Extracto
Aunque el cáncer de próstata (CaP) tiene una progresión lenta, el refractario hormonal (CDHP) y entidades metastásicos son sustancialmente letal y carecen de tratamientos eficaces. Factor de transcripción Slug es crítico en la regulación de las metástasis de diversos tumores incluyendo CaP. Aquí estudiamos la terapia dirigida contra Slug usando combinación de 3 fármacos dirigidos a 3 vías que convergen respectivamente a través de Slug y aún más que regulan CaP metástasis. Con
in vitro
ensayos que confirmaron que Slug regulación inhibición incurrido de E-cadherina que era anti-metastásico, y se inhibe la apoptosis celular regulada por Bim en el CaP. PTEN aguas arriba /Akt, mTOR, Erk, y AR /Hsp90 fueron responsables de Slug regulación y cada uno de ellos podría ser el blanco de la rapamicina, CI-1040 y 17-AAG, respectivamente. En 4 líneas celulares de CaP con diferentes características en términos de pérdida de PTEN y la sensibilidad de andrógenos se probó la eficacia de la monoterapia y terapia combinada con las drogas. Se encontró que la capacidad metastásica de las células se inhibe al máximo sólo cuando se combinaron los 3 medicamentos, debido a la diafonía entre las vías. 17-AAG disminuye la expresión de Slug mediante el bloqueo de la estabilidad AR HSP90-dependiente. La combinación de rapamicina y CI-1040 disminuye invasividad más potentemente en células de CaP que son andrógenos insensible y con la pérdida de PTEN. Slug inhibe la apoptosis mediada por Bim que podría ser rescatado por los inhibidores de mTOR /ERK /HSP90. El uso de modelos de ratón para la circulación de CaP cuantificación de ADN, se encontró que la combinación de los inhibidores de mTOR /Erk /HSP90 reduce circulante células de CaP
in vivo
significativamente más potente que la combinación de 2 o monoterapia. En conclusión, la combinación de mTOR /Erk /Hsp90 inhibe la capacidad de metástasis de cáncer de próstata a través de la inhibición Slug
Visto:. Ding G, C Feng, Jiang H, Q Ding, Zhang L, Na R, et al. (2013) La combinación de rapamicina, CI-1040 y 17-AAG inhibe la capacidad metastásica de cáncer de próstata a través de la inhibición Slug. PLoS ONE 8 (10): e77400. doi: 10.1371 /journal.pone.0077400
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 22 de abril de 2013; Aceptado: 2 Septiembre 2013; Publicado: 10 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Ding et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por las élites jóvenes Científico de financiación de la Universidad de Fudan (No.144) y Juventud de financiación científica de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF-81202002). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es una neoplasia común, que todavía ocupa un lugar destacado como la principal causa de muerte entre las neoplasias urológicas, y se mantiene en la segunda causa de muerte por cáncer en los hombres [1]. Aunque la detección precoz del CaP ha mejorado el resultado clínico, CaP metastásico y cáncer de próstata hormona refractario (CPRH) siendo uno de los problemas clínicos más difíciles, lo que conduce a un evento de la última etapa con un mal pronóstico. CaP tiene una sorprendente tendencia a hacer metástasis a los huesos. La tasa de supervivencia a 5 años del cáncer de próstata primario se aproxima al 100%, y sin embargo se reduce al 33% si se diagnostica metástasis ósea [2]. La terapia de privación de andrógenos (ADT) está indicada para los hombres que son diagnosticados con o desarrollan CaP avanzado o metastásico tras el tratamiento local [3]. Desafortunadamente, la resistencia a ADT finalmente emerge, por lo general se manifiesta como el nuevo crecimiento del tumor asociada con un aumento en los niveles (PSA) en suero del antígeno prostático específico, y en el caso de CPRH, resultados fatales se asocia generalmente [4,5]. estrategias terapéuticas tradicionales (quimioterapia y radioterapia) se asocian a menudo con resultados poco satisfactorios en esta población. Por lo tanto, la terapia dirigida ha surgido como una modalidad alternativa prometedora para los pacientes con CaP metastásico o CPRH. Desarrollo de intervenciones terapéuticas más eficaces basados en los estudios moleculares por los cuales los tumores desarrollan resistencia a los fármacos terapéuticos tanto, es una necesidad urgente. Un trabajo reciente ha sido el objetivo de identificar moléculas clave implicadas en la metástasis como dianas terapéuticas.
Slug (Snai2) es un miembro de la familia Snail, que es un factor de transcripción con dedo de zinc. También es uno de los genes de vertebrados-específico asociado con Caracol. Se ha confimred en un número de estudios in vitro que Slug es crítico para la metástasis y la invasión capacidad de las células de cáncer [6,7]. Los estudios también han demostrado que la expresión de Slug se puede aumentar en ciertos órganos (tejido de mama y tumor de estómago), pero se redujo en promedio en otros (tales como de colon, de ovario de tejidos normales y esófago). Nuestro estudio anterior muestra que la proteína Slug es altamente expresado en los tejidos de cáncer de próstata, y que la proteína Slug se expresa en líneas celulares LNCaP,, DU-145, y 22Rv1 CaP PC-3. Su expresión puede ser sometida a la regulación a la modificación de la transcripción o post-traducción. También hemos encontrado que la proteína Slug es altamente expresado en muestras de tumores, pero no en tejido de la próstata normal [8]. Por lo tanto, en el presente estudio nos proponemos estudiar la forma en Slug está implicada en la capacidad metastásica de CaP y al probar la eficacia de la terapia dirigida contra las vías relacionadas Slug.
Materiales y Métodos
Reactivos
La rapamicina, CI-1040, 17-AAG, DHT (0,1 mg /ml) y anticuerpos primarios de Slug (conejo), ps6 (pSer235 /236, conejo), pAkt (pSer473, conejo), (PTEN conejo), HIF-1α (ratón), HSP90 (conejo), AR (conejo), y β-actina (ratón) se adquirieron de Sigma-Aldrich, Munich, Alemania. Los anticuerpos de Perk (pThr202 /pTyr204, conejo), y Erk (conejo) fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de Santa Cruz, EE.UU.. Se utilizó el kit de sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, IL). siRNAs Slug y control humanos fueron adquiridos de Santa Cruz.
Cultivo de células
DU145 humano, PC-3, líneas celulares de adenocarcinoma de próstata LNCaP y 22Rv1 eran comerciales y se adquirieron de Banco de Células de la Academia China de Ciencias (Shanghai, China). células LNCaP y 22Rv1 se cultivaron en medio RPMI 1640 (PAA, Alemania) con 10% de suero bovino fetal (FBS) (PAA). DU145 y células PC-3 se cultivaron en F-12 de medios de Ham (Gibco, NY) con L-glutamina (300 mg /L, NaHCO
3 1,5 g /L) y 10% de FBS. Las células se incubaron con 5% de CO
2 a 37 ° C.
Western blotting
La proteína total de los lisados se extrajo y se purificó. cantidad de proteína iguales de 25μg se cargó en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio al 10% para electroforesis. Los geles se transfirieron posteriormente a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1 h con leche no grasa al 5%. A continuación se añadieron anticuerpos primarios de Slug, ps6, pAkt, PTEN, gratificación, Erk, HIF-1α, HSP90, AR, y β-actina y las membranas se incubaron a 4 ° C durante la noche. Correspondientes anticuerpos secundarios se aplicaron seguido de la aplicación de peroxidasa de rábano picante.
se realizaron migración y la invasión de ensayo
Los ensayos in vitro de migración como se ha descrito anteriormente. Brevemente, las células se sembraron en la cámara superior de los poros 8.0μm insertos de cultivo celular tamaño que eran o revestida o no revestida con matrigel para los ensayos de migración y la invasión, respectivamente. A continuación, los insertos se colocaron en una placa de 24 pocillos llenas con medio con suero bovino fetal 5%. Las células que penetraron a las superficies inferiores de los insertos fueron fijadas y teñidas con el método de Diff-Quick (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y se contaron bajo el microscopio. Se calculó la media de los tres campos de alta potencia para cada condición desarrolladas por triplicado.
PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo con RNAiso reactivo (Takara, Dalian, China). Después se determinó la concentración con Thermo Nanodrop 1000 espectrofotómetro, los ARN se convirtieron a ADNc con PrimeScript RT Reactivo Kit (Takara) bajo la condición de 37 ° C, 15 min; 85 ° C, 5 seg. Cebadores directo e inverso de Slug, E-cadherina, y GAPDH de control interno (deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato) fueron sintetizados (Invitrogen) de la siguiente secuencias (Tab. 1): para la E-cadherina humana, el sentido, 5'-ACA GCC CCG CCT TAT GAT T-3 'y antisentido, 5'-GAA CCG TCG CTT CCT TCA-3'; para Bim, sentido, 5'-GGT CCT CCA GTG GGT ATT TCT CTT-3 'y antisentido, 5'-ACT GAG ATA GTG GTT GAA GGC CTG G-3'; para la caspasa-3, el sentido, 5'-GAC AGA CAG TGG TGT TGA TGA TGA C-3 'y antisentido, 5'-GCA TGG CAC AAA GCG ACT GGA T-3'; para Slug, el sentido, 5'-GGA TTC CCCACA CAT TAC CT-3 'y antisentido, 5'-ACG GTG AGG GCA AGA AAA AG-3'; para GAPDH, sentido, 5'-ATG GAA ATC CCA CCA TCA TCT T-3 'y antisentido, 5'-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3'. Las muestras se procesaron con SYBR Green Premezcla Ex Taq (Takara) en el sistema de 20μl en ABI 7500N (Applied Biosystem, Forster City, CA). Las muestras se realizaron a 95 ° C, 30 seg y se amplificaron durante 40 ciclos (95 ° C, 5 segundos; 60 ° C, 34 seg). Para cada muestra, el valor promedio de ciclo umbral se normalizó a GAPDH nivel con la fórmula, 2
-ΔΔCt. Los resultados se presentan de este modo por pliegues expressional por el control.
xenoinjerto e intravenosa modelo de tumor
Hombre Balb /c atímicos ratones desnudos a las 6 semanas de edad (Vital River, Pekín, China) fueron criados en SPF licencia de laboratorio de grado (especial libre de patógenos). Todos los ratones fueron sometidos a orquiectomía por privación de andrógenos. Un total de 2 × 10
6 células (DU145, PC-3, LNCaP, 22Rv1 respectivamente) por vía subcutánea se inyectaron en 100 pl de PBS en ambos flancos de cada ratón. grupo de control de vehículo se le dio 100 pl de PBS. El crecimiento tumoral se monitorizó y se recogió sangre periférica en 1 mo. Para inyecciones intravenosas, 2 × 10
5 células se inyectaron en la vena lateral de la cola y se recogió sangre periférica en 24 h. Todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Fudan comité de ética animal.
Detección de la muerte de la célula
La muerte celular se detectó mediante ensayo de MTT, un método que fue bien establecida. Brevemente, las células se les dio en primer lugar los diferentes tratamientos, y después expuestas a 400 mM H
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2 de 4 h. En los grupos de control, las células RIN-mβ solamente fueron tratados con 400 M H
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2 y correspondiente de drogas, respectivamente. Al final de los tratamientos, los medios se retiraron y las células se tiñeron y se midieron a 495 nm usando un lector de AutoPlate (Bio-Tek, EE.UU.). El tratamiento con 400 mM H
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2 de 4 h podría inducir la apoptosis de aproximadamente la mitad de células de CaP (~ 50%) y la dosis fue por lo tanto seleccionado como condición óptima.
ADN circulante tumor se recogió la detección
ratón sangre (0,5 ml) en los tiempos indicados por sangrado intraocular, y los glóbulos rojos se lisaron antes de la extracción de ADN. El kit Quick-ADNg MiniPrep (epigenética, EE.UU.). Brevemente, se añadieron 400 l de tampón de lisis para 100 l de plasma. Después de vórtice vigoroso, todos los contenidos fueron trasladados a las columnas y se centrifugaron. tampón de prelavado Se añadió entonces seguida por otra centrífuga y la adición de tampón de lavado. ADN se eluyó finalmente con tampón de elución del ADN y se cuantificaron mediante el uso de ensayos de PCR en tiempo real basado TaqMan-química como se mencionó anteriormente para Slug humano y E-cadherina expresiones.
El análisis estadístico
Uno-muestra y dos pruebas t -ejemplo, y la prueba de Mann-Whitney se utilizaron para la in vitro e in vivo. Un valor de p o & lt; 0,05 se aceptó como significación estadística. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD).
Resultados
andrógeno promueve el potencial metastásico del CP a través de la regulación de Slug
El cáncer de próstata se alimentaba de andrógenos en el mayoría de los casos y la transición hacia el fenotipo refractario hormonal (CPRH), la terapia por lo general requiere de privación de andrógenos a largo plazo. Así se investigó si aquí Slug estaba implicado en la vía metastásico mediado por andrógenos en el cáncer de próstata. Mediante la aplicación de la dihidrotestosterona (DHT) a 1 nM a 4 líneas de células de CaP con diferentes rasgos, se encontró que las células eran diferentes por su capacidad de migración inherente con diferente sensibilidad a los andrógenos (Figura 1A). Las células PC-3 fueron más inherentemente invasivo, y LNCaP y 22Rv1 eran más sensibles a la estimulación de andrógenos con aumentos significativos en el perfil metastásico. patrón similar de cambio en la invasividad también se observó en el ensayo de invasión, lo que confirma los perfiles anteriormente mencionado (Figura 1B). Para dilucidar si Slug estaba implicado en la mejora de la metástasis /invasión relacionado con hormonas, hemos explorado los niveles de ARNm y proteínas en las células. De acuerdo con ello, la expresión de Slug se incrementó significativamente significativamente en LNCaP y 22Rv1 células que son sensibles a la hormona en respuesta a DHT (Figura 1C). El cambio en la expresión de mRNA también correspondió a los cambios en el nivel de proteína, como se revela en inmunotransferencia (Figura 1D). E-cadherina, una proteína crucial para la adhesión célula-célula se ha establecido para efectuar aguas abajo de Slug, la inhibición de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) y la posterior evasión celular. A continuación, estudiamos si la activación de Slug por la inhibición de andrógenos incurrido de E-cadherina para promover la migración celular y la invasión. De acuerdo con los análisis previos, tanto el mRNA y los niveles de proteína de E-cadherina se redujo después de la adición de DHT en células sensibles a los andrógenos (Figura 1E, F). En conclusión, hemos demostrado aquí las diferencias de sensibilidades de andrógenos de 4 líneas celulares de CaP y reveló que las células sensibles a los andrógenos estimulada habían aumentado la capacidad para la migración y la invasión a través elevada Slug y la disminución de la actividad de E-cadherina. Por lo tanto, para las células insensibles a los andrógenos, que se supone que deben ser resistentes de privación hormonal, no debe haber vías sobre las que se basó la migración y la invasión a la que podrían dirigirse.
Migración (A) y la invasión (B ) ensayos realizados en 4 líneas celulares de CaP tratados con dihidrotestosterona (DHT) y control. Los niveles de ARNm (C) y la proteína (D) de Slug en líneas celulares de CaP tratados con DHT o control. Los niveles de mRNA (E) y la proteína (F) de E-cadherina en líneas celulares de CaP tratados con DHT o PBS (control). (Error bar = desviación estándar, n = 3 para cada grupo; * p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01).
La combinación de rapamicina y CI-1040 disminuye la invasividad del CP
la hiperactividad de la vía de PTEN /Akt /mTOR se ha demostrado ser pro-tumorigénicos en una variedad de cánceres, incluyendo la génesis tumoral del CP, en el que Slug era conocido por ser un efector aguas abajo del factor inducible de hipoxia-1α ( HIF-1α). A continuación, estudiamos si la inhibición de mTOR disminuye el potencial metastásico de PCa a través de Slug. Detectamos importante pérdida de PTEN en DU145 y células PC-3, la pérdida de menor importancia en comparación con las células LNCaP 22Rv1 celular. Los sustitutos corriente abajo de Akt, mTOR, y las actividades de HIF-1α fueron aumentados en las células PTEN-nula, lo que indica un cambio a vía mTOR para fenotipos andrógeno-insensible (Figura 2A). La adición de rapamicina a 10 nM disminución de los niveles Slug en todas las líneas celulares, pero el nivel basal de Slug apareció más alta en DU145 y células PC-3 (Figura 2B). La rapamicina a la misma dosis inhibe la migración y la invasión de células con pérdida de PTEN por ~ 30% y no afectó 22Rv1 (Figura 2C, D). Como la inhibición de mTOR podría implicar evaluaciones que eran por el contrario pro-tumorigénicos, se analizó la actividad de ERK1 /2, el cual fue reportado a jugar papel alternativo en la regulación de la expresión de Slug en el CP previamente. Sorprendentemente, la actividad de ERK1 /2 fue elevado en las 3 líneas celulares con la pérdida de PTEN después de la aplicación rapamicina, lo que indica una derivación existente eludir mTOR hacia Slug (Figura 2E). por lo tanto, si la prueba de la combinación de rapamicina y CI-1046, un /2 inhibidor de ERK1, que es en el ensayo clínico podría disminuir aún más el perfil metastático en estas células. transferencia Western mostró que la combinación de fármacos reduce sustancialmente el nivel de Slug en todas las líneas celulares PCA (Figura 2F). a continuación, hemos probado si la rapamicina efectuada por el bloqueo de mTORC1 y ejerció su efecto aguas abajo a través de ERK y el Slug. El tratamiento de las células DU145 con diferentes combinaciones de rapamicina, Raptor y Rictor siRNAs, se encontró que, a pesar de un bloqueo completo de ambos elementos COMT-1 y -2 dio lugar a la inhibición máxima de ERK y Slug, el efecto inhibidor de la rapamicina era posiblemente a través de mTORC1- vía ERK-Slug (Figura 2G). El efecto sinérgico de la combinación de 1 nM de rapamicina y 0.5μM de CI-1040 se muestra en las Figuras 2H, I. Hubo una mayor inhibición de la capacidad de migración y la invasión en las células con la pérdida de PTEN llegar a ~ 50% en comparación con la monoterapia de la rapamicina. En conclusión, los andrógenos insensible CaP fueron en general mTOR hiperactivos debido a la pérdida de PTEN. La monoterapia con rapamicina sin embargo implicaba la activación de ERK, lo que activa Slug como un bypass. La combinación de inhibidores de mTOR y ERK confirió un mejor efecto que la monoterapia.
niveles basales de PTEN, Akt fosforilada y S6, y HIF1α en las líneas de células de CaP se indica mediante transferencia Western (A). Cambio del nivel de Slug en células de CaP tratados con rapamicina por el control (B). Migración ensayos en líneas celulares de CaP con o sin rapamicina tratamiento (C) y la invasión (D). La activación de Erk 1/2 vía en células de CaP que responden al tratamiento rapamicina (E). Los tratamientos de combinación de la rapamicina (R) y CI-1040 (CI) en líneas celulares de CaP y el efecto sobre Slug (F). Las combinaciones de rapamicina y Raptor /Rictor siRNAs y los efectos sobre ERK y Slug en las células DU145 (G). Migración (H) y la invasión (I) ensayos en líneas celulares de CaP con o sin tratamiento de combinación con rapamicina y CI-1040. (Error bar = desviación estándar, n = 3 para cada grupo; * p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01).
17-AAG disminuye la expresión de Slug mediante el bloqueo de HSP90 dependientes de AR la estabilidad
Aunque deprivación hormonal había efecto de larga duración en el CP, podría producirse una serie de eventos adversos sistémicos. Como andrógenos ejerce sus efectos a través de la unión a su receptor (AR), que induce la activación de Slug, hemos probado si la terapia dirigida contra vía Slug podría fijarse el objetivo de AR. Se ha establecido que se requiere proteína de choque térmico 90 (Hsp90) para la estabilidad de las proteínas incluyendo la AR. a continuación, se estudió si el uso de la Hsp90 inhibidor de 17-AAG podría disminuir el efecto de los andrógenos en los perfiles de CaP metastásico través de la inhibición de Slug. Las células fueron tratadas ya sea con DHT solo o con combinación de 300 nM de 17-AAG. Como se esperaba, la combinación de 17-AAG bloqueó la actividad Slug más aparentemente en líneas de células sensibles de la hormona (Figura 3A). Además, la inhibición de la migración y la invasión no sólo se observó en líneas celulares sensibles andrógenos pero en las células PC-3, así (Figura 3B, C). Para resumir, el bloqueo de la Hsp90 desestabilizó AR que conduce a una disminución del efecto de los andrógenos en la promoción de la migración celular y la invasión. Crosstalk efecto de 17-AAG podría existir como también ejerció efecto en las células insensibles andrógenos.
niveles
Slug en células de CaP tratados con DHT o combinación de DHT y 17-AAG (A). Migración (B) y la invasión (C) ensayos en líneas celulares de CaP con o sin combinación tratados con DHT o combinación de DHT y 17-AAG. (Error bar = desviación estándar, n = 3 para cada grupo; * p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01).
Slug inhibe la apoptosis mediada por Bim que puede ser rescatado por mTOR /Erk /HSP90 inhibidores
efectos Hasta ahora, hemos establecido la orientación de 3 vías relacionadas-Slug con profundos efectos en la inhibición de perfiles metastásicos. Como Slug también fue responsable de sus efectos corriente abajo anti-apoptóticos en las células tumorales, se examinó si la combinación de fármacos dirigidos Slug-confirió efectos pro-apoptóticos. En primer lugar, imitado las especies reactivas de oxígeno (ROS) utilizando H
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2, y encontramos que las células con insensibilidad a los andrógenos eran más resistentes a ROS y andrógenos podría rescatar a la apoptosis en líneas celulares de sensibilidad hormonal (Figura 4A). Como Bim era responsable de la anti-apoptosis mediada por Slug, se determinó adicionalmente la expresión de Bim en todas las células tratadas con DHT. Expresión de Bim se mantuvo sin cambios en la celda insensible andrógenos y disminuyó significativamente en células sensibles a andrógenos (Figura 4B). Para caracterizar mejor el papel de Slug en anti-apoptosis, se aplicó siRNA contra la expresión de Slug en todas las líneas celulares (Figura 4C). El efecto inhibidor fue prominente a excepción de 22Rv1 celular, en el que la actividad era constitutivamente Slug bajo, lo que representa su nivel más bajo de la capacidad metastásica inherente (Figura 1A). Además, la prueba de la actividad de caspasa-3 siguiente Slug caída. La expresión de la caspasa-3 fue significativamente menor en 3 líneas celulares con hiperactividad Slug y se mantuvo sin cambios en 22Rv1 células (Figura 4E). A continuación se aplica la combinación de rapamicina, CI-1040, y 17-AAG a las células no transfectadas para probar los efectos sinérgicos. Sorprendentemente, la combinación rescató el efecto anti-apoptótica de Slug iniciado por andrógenos y ROS en todas las líneas celulares, en los que se obtuvieron significación estadística para DU145, PC-3 y LNCaP (Figura 4F). En total, Slug confiere efectos anti-apoptóticos en células de CaP a través de la inhibición de Bim, vía más probable para ser activado en las células sensibles a hormonas con la presencia de andrógenos. Un pan-bloqueo de la mTOR /ERK /Hsp90 parecía estar en la inhibición de Slug, así como lo es la actividad aguas abajo.
La muerte celular en células de CaP tratados con DHT en respuesta a los ROS simulado por H
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2 (A). El nivel de expresión de Bim en células de CaP tratados con DHT (B). Desmontables de Slug con siRNA (C) y el nivel de ARNm de Bim en líneas celulares de CaP siguientes Slug caída (D). Cambio de la caspasa 3 nivel de ARNm en células de CaP siguientes Slug desmontables (E). Efecto de la combinación de rapamicina, 17-AAG, y CI1040 en la muerte celular de células de CaP tratados con DHT y H
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2. (Error bar = desviación estándar, n = 3 para cada grupo; * p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01).
Combinación de inhibidores de mTOR /Erk /HSP90 reduce las células circulantes de CaP
in vivo
CaP son mucho más propensos a la metástasis ósea que los otros órganos, por lo que la metástasis hematógena es requisito previo. así Establecimos modelos animales para probar el efecto de la combinación de fármacos in vivo. En lugar de establecer el modelo de metástasis ósea, lo que era difícil realizar un seguimiento de las lesiones metastásicas mínimamente, hemos tratado de detectar células tumorales circulantes, el perfil de la capacidad metastásica del tumor primario. En primer lugar, establecimos modelos de xenoinjertos con las líneas celulares 4, respectivamente. Con el fin de normalizar al máximo nivel de andrógenos, se realizó orquiectomía en todos los ratones y se inyecta 200μg de DHT en aceite de sésamo-etanol por vía subcutánea cada dos días. Los ratones fueron inyectados con 200μl de una solución de 1,2 mg /ml de rapamicina al día (5 días por semana). Los ratones también se trataron dos veces al día mediante inyección intraperitoneal (IP) de 100 mg /kg CI-1040, mientras que 17-AAG (80 mg /kg /d en aceite de maíz estéril) fue entregado por 1 inyección IP por día. Durante el tratamiento, los pesos corporales de todos los ratones se monitorizaron para la supervisión toxicidad. Las figuras 5A, B, C, D mostró los pesos de los ratones implaneed con diferentes líneas de células de CaP bajo diferentes tratamientos. No hubo cambios significativos entre los tratamientos y grupos de control, lo que indica efectos no tóxicas de los tratamientos. Después de que la sangre había sido cosechada la cuantitativa en tiempo real PCR reveló que las células LNCaP fueron los más potentes en la capacidad metastásica, mientras que las células 22Rv1 apenas metástasis. La triple terapia eficaz de limitar la evasión del tumor en el sistema de circulación en las líneas celulares resto 3 en comparación con cualquiera de los fármacos 2 o deprivación hormonal solo (control) (Figura 5E). A continuación tuvo como objetivo estudiar si la combinación afectó la capacidad de las células tumorales circulantes de anclaje y por lo tanto inyectamos células tumorales en la circulación del ratón. Después del tratamiento con una sola dosis de rapamicina y 17-AAG, y la inyección de dos veces de CI-1040 como se mencionó anteriormente, la sangre se recogió en el punto de tiempo establecido. Como se muestra en la Figura 5B, la terapia triple redujo significativamente las células tumorales circulantes. La combinación de rapamicina y CI-1040 logra un efecto similar en comparación con la privación de andrógenos. Tomados en conjunto, no sólo demostró que el medicamento de triple de la inhibición de mTOR /ERK /Hsp90 reducción de la capacidad metastásica del tumor, pero también mostraron que tal terapia dirigida abrumado la sensibilidad a los andrógenos de las células. El inhibidor fue consistente en las células con o sin sensibilidad hormonal y con independencia de la presencia de andrógenos (Figura 5F).
Tendencia de cambio de peso durante el período de tratamiento en los 4 ratones de xenoinjerto de células PCA (A-D). Circulación CaP cuantificación de ADN en modelos de xenoinjerto en ratones implantados con 4 líneas de células de CaP y se trata con diferentes combinaciones de fármacos (E). Que circula CaP cuantificación de ADN 24 h después de la inyección venosa de células de CaP en los ratones que reciben tratamiento único de combinaciones de medicamentos (F). (Error bar = desviación estándar, n = 6 para cada grupo; * p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01).
Discusión
La lucha contra el CP sigue siendo un problema de salud importante problema, especialmente para los pacientes con enfermedad en estadio avanzado, para los cuales la terapia dirigida puede traer esperanza. Aquí hemos demostrado que la terapia dirigida combinada contra Slug es eficaz en modelos de CaP metastásico. Con base en la literatura anterior y nuestros resultados, podemos concluir los diferentes rasgos de las células de CaP, que podrán ser objeto de estudios futuros para los establecimientos modelo apropiado (Figura 6A). Más importante aún, podemos proponer que Slug está situado en la confluencia de la vía /HSP90-AR mTOR /Erk y por lo tanto está respondiendo más a la combinación en lugar de monoterapia (Figura 6B). Bloqueando la corriente arriba de Slug, la inhibición de la capacidad metastásica debería beneficiar directamente a partir de activación E-cadherina. E-cadherina es una proteína de adhesión célula-célula dependiente de calcio y funciona como un supresor de tumores. La pérdida de la expresión o función E-cadherina es un evento común en la progresión tumoral [9]. Baja regulación de la E-cadherina es el objetivo clave de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) moduladores, que se conoce para desmantelar las uniones célula-célula cadherina-medicado y esencial para el desarrollo embrionario, la progresión del cáncer, y la resistencia a la quimioterapia [10,11] . Debido a su papel crucial en la EMT, E-cadherina requiere un control estricto en el cáncer. Así que en la mayoría de los escenarios de cáncer, la expresión de E-cadherina se suprime en el nivel transcripcional. Varias vías pro-oncogénicas, tales como MAPK /ERK, PI3K /Akt /mTOR, y Hsp90 /AR, participan en la regulación de la EMT [12,13], y todos comparten un punto final común: la activación de una serie de factores de transcripción que reprimir directamente E-cadherina. Varios factores de transcripción se han identificado que suprimen la E-cadherina incluyendo Snail, Slug, Twist and ZEB1 a través de su interacción con el sitio de unión de la caja E en el promotor de la E-cadherina [14,15].
Perfilado de la células de CaP se basa en este estudio sobre la base de nuestros resultados y los informes de la literatura (a). El patrón esquemático que muestra cómo la combinación de efecto de las drogas a través de la orientación de la vía relacionada con Slug Slug, donde se encuentra en el centro (B).
La vía de señalización PI3K /Akt /mTOR está bien documentada para ser frecuentemente desregulado y sirve como una vía oncogénica en varios tipos de carcinomas [16]. Ha sido bien establecido que la vía de señalización mTOR regula la síntesis de proteínas en respuesta a varios factores de crecimiento y por lo tanto afecta tanto a la supervivencia celular y la proliferación celular [17]. En el presente estudio, la inhibición de la señalización /Akt /mTOR PI3K, por rapamicina, parcialmente abolida inducida por HIF-1α Snail y los niveles de expresión de Slug en corta duración, lo que sugiere la expresión de Slug se puede regular por PI3K /Akt /señalización 18 mTOR [, 19]. La activación de la señalización de PI3K /Akt se ha encontrado para estimular caracoles y babosas expresión a través de GSK-3β señalización /β-catenina y para posteriormente regular a la baja E-cadherina en diferentes contextos celulares [20]. Los datos actuales apoyan el papel crucial para el /PI3K /Akt vía de señalización de HIF-1α /mTOR en la mediación de la Barra-regulación de la E-cadherina en el CaP. Sin embargo, la inhibición prolongada de mTOR por rapamicina muestran disminuida baja regulación de Slug, que es indicativo de una vía resistente siendo activado.
Como evidencia emergente sugiere que tanto la MAPK /ERK y la PI3K /Akt vías están involucrados en la regulación de la E-cadherina, que examinó la activación de ERK y se sorprendió al descubrir que el bypass con cuentas para el Erk resistencia a la inhibición de mTOR para Slug. En las células de cáncer de próstata, Slug dependiente de la regulación se ha demostrado que regular a la baja la expresión de E-cadherina a través del /ERK vía de señalización MAPK [21]. Caracterizado proteína activada de mamífero quinasa (MAPK) miembros de la vía se divide en tres subfamilias principales; señal extracelular-quinasa regulada 1/2 (ERK 1/2), p38 MAPK, y c-Jun N-terminal quinasa (JNK); Conservadas a través de la evolución, la vía de señalización de ERK 1/2 se organiza en una cascada de fosforilación de tres quinasa que implica Raf (o MAPK quinasa quinasa), MEK (o MAPK quinasa), y ERK 1/2 (o MAPK) [22,23] . La activación de ERK media en las respuestas a una serie de estímulos externos puede promover la expresión de genes específicos a través de la fosforilación de muchos factores de transcripción tales como Elk-1 [24]. Debido a la proximidad de la vía mTOR, Erk es muy probable que sea desviada cuando se inhibe la actividad de mTOR, como se muestra en nuestro estudio. Por lo tanto, la inhibición de las vías de MAPK /ERK, por Cl-1040 podría ambos utilizados como terapia independiente y como un sensibilizador a la rapamicina.
proteínas de choque térmico 90 (Hsp90) constar de una familia altamente conservada de proteínas que se requieren para la tolerancia al estrés en las células vivas. Hsp90 es una chaperona molecular ubicua, que se encuentra que se sobreexpresa en una variedad de cánceres incluyendo el cáncer de próstata, que es único entre los chaperones moleculares como la mayoría de sus sustratos conocidos son las proteínas de transducción de señales [25]. Entre sus proteínas cliente son factores de transcripción, los reguladores del ciclo celular, quinasas de señalización, mediadores de la apoptosis, así como receptores de hormonas esteroides, tales como el receptor de andrógenos (AR), que tienen papel crítico en la carcinogénesis de la próstata y en la progresión a CPRH [26] . Además, el AR impulsa el crecimiento de CPRH a través de una serie de mecanismos que dependen de Hsp90 íntimamente para la supervivencia celular, la sobreexpresión particularmente AR y de ganancia de función de las mutaciones del gen AR [27]. Por lo tanto, la orientación Hsp90 es un enfoque contra el cáncer particularmente atractivo para el cáncer de próstata. La amplia acción inhibidora de los inhibidores de Hsp90 parece ser eficaz en células que expresan variantes de corte y empalme del AR que carecen del dominio de unión a ligando y por lo tanto resistente a antagonistas de AR convencionales [28]. La primera clase de inhibidores de Hsp90 examinados fue análogos geldanamicina, específicamente 17-alilamino-17-desmetoxi- geldanamicina (17-AAG).