilidad de las células cancerosas a múltiples diversos agentes de quimioterapia [8]. apoptosis intrínseca o mitocondrial se produce normalmente en células de cáncer que responden a la detención del ciclo celular inducida por la quimioterapia, incluyendo la detención de la mitosis inducida por fármacos [9,10]. La familia Bcl2, que consta de tres grupos de proteínas incluyendo las proteínas anti-apoptóticas, las proteínas pro-apoptóticas, y BH3-sólo las proteínas, es esencial para este apoptosis intrínseca [9]. Bcl2, Bcl-XL, MCL-1 y Bfl1 son proteínas anti-apoptóticas. Tanto Bax y Bak son proteínas pro-apoptóticas. BH3-sólo las proteínas incluyen Bad, Bik, Bim, Bid, Noxa, Hrk y su obtención. Las proteínas anti-apoptóticas todos contienen cuatro motivos de secuencia conservados, los dominios de Bcl-2 de homología (BH), que incluyen BH1, BH2, BH3 y BH4 [10]. Su función es mantener la integridad de las mitocondrias para apoyar la supervivencia celular. Las proteínas pro-apoptóticas comparten notable similitud con las proteínas anti-apoptóticas, especialmente en las características estructurales de las cuatro regiones BH, mientras que perturban la integridad mitocondrial para activar la apoptosis. Por último, los BH3-sólo las proteínas sólo tienen un dominio BH3 de compartir entre sí y con las proteínas anti-apoptóticos y pro-apoptóticos [11]. Curiosamente, este dominio BH3 común de BH3-sólo las proteínas constituye aminoácidos de 26 restos y forma una α-hélice anfipática para interactuar con e inactivar las proteínas anti-apoptóticas [12]. Es, posiblemente, también de forma transitoria se une Bax y Bak para su activación [13].
Recientemente, varios compuestos han sido desarrollados como miméticos BH3 para inducir la apoptosis mediante la inhibición de las proteínas anti-apoptóticas [12,14]. Hasta el momento, los inhibidores más potentes son los miméticos de Bad-como BH3, ABT-737 y su análogo activo por vía oral, ABT-263 [15-17]. Se unen a Bcl-2, Bcl-XL y Bcl-w con afinidad muy alta, pero con mucho menor afinidad a MCL-1 o BCL2A1 [14,18]. Los estudios preclínicos han demostrado que tanto ABT-737 y ABT-263 pueden desplazar las proteínas pro-apoptóticas de las proteínas anti-apoptóticas, de conformidad con un mecanismo de BH3-mimético de matar a [19]. La apoptosis inducida por el ABT-737 a través de BAX o BAK se sugiere a ser una actividad en el blanco [20]. Además, la sensibilidad de la respuesta de las células a los péptidos BH3 de los BH3-sólo las proteínas está altamente correlacionada con la sensibilidad de las células en peligro de ABT-737 apoptosis [21]. De manera significativa, los ensayos clínicos de ABT-263 se han realizado y se ha observado una cierta ventaja, sobre todo en la leucemia linfocítica crónica [22]. Además, tanto ABT-737 y ABT-263 se pueden utilizar como herramientas para estudios mecanísticos de apoptosis [14,23]. Recientemente, un nuevo ABT, ABT-199, ha sido desarrollado con la selectividad demostrado específicamente para Bcl2 [24].
En el presente estudio, hemos explorado las vías de apoptosis en células de cáncer de próstata en respuesta al paclitaxel, ABT- 199, ABT-263 y paclitaxel más ABT-263, usando LNCaP y PC3 células. LNCaP y PC3 representan el andrógeno-respuesta y la línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógenos, respectivamente. En primer lugar, encontramos que el paclitaxel causó G2 /M detención, tanto en las células PC3 y LNCaP, pero sólo dio lugar a la apoptosis en las células LNCaP. Por otra parte, se observó Bcl2 y la sobreexpresión de Bcl-XL en células PC3 en comparación con las células LNCaP, que tienen bajos niveles indetectables y de Bcl-XL y Bcl2, respectivamente. El siRNA desmontables de la proteína anti-apoptótica Bcl-xl aumento de la apoptosis en LNCaP, pero no podría ser desmontables en las células PC3 de manera eficiente. Se comparó la capacidad de ABT-199 y ABT-263 para inducir la apoptosis y encontró que sólo el ABT-263, no ABT-199, podría inducir la apoptosis. Se demostró además que el paclitaxel en combinación con ABT-263 tenía efectos sinérgicos en la apoptosis tanto en células PC3 y LNCaP. Esto sugiere que ABT-263 podría mejorar los resultados terapéuticos para los cánceres de próstata tanto paclitaxel-sensibles y resistentes a paclitaxel. La activación de la apoptosis fue más eficiente en las células LNCaP que las células PC3 en respuesta a paclitaxel más ABT-263 o ABT-263 solo, lo que sugiere que la vía de la apoptosis en células PC3 puede diferir más lejos de que en las células LNCaP, incluso después de Bcl-XL se contabiliza .
Materiales y Métodos
Los compuestos
Paciltaxel (Sigma-Aldrich), ABT-199 (Selleck) y ABT-263 (Selleck) fueron adquiridos de fuentes comerciales como se indica . Los compuestos se disolvieron en DMSO y se diluyeron en primer lugar por medio de cultivo en experimentos adicionales.
Cultivo de células y la sincronización
células PC3 y LNCaP se adquirieron de la Colección del Centro de Investigación y bio-(CRCB) en Taiwán . Las células se sembraron a 4 × 10
5-6 × 10
5 células por placa de Petri (10 cm) en medio RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% y se cultivaron a 37 ° C bajo 5% de CO
2. Las células se cultivaron bien no de forma sincrónica o en la sincronización. Para la sincronización, las células PC3 se sembraron en timidina mM RPMI 1640 con suero 2-rico y se incubaron durante 19 hr. Las células se liberaron por lavado tres veces con PBS y re-alimentados con medio de suero rico en fresco para 8 hr. A continuación, las células se volvieron a alimentar con medio fresco que contiene 2 mM de timidina durante 16 horas. Las células se lavaron por PBS tres veces antes de las etapas posteriores. células LNCaP se mueren de inanición en medio RPMI libre de suero 1640 durante 48 horas después de ser sembradas en medio de suero rico durante 24 horas.
flujo del ciclo celular por citometría de análisis
células PC3 y LNCaP fueron tratadas por paclitaxel en los puntos de tiempo indicados después de la sincronización en fase G1 /S. Las células se recogieron por tripsinización y /o separar en fracciones adherentes y unifamiliares. Las células se centrifugaron, se lavaron con PBS y se recogieron por centrifugación. Las células fueron fijadas con etanol enfriado con hielo al 70% durante 30 min, se lavaron con PBS y se centrifugó para eliminar el sobrenadante. Las células se resuspendieron en PBS que contenía 0,05% se añadió Triton X-100 y RNasa A (40 mg /ml) y se incubaron a 37 ° C durante 1 hr, y yoduro de propidio (PI) a la suspensión celular hasta una concentración final de 50 mg /ml para otra incubación de 1 hr. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con PBS y se centrifugó para eliminar el sobrenadante. Por último, las células se volvieron a suspender por PBS y se analizaron mediante citometría de flujo (BD Biosciences) con el software (BD Biosciences).
El análisis de inmunofluorescencia con un microscopio confocal
Alrededor del 5 × 10
4 PC3 y 1 × 10
5 células LNCaP se sembraron en cubreobjetos de vidrio estériles de 18 mm. Las células se sincronizan en las condiciones descritas anteriormente en la sección de sincronización celular. Las células fueron cultivadas con diferentes compuestos en los cursos de tiempo indicados, fijados en metanol (-20 ° C, 10 min) y perforada con 0,1% Triton X100 (25 ° C, 2 min). Las células fueron bloqueadas en 3% de suero de albúmina bovina-TBS y luego se tiñeron con anticuerpo monoclonal primario α-tubulina (Sigma-Aldrich), seguido de anticuerpos secundarios, conjugados con fluoróforo (Invitrogen). Los cubreobjetos fueron montados con el reactivo antifade con DAPI (Invitrogen) en posición invertida sobre portaobjetos de vidrio. Imágenes de microscopía confocal se obtuvieron usando un sistema de microscopio confocal (Olympus) y se amplificaron un centenar de veces.
Ensayo de apóptosis
Cerca de 1 × 10
5 células PC3 o 2 × 10
5 células LNCaP fueron sembradas en una placa de Petri de 10 cm. Tanto las células PC3 y LNCaP se sincronizaron y se expusieron a los tratamientos compuestos indicados durante 48 horas. Las células se recogieron por tripsinización y se separan en fracciones adherentes y unifamiliares. Las células se resuspendieron y se tiñeron en 100 l de tampón de unión de Anexina V con 100 mg /ml de yoduro de propidio y 100 mg /ml de FITC-conjugado anticuerpo Anexina V (Biotech Strong) durante 15 min a temperatura ambiente antes del análisis FACS.
Immunoblotting
Las células se lisaron en tampón de lisis (NaCl 250 mM, DTT 1 mM, 0,1% NP-40, 1 mM EDTA, 10 mM β-glicerofosfato, Na 0,1 mM
3Vo
4H, 1 tableta de cóctel inhibidor de proteasa, NaF 1 mM, HEPES 50 mM, pH 7,4, durante 50 ml). La concentración de proteína se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce). Sobre 100 g de proteína por pocillo se sometió a SDS-PAGE. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas transferidas fueron bloqueadas en el 5% de leche en polvo sin grasa o 5% (w /v) de BSA en TBS (0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4) con 0,1% (v /v) de Tween (v /w) 20 y probaron para el primer anticuerpo, seguido de incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (anti-conejo, anti-ratón; Jackson ImmunoResearch) y visualización con un kit de detección (Pierce) por revelado de películas fotográficas. Los primeros anticuerpos utilizados en este estudio fueron los siguientes: anticuerpo anti-actina (Millipore), anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y el anticuerpo -α-tubulina (GeneTex), anticuerpo anti-Bcl-xl (Abcam), anti-Bak, -Bax, -Bcl2, -Bim, -caspase 3, -caspase 3 (A), - la caspasa 7 (A), - MCL-1, poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y PARP (C) anticuerpo (Señalización celular). imágenes inmunotransferencia se cuantificaron mediante software cuantitativa (NIH).
coimmunoprecipitation
lisados de células totales de células LNCaP o PC3 tratados con paclitaxel o de control se prepararon en tampón de Chaps (5 mM MgCl
2, 137 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de CHAPS, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5)), y los inhibidores de la proteasa. Sobre 500 g de proteínas se inmunoprecipitaron con el anticuerpo Bcl-XL (Abcam) a 4 ° C durante 2 h. Los inmunoprecipitados fueron capturados por 50 l de la suspensión de perlas de proteína A-magnético (Millipore) en un tampón de Chaps a 4 ° C durante la noche. Los inmunoprecipitados se recuperan entonces por soporte magnético y se lavaron tres veces en tampón de 1% de CHAPS. Los inmunoprecipitados se eluye de tampón de muestra SDS-PAGE, se sometieron a SDS-PAGE y luego inmunotransferencia.
Bcl-XL, Bim y MCL-1 derribar por siRNA
células PC3 o LNCaP fueron sembraron a 4 × 10
5-6 × 10
5 células por placa de Petri (10 cm) durante 24 horas en 7 ml de RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10% y se cultivaron a 37 ° C bajo 5% de CO
2. Bim (Qiagen), Bcl-XL y MCL-1 (Invitrogen) siRNA se preincubó en medio de cultivo 1 ml sin suero antes de la transfección, y se añadió a continuación 40 l de reactivo de transfección (Qiagen) para el mismo medio de cultivo, mezclado por vórtice y se incubaron durante 5 ~ 10 min a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de transfección. La concentración de siRNA final fue de 5 a 10 nm después de la adición de los complejos gota a gota a las células PC3 y LNCaP. Después de 24 horas, las células PC3 y LNCaP fueron tratadas con 50 nM de paclitaxel y cosechadas en los cursos de tiempo indicados.
El análisis estadístico se utilizó
Una prueba t pareada para mostrar la significación estadística de los resultados utilizando SigmaPlot 10. ** P & lt; 0,01 fue considerado significativo. Se analizaron los datos de dos experimentos independientes.
Resultados
El paclitaxel dio lugar a detención de la mitosis en G2 /M, tanto en las células LNCaP y PC3
sincronizados células PC3 o LNCaP en G1 /S fueron tratados con 50 nM de paclitaxel sobre diferentes cursos de tiempo y se cosecha para el análisis del ciclo celular con citometría de flujo. Se encontró que el ciclo celular en las células PC3 procedió normalmente a través de la fase S y fue detenido en el punto de tiempo de 8 a 12 h (fig. 1A). Debido a su lenta velocidad de proliferación, las células LNCaP tardó más de lo PC3 para responder a compuesto de tratamiento, mostrando la detención del ciclo celular entre 36 y 48 horas (fig. 1A).
(A) por citometría de flujo análisis de PC3 o sincronizado células LNCaP tratadas de paclitaxel a través de los cursos de tiempo indicados. Los análisis se hicieron por triplicado y se muestran histogramas representativos. X e Y representan números ejes de contenido de ADN y células, respectivamente. (B) La inmunofluorescencia micrografía de los microtúbulos de las células PC3 o sincronizados LNCaP tratadas con paclitaxel lo largo de los cursos de tiempo indicados. Los análisis se realizaron por duplicado y se muestran micrografías de inmunofluorescencia representativas. -tubulina se muestra en color verde. El ADN se muestra por el color rojo.
A continuación, monitorizamos el comportamiento tanto de los microtúbulos y los cromosomas mediante imágenes de inmunofluorescencia con un microscopio confocal durante el mismo transcurso de tiempo. Hemos observado que los microtúbulos paclitaxel afectado a las 4 horas y 8 horas en las células PC3, que muestra la distribución de los microtúbulos anormalmente densa alrededor del núcleo (fig. 1B). Estos microtúbulos anormales pierden la capacidad para llevar a cabo el montaje normal del huso, lo que resulta en multipolar ejes densos a las 12 h (fig. 1B). El efecto de paclitaxel sobre las células LNCaP se parecía al efecto sobre las células PC3 (Fig. 1B). Sin embargo, debido al tiempo de duplicación largo de LNCaP, la formación del huso anormal en las células LNCaP se produjo mucho más tarde que en las células PC3 (Fig. 1B).
Nuestros resultados sugieren que las células tratadas de paclitaxel todavía podían ir hacia delante a través G2 y probablemente entrar en G2 /M para formar el complejo de huso cromosoma defectuoso que entonces causó la detención del ciclo celular en esta fase.
paclitaxel condujo una respuesta apoptótica a través de las vías de apoptosis dependiente de caspasa en LNCaP, pero no en PC3 células, en respuesta a G2 /M detienen
El paclitaxel causó la detención del ciclo celular en G2 /M, alrededor de 8-12 horas en células PC3 y 36-48 h en células LNCaP. A continuación, se investigó las respuestas apoptóticos desencadenados por paclitaxel mediante la evaluación de la activación de la caspasa 3 y el nivel de degradación de la PARP. Nuestros resultados revelaron que el paclitaxel causó la activación de la caspasa 3 y la degradación de PARP en las células LNCaP que aparezca primero en 48 hr, justo después de la detención G2 /M, y alcanzó un nivel significativo a las 72 horas (Fig. 2A). En contraste, se detectó ni la activación de la caspasa 3 ni la degradación de PARP en las células PC3 por paclitaxel en G2 /M detención (Fig. 2A). Por lo tanto, concluimos que el paclitaxel activa una respuesta apoptótica altamente correspondiente a su efecto en G2 /M detención en las células LNCaP, pero no en células PC3.
(A) El análisis por inmunotransferencia de lisados celulares de LNCaP sincronizada y células PC3 tratado por paclitaxel largo de los cursos de tiempo indicados para la detección de la caspasa 3 y PARP con su producto de degradación. (B) El análisis por inmunotransferencia de lisados de células a partir de las fracciones adheridas o independientes de LNCaP o células PC3 después del tratamiento paclitaxel sobre cursos de tiempo para la detección de la forma de la escisión de PARP. Los experimentos se repitieron tres veces y los resultados representativos se muestran. PARP (c):. La forma división de PARP
El paclitaxel causó la muerte de las células PC3 sólo en el estado individual
Hemos encontrado que el paclitaxel no se active una respuesta apoptótica correspondiente a la detención G2 /M en células PC3. ¿Cuál es el destino de las células PC3 atrapados en esta fase? Después de tratamiento con paclitaxel, se observó que algunas células LNCaP o PC3 separados de la parte inferior de la placa de cultivo. Por lo tanto nos recogieron las células después de la incubación con los compuestos a través de distintos cursos de tiempo, y recogieron y analizaron las células adheridas y que fueron separados por separado. Nos miramos a la degradación de la PARP en las fracciones adheridas y que fueron separados de LNCaP y PC3 células en diferentes cursos de tiempo. La forma de división de PARP apareció en las fracciones adheridas y que fueron separados de las células LNCaP (Fig. 2B). Este formulario sólo apareció en la fracción aislada de células PC3 a las 48 horas (Fig. 2B).
También realizó Anexina V-FITC /PI tinción para evaluar la muerte celular en células LNCaP o células PC3. La mayoría de las células PC3 adheridas permanecieron vivos, mientras que la fracción adherida de las células LNCaP mostraron un porcentaje significativo caer en apoptosis temprana (S1 Fig.). Para la fracción individual, de células LNCaP y PC3 aparecieron a finales de la apoptosis y la necrosis (S1 Fig.).
Llegamos a la conclusión que el momento de la apoptosis temprana en la fracción adherida de las células LNCaP corresponde a G2 /M detención mientras las células PC3, efectivamente, muestran un fenotipo de resistencia al tratamiento paclitaxel. La muerte en las fracciones independientes de LNCaP y PC3 parecía relacionada con el desprendimiento de células así como el estrés celular causado por paclitaxel.
Expresión de Bim, Bak, Bax, Bcl2, Bcl-XL y MCL-1 en LNCaP y PC3 células después del tratamiento con paclitaxel
para preguntan por qué se produce la apoptosis caspasa 3-dependiente en LNCaP, pero no en las células PC3, en respuesta a G2 /M detención, nos registramos el nivel de proteínas de Bim, Bak, Bax, Bcl2, Bcl-XL y MCL-1. Nuestros resultados mostraron que el nivel de proteína de Bim disminuyó con el tiempo después de tratamiento con paclitaxel en LNCaP y células PC3 (Fig. 3A). Por el contrario, el nivel de proteína de Bak, Bax, Bcl-XL y MCL-1 no cambió significativamente en las mismas condiciones (Figs. 3A y B). No hemos podido detectar ninguna proteína Bcl2 en las células LNCaP (Fig. 3B). Curiosamente, las células PC3 expresan una cantidad significativa de proteínas Bcl2 con o sin tratamiento con paclitaxel (Fig. 3B). Por último, comparamos el nivel de proteínas de Bim, Bcl-XL y MCL-1 entre LNCaP y PC3 células. Los resultados revelaron que la expresión de Bcl-XL y MCL-1 en células PC3 es mucho mayor que en las células LNCaP (Fig. 3C). Por lo tanto, la sobre-expresión de Bcl2, Bcl-XL y MCL-1 en células PC3 podría contribuir a su resistencia a paclitaxel.
(A) La expresión de la proteína BH3-only Bim y las proteínas pro-apoptóticas incluyendo tanto Bak y Bax, en las células LNCaP y PC3. (B) La expresión de proteínas anti-apoptóticos incluyendo Bcl2, Bcl-XL y MCL-1 en LNCaP o células PC3. El análisis por inmunotransferencia de lisados de células a partir de células LNCaP o PC3 tratadas con paclitaxel con el tiempo como se indica. Los experimentos se repitieron tres veces y los resultados representativos se muestran. (C) Comparación de Bim, Bcl-XL y MCL-1 entre LNCaP y PC3 células con /sin tratamiento con paclitaxel. El análisis por inmunotransferencia de lisados celulares de LNCaP o células PC3 tratadas durante 48 horas. Los experimentos se repitieron tres veces y los resultados representativos se muestran. imágenes de inmunotransferencia de Bim, Bcl-XL, MCL-1 y α-tubulina en LNCaP y PC3 con /sin tratamiento con paclitaxel se cuantificaron mediante ImageJ. Las lecturas, que se definen como unidades de luz arbitrarias, de Bim, Bcl-XL y MCL-1 normalizaron a la lectura de α-tubulina se muestran en el lado derecho. (**) Significación estadística entre dos lecturas.
El nivel de Bim LNCaP o células PC3 se redujo drásticamente después del tratamiento con paclitaxel, y se correlacionó con la muerte celular (Fig. 3A). Nos preguntamos por qué el nivel de Bim se redujo significativamente después del tratamiento con paclitaxel. Una vez más, se recogieron y analizaron los datos para las células adheridas y que fueron separados por separado. Reducción Bim sólo aparecía en la fracción individual, mientras que se mantuvo constante en la fracción adherida tanto en células PC3 después del tratamiento con paclitaxel y LNCaP (S2 Fig.). Por lo tanto, el nivel de Bim reducida no podría estar relacionado con su papel en la ruta apoptótica.
A continuación, pregunta si Bim consiste en vía de la apoptosis inducida por el paclitaxel en cáncer de próstata por RNAi desmontables y coimmunoprecipitation, ya que es un Bim principal proteína BH3-sólo se requiere para la apoptosis inducida por paclitaxel en los cánceres de mama [25]. A diferencia de los cánceres de mama, nuestros resultados demostraron que Bim caída no puede afectar a la apoptosis paclitaxel inducida en las células LNCaP (S3 Fig.). Por otra parte, no se observó ninguna interacción significativa entre Bim y Bcl-XL en IP (S3 Fig.). Estos resultados sugieren que Bim podría no ser una BH3 de sólo proteína esencial responsable de la apoptosis inducida por paclitaxel en los cánceres de próstata.
Bcl-xl o MCL-1 desmontables potencia la apoptosis en las células LNCaP, pero no las células PC3
para preguntar si la sobreexpresión de Bcl2, Bcl-XL y MCL-1 en células PC3 podría contribuir a su resistencia a paclitaxel, se exploraron primero de ellos, que podrían participar en la ruta apoptótica. Los resultados demostraron que Bcl-xl desmontables de siRNA aumentó significativamente la activación de la caspasa 3 y la degradación de PARP en las células LNCaP (Fig. 4). MCL-1 desmontables también aumentó la activación de la caspasa 3 y la degradación de PARP en las células LNCaP, pero su efecto no fue tan buena como la Bcl-xl desmontables (Fig. 4). Estos resultados sugieren que Bcl-xl podría ser un factor importante que afecta a la vía apoptótica paclitaxel inducida en las células LNCaP.
Bcl-xl y MCL-1 desmontables causado aumento de la apoptosis según la evaluación de la activación de la caspasa 3 y PARP la degradación en las células LNCaP, pero no en células PC3. células LNCaP o PC3 se transfectaron transitoriamente con Bim, Bcl-XL o MCL-1 siRNA o revueltos siRNA durante 24 horas. Las células fueron tratadas con /sin 50 nM de paclitaxel durante 48 horas, y después se sometieron a análisis de inmunotransferencia. La caspasa 3 (a): la forma activa de la caspasa 3. PARP (c): la forma escisión de PARP. Bcl-XL (s): la imagen de la exposición a corto de Bcl-XL. Bcl-XL (l): la imagen de larga exposición de Bcl-XL. Los experimentos se repitieron tres veces y los resultados representativos se muestran. Las lecturas respectivas de las imágenes de inmunotransferencia de Bcl-XL, MCL-1 y de la caspasa 3 (a) normalizada a alfa-tubulina en las células LNCaP se muestran en la parte inferior. Sólo desmontables con /sin tratamiento con paclitaxel se cuantificó. (**) Significación estadística entre dos lecturas.
A continuación, realizaron los mismos ensayos en células PC3. Hemos tenido dificultades para derribar Bcl-XL de manera eficiente en células PC3, probablemente debido al alto nivel de esta proteína (Fig. 4). Por el contrario, el nivel de proteína de MCL-1 se redujo significativamente por su siRNA pero esta caída no tuvo efecto sobre la activación de la caspasa 3 y la degradación de PARP en las células PC3 (Fig. 4).
La sobreexpresión de Bcl-XL contribuido más al fenotipo resistente a paclitaxel en células PC3
Ya que no pudimos tocar de manera eficiente hacia abajo Bcl-XL para evaluar su efecto sobre la apoptosis inducida por el paclitaxel en células PC3, nuestra aproximación alternativa era utilizar ABT -263 para la caída química de Bcl2 y Bcl-xL simultáneamente. Por otra parte, se utilizó ABT-199, un inhibidor específico de Bcl2, para distinguir entre Bcl2 y Bcl-XL en células PC3. Uso de ABT-263 induce la degradación de PARP y la activación de la caspasa 3, tanto en las células PC3 (Fig. 5A) y LNCaP. Sin embargo, el efecto de ABT-263 en las células LNCaP fue aproximadamente 3 veces mayor que para PC3 en términos de activación de caspasa 3 (Fig. 5A). Significativamente, ABT-199 no mostraron ningún efecto apoptótico en cualquiera de las células LNCaP y PC3, descartando un papel anti-apoptótica de Bcl2 en PC3.
(A) ABT-263, pero no ABT-199, podría desencadenar eficazmente la degradación de PARP en LNCaP y células PC3 de manera dependiente de la dosis, pero sólo podría activar la caspasa 3 a un nivel detectable en las células LNCaP. El análisis por inmunotransferencia de lisados celulares de LNCaP o células PC3 tratadas por ABT-199 o ABT-263 solo durante 48 horas a varias concentraciones se ensayaron como se indica. La caspasa 3 (a): la forma activada de la caspasa 3. La caspasa 7 (a): se muestra la forma de activación de la caspasa 7. Los experimentos se repitieron tres veces y los resultados representativos. Las lecturas de la caspasa 3 (a) normalizaron a GAPDH entre LNCaP y células PC3 tratadas con 5μM de ABT-263 se muestran en la parte inferior. (**) Significación estadística entre dos lecturas. (B) La combinación de 50 nM de paclitaxel con varias concentraciones de ABT-263 tuvo un efecto sinérgico sobre la apoptosis tanto en células PC3 y LNCaP. La eficacia de ABT-263 en combinación con paclitaxel en las células LNCaP fue mayor que en las células PC3. El análisis por inmunotransferencia de lisados celulares de LNCaP o células PC3 tratadas con paclitaxel en combinación con ABT-263 o ABT-263 solo durante 48 horas a varias concentraciones se ensayaron como se indica. La caspasa 3 (a): la forma activada de la caspasa 3. La caspasa 7 (a): se muestra la forma de activación de la caspasa 7. Los experimentos se repitieron tres veces y los resultados representativos. Las lecturas respectivas de la caspasa 3 (a) normalizado con el control interno, α-tubulina o GAPDH en LNCaP o PC3 con LNCaP se muestran en la parte inferior. (**) Significación estadística entre dos lecturas.
En conjunto, los resultados sugieren que Bcl-XL es el factor más importante en la apoptosis y su sobreexpresión contribuye al fenotipo de resistencia al tratamiento con paclitaxel en células PC3. Por otra parte, también se encontró que las células PC3 muestran resistencia parcial al tratamiento ABT-263 si la respuesta de LNCaP al mismo tratamiento se considera como una respuesta completa.
La combinación de ABT-263 con paclitaxel ha demostrado un efecto sinérgico en apoptosis tanto en LNCaP y células PC3
Hemos demostrado que ABT-263 por sí solo puede conducir células paclitaxel-sensibles y resistentes a paclitaxel hacia apoptosis, aunque la línea de células LNCaP sensibles a paclitaxel muestra mejores efectos que el paclitaxel PC3 línea celular resistente. Se evaluó adicionalmente el efecto de combinación de ABT-263 con paclitaxel. Significativamente, nuestros resultados demostraron que ABT-263 en combinación con paclitaxel tenía un efecto sinérgico sobre la apoptosis tanto en células PC3 y LNCaP (Fig. 5B). Sin embargo, la eficacia de este tratamiento de combinación fue mayor en las células LNCaP que en células PC3 (Fig. 5B).
La sinergia entre paclitaxel y ABT-263 para la activación de la apoptosis demostró claramente que ABT-263 puede contrarrestar Bcl-XL en células de cáncer de próstata paclitaxel-sensibles y resistentes a paclitaxel. Orientación de las proteínas anti-apoptóticas tiene el potencial de mejorar la quimioterapia para el cáncer de próstata. Sin embargo, la diferencia en la activación de la apoptosis entre células LNCaP y PC3 para ABT-263 solo o ABT-263 en combinación con paclitaxel sugiere que la vía de la apoptosis en células PC3 puede diferir más lejos de que en las células LNCaP, incluso después de Bcl-XL se contabiliza.
Discusión
en nuestro estudio paclitaxel desencadena la apoptosis temprana en la fracción adherente de células LNCaP en respuesta a la detención G2 /M. Por el contrario, la apoptosis temprana no puede ser detectada en la misma fracción de células PC3 a través de todo el curso del tiempo, lo que sugiere que las células PC3 no responden a G2 /M detención para iniciar este programa de muerte. Curiosamente, la muerte celular PC3 produjo en un estado individual después del tratamiento paclitaxel principalmente a través de necrosis. Además, el nivel Bim solamente disminuyó en la fracción separada tanto de las células después de tratamiento con paclitaxel. Si la disminución de los niveles de Bim está relacionada a la muerte celular en condiciones independientes que aún queda por resolver. Otro estudio indicó que Bim caída en células de la próstata y cáncer de mama causó el desprendimiento de células y en última instancia la apoptosis [26]. Sin embargo, no se observó el fenómeno descrito en dicho informe
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Si el desprendimiento de células podría suceder
in vivo Hoteles en terapias anti-mitótico es un tema interesante que queda por determinar. Lógicamente, las células cancerosas rodeadas de tejido conectivo puede ser muy difícil de separar de tejido de cáncer después de la quimioterapia anti-mitótico. Por lo tanto, la muerte celular en respuesta a G2 /M detención en un estado adherido se convierte en el punto crítico para juzgar si las células son sensibles o resistentes al tratamiento con paclitaxel. En el presente estudio, hemos demostrado que las células LNCaP exhiben sensibilidad al tratamiento con paclitaxel, mientras que las células PC3 muestran resistencia.
También demostró que la sobreexpresión de Bcl-XL podría contribuir al fenotipo resistentes a la apoptosis de las células PC3. Parece que la señal de apoptosis inducida por el tratamiento paclitaxel podría no ser suficiente para contrarrestar la sobreexpresión de proteínas anti-apoptóticas tales como Bcl-XL en células PC3. Esta especulación se ve apoyada por la combinación de paclitaxel con ABT-263 que tiene efectos sinérgicos sobre la activación de la caspasa 3 y la degradación de la PARP en comparación con paclitaxel o ABT-263 solo.
De hecho, un estudio ha señalado que la sobreexpresión de Bcl-XL en el carcinoma de próstata de grado alto está asociado con un fenotipo refractario a las hormonas [27].