Extracto
El cáncer gástrico que incluye el cardias y no tipos -cardia es la segunda causa frecuente de muerte por cáncer en todo el mundo. Un subconjunto de no cardias cáncer gástrico loci de susceptibilidad genética se han abordado entre los asiático a través de los estudios de asociación de genoma completo (Glass). Este estudio fue evaluar los efectos de los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) de largos ARNs no codificantes intergénicas (lincRNAs) sobre los no cardias gástrico en la susceptibilidad al cáncer poblaciones chinas. Seleccionamos largos ARNs no codificantes intergénicas (lincRNAs) ubicadas en no cardias cáncer gástrico loci relacionados con el riesgo y se identificaron 10 SNPs situados dentro de las regiones exonic lincRNA. Examinamos si los polimorfismos genéticos en los exones lincRNAs están asociados con el riesgo de no cardias cáncer gástrico en 438 pacientes con cáncer gástrico no cardias y 727 sujetos de control en las poblaciones chinas mediante regresión logística. relevancia funcional se examinó mediante ensayos bioquímicos. Hemos encontrado que
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portadora rs8506AA se asoció significativamente con el riesgo de cáncer gástrico no cardias (odds ratio ajustado [OR] = 1,56; IC del 95% = 1,03 a 2,39, en comparación con el rs8506 AG o GG . genotipo Un análisis más detallado de estratificación mostró que el efecto de riesgo fue más pronunciado en los subgrupos de los fumadores (
P
= 0,001) el análisis bioquímico se demuestra que el G a un cambio de base en rs8506G & gt;. a interrumpe el sitio de unión para ha- . miR-526b, lo que influye en la actividad transcripcional de
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y que afectan a la proliferación celular Nuestro presente estudio establece una asociación sólida entre el rs8506G & gt; un polimorfismo en el
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exón y el riesgo de cáncer gástrico no cardias
Visto: Ventilador QH, Yu R, Huang WX, Cui XX, Luo BH, Zhang LY (2014) la cuenta-miR-526b sitio de unión rs8506G & gt; Un polimorfismo. en el
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Exon identificado por Glass predisponen a no cardias gástrico riesgo de cáncer PLoS ONE 9 (3):. e90008. doi: 10.1371 /journal.pone.0090008
Editor: Xiaoping Miao, MOE clave Laboratorio de Medio Ambiente y Salud, Escuela de Salud Pública, Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, China
Recibido: December 11, 2013; Aceptado 25 de enero de 2014; Publicado: 4 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Fan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Proyecto del Fondo de Desarrollo Social de Suzhou (SS08047), Departamento de Medicina clave de la provincia de Jiangsu en 2011. los fundadores tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo después del cáncer de pulmón en 2010, aunque las muertes de mortalidad. han disminuido ligeramente, pasando de 774.000 en 1990 a aproximadamente 755.000 en 2010 [1], [2]. Los estudios epidemiológicos han demostrado que el factor ambiental, incluyendo la dieta, el consumo de tabaco, consumo alcohólicas y, sobre todo, la infección por Helicobacter pylori se asocia con un mayor riesgo de GC [3], [4]. A pesar de estos factores de riesgo reconocidos, los investigadores siguen convencidos de que los factores genéticos, en particular los polimorfismos de nucleótido único (SNP), es probable que desempeñan un papel esencial en riesgo de un individuo de desarrollar cáncer gástrico, ya que sólo una fracción de los individuos expuestos a desarrollar cáncer gástrico [5] .
Hasta la fecha, con el avance de la secuenciación del transcriptoma próxima generación (RNA-Seq), se ha producido un profundo cambio en nuestra comprensión de todo el conjunto de las aberraciones de la transcripción de una enfermedad, incluyendo nuevas transcripciones y no codificante ARN (ncRNAs) que no están registrados por los análisis convencionales [6] - [9]. De todas las clases actualmente caracterizadas de moléculas no codificantes RNAs, éstos han sido llamados a largo intervenir ncRNAs (lincRNAs) más de 200 nucleótidos (nt) que se carece de un marco de lectura abierto y no se solapan los genes codificantes de proteínas [7], [10]. Grupos de lincRNAs han sido bien caracterizados en cierta medida y demostrado correlacionado con importantes procesos celulares tales como la impresión, la inactivación del cromosoma X, mantenimiento la pluripotencia, y la regulación transcripcional [10] - [15]. Además, la evidencia emergente de expresión lincRNA dysregulated en numerosos tipos de cáncer han surgido lincRNA como un nuevo aspecto de la biología, la evidencia que sugiere que un papel importante para la participación de lincRNA en la tumorigénesis y metástasis humano [16], [17]. De hecho, un ejemplo bien descrito,
HOTAIR
se han estudiado las contribuciones a la progresión gradual de la tumorigénesis [11], [18], destacando el papel de lncRNAs en la biología del cáncer. Además, el ARN no codificante largo
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(asociados a metástasis de pulmón adenocarcinoma transcripción 1), es misregulation frecuente y como marcador predictivo para una variedad de cánceres humanos de colon, de mama y de próstata [19] - [ ,,,0],22]. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a la función específica de lincRNAs en el desarrollo del cáncer no ha sido perfectamente descritos.
En la última década, varios estudios de asociación de genoma completo imparciales (GWAS) han ampliado nuestra comprensión de las variaciones genéticas relacionadas con diferentes tipos de enfermedades y cánceres de tecnologías de alto rendimiento [23]; sin embargo, al menos un tercio de las variantes identificadas están dentro de los intervalos no codificantes [24]. Recientemente, dos GWAS reveló que varios loci de susceptibilidad riesgo que se asocian con el riesgo de no cardia cáncer gástrico (NCGC) en una población china. Bioinformática análisis ha puesto al descubierto numerosas lincRNAs cerca de estos loci. Por otra parte, varios polimorfismos relevantes nucleótido único (SNP) que se encuentran en las regiones exonic de lincRNAs que pueden asociarse con NCGC fueron identificados; Sin embargo, rara vez se ha informado de la asociación entre las variaciones genéticas en los exones lincRNAs y la susceptibilidad al cáncer.
En el presente estudio, la hipótesis de que los SNPs en la región exonic de lincRNAs puede alterado los niveles de expresión y con ello puede contribuir a NCGC. Para probar esta hipótesis, se realizó un estudio de casos y controles de base hospitalaria para investigar las asociaciones entre estos SNPs y la susceptibilidad a NCGC en una población china.
Materiales y Métodos
Todos los sujetos del estudio fueron étnicamente homogéneos chinos Han, incluyendo 438 pacientes NCGC y 727 controles sanos. Los pacientes que se sometieron a cirugía en los hospitales afiliados de la Universidad Soochow (Suzhou) fueron reclutados consecutivamente desde 2003 a 2009, con una tasa de respuesta del 94%. Los pacientes procedían de la ciudad de Suzhou y sus regiones circundantes, y no hay restricciones de edad, sexo, y la histología. Los detalles relativos a las características clínicas de los pacientes se resumen en la Tabla 1. El tumor, nódulo, metástasis (TNM) y la estadificación del tumor fueron evaluados de acuerdo con el Comité Común 2002 Americana sobre sistema de clasificación por etapas del cáncer. controles de la población eran personas libres de cáncer que viven en la región de Suzhou; que fueron seleccionados a partir de una encuesta nutricional realizada en el mismo período que se recogieron los casos. Las muestras de control estaban disponibles para nosotros a partir de estudios anteriores que fueron seleccionados al azar de una base de datos que consta de 3500 individuos sobre la base de un examen físico [25] - [27]. La medida para el suero H.pylori inmunoglobulina G en pacientes y controles NCGC se determinó mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Este estudio fue aprobado por el comité de ética médica de la Universidad Soochow. Todos los participantes eran genéticamente no relacionados con la etnia han china y ninguno tenía la transfusión de sangre en los últimos 6 meses. Después de haber dado un consentimiento informado por escrito, cada participante fue programado para una entrevista con un cuestionario estructurado para recopilar la información seleccionada, y para donar 5 ml de sangre periférica.
SNP Selección
Todo publicó la literatura que investiga una asociación entre la susceptibilidad genética y el riesgo NCGC fueron elegibles. Se realizaron búsquedas de estudios hasta agosto de 2013 utilizando la base de datos PubMed y Web of Science. los términos de búsqueda relevantes fueron "estudio de asociación de todo el genoma", "GWAS", "NCGC", "cáncer gástrico", "cáncer de estómago", y "asiática". También se realizaron búsquedas manualmente las listas de referencias de los artículos seleccionados. En primer lugar nos excluyeron algunos artículos mediante el escaneo de los títulos y resúmenes de los estudios que no estaban escritas en Inglés. Entonces, después de leer el texto completo de los artículos restantes, hemos identificado un conjunto final de estudios. Todos los estudios seleccionados cumplen los siguientes criterios: (1) el resultado investigadas se basó en los GWAS en relación con NCGC en los seres humanos; (2) los artículos se publicaron en Inglés; (3) Se seleccionaron los estudios más recientes entre los datos y la superposición de datos duplicados; (4) GWAS se llevó a cabo utilizando la tecnología de chip. Los principales criterios de exclusión fueron: (1) Opiniones, tutoriales, cartas y editoriales; (2) duplicar los datos; (3) no es un diseño de casos y controles; y (4) la superposición de datos o los datos vertidos por los últimos informes. A continuación, hemos recorrido el locus de susceptibilidad identificados por GWAS para NCGC en los artículos seleccionados, 4 lincRNAs que no se superponen con los genes reconocidos dentro de un rango de 1 MB de estos loci, en cualquier dirección (un lapso total de 2 MB) fueron finalmente identificados de la base de datos lincRNAs humanos [28]. Además, el software Haploview 4.2 se utilizó para el análisis bioinformático de los bloques de haplotipos en base a los datos de la población china Han Beijing (CHB) en HapMap (HapMap datos de salida 27 Fase II + III, febrero de 2009, en el conjunto de NCBI B36, B126 dbSNP). se extrajo Estos SNPs alelo con menor frecuencia de más de 5% en la población china. Había tres bloques de haplotipos en la población china (Figura 1A). Los haplotipo el etiquetado SNPs fueron seleccionados con el software 4.2 Haploview programa Tagger; se encontró que el rs11752896, rs11752942, rs4714336 y rs4711631 cubrieron el haplotipo en el bloque 1 a una frecuencia de 100% (rs11752896 y rs11752942: D '= 1,0, r
2 = 1,0; rs11752896 y rs4714336: D' = 1,0, r
2 = 1,0; rs11752896 y rs4711631: D '= 1,0, r
2 = 1,0). Además, rs2467950, rs2450764 y rs9312, rs8506 cubrieron el haplotipo en el bloque 1 a un 100%, respectivamente (rs2467950 y rs2450764: D '= 1,0, r
2 = 1,0; rs9312 y rs8506: D' = 1,0, r
2 = 1,0). rs2304285 y rs2477757 SNP están fuera de los bloques. Por lo tanto, los SNP rs11752896, rs2467950, rs8506, rs2477757 y rs2304285 fueron elegidos como cinco SNPs funcionales potenciales en el exonic de los lincRNAs seleccionados para ser analizados por sus asociaciones con riesgo de cáncer gástrico.
(A) El desequilibrio de ligamiento (LD) mapa de SNPs seleccionados de
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exón. Se demostró que rs11752896, rs11752942, rs4714336 y rs4711631 están en LD con D '= 1; rs2467950 y rs2450764 están en LD con D '= 1; rs9312 rs8506 y están en LD con D '= 1. (B) Los niveles de transcripción de control nuclear (
U6
), frente al citoplasma de la transcripción de control (
GAPDH
ARNm), y
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fueron evaluados por RT-qPCR en fracciones nucleares y citoplasmáticas. Los datos son la media ± error estándar de la media. Los datos se presentan como porcentaje de los
U6
,
GAPDH
y
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niveles y los niveles totales de cada fueron llevados a ser del 100%. (C-D)
in silico,
predicción de estructuras plegables inducidos por rs8506G & gt; A en
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. La trama de la montaña es un gráfico XY-gráfico que representa una estructura secundaria incluyendo la estructura MFE, el conjunto termodinámica de las estructuras de ARN (PF), y la estructura centroide en una parcela de altura frente a la posición. "MFE" representa estructura mínima energía libre; "PF" indica la función de partición; "Centro de gravedad" representa la estructura centroide.
Análisis de Genotipado
ADN del genoma se extrajo a partir de linfocitos de sangre periférica de los sujetos de estudio. Se utilizó específica de alelo MALDI-TOF espectrometría de masas para determinar el genotipo de los marcadores utilizados en el análisis de asociación, como se describe anteriormente [27], [29]. Un total de 60 muestras fueron seleccionados al azar para la secuenciación directa para confirmar los resultados de genotipado a partir del análisis de espectrometría de masas, y los resultados fueron en un acuerdo del 100%. Aproximadamente, el 10% de las muestras también fueron seleccionados al azar para una repetición ciega de la determinación del genotipo sin conocimiento previo del resultado genotipado anterior o la condición de ser un caso y control, y los resultados fueron en un acuerdo del 100%.
Cultivo de células
el 293T o HGC-27 fueron adquiridos de la célula Banco de Type Culture Collection de la Academia de Ciencias de china, Shanghai Instituto de Biología celular, y se hicieron pasar por menos de 6 meses. Las células 293T o HGC-27 se mantuvieron en DMEM con alto contenido de glucosa (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) o RPMI 1640 suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) y 50 mg /ml de estreptomicina (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) en un 37 ° C en presencia de 5% de CO
2.
Fraccionamiento subcelular
HGC- 27 células se cultivaron en un incubador humidificado durante 2 días. Para los experimentos de fraccionamiento subcelular, de hasta 2 × 10
Se han usado 6 células. Citosólicas y nucleares extractos de células de cáncer de mama se recogieron usando un kit nuclear /citosol Fraccionamiento (Biovision, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
in silico,
Predicción de estructuras plegables inducidas por Rs8506G & gt ; a en
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a medida que ciertas estructuras son más propensos a jugar un papel clave en las funciones biológicas; de este modo se utilizó RNAfold y SNPfold algoritmos para predecir la supuesta influencia de rs8506G & gt; A en las estructuras plegables locales de
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mediante el análisis de las regiones de 61 pb que flanquean el polimorfismo
Construcción de. reportero plásmidos
Dos reportero plásmidos que contenían 160 pb
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fragmento de la región exón que flanquea el alelo rs8506G o rs8506A fueron sintetizados por la Compañía GENEWIZ (Suzhou, china) y luego se clonaron en el psiCHECK- 2 vector básico (Promega, Madison, WI) (Figura 1B). La construcción resultante con
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rs8506 SNP (psiCHECK-2-lincRNA-rs8506G y psiCHECK-2-lincRNA- rs8506A) fue confirmada por secuenciación.
Las transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa
Bioinformática análisis reveló que el rs8506G & gt; Un polimorfismo localizar en el sitio de unión del microARN miR-tiene-526b (http://snpinfo.niehs.nih.gov/). De esta manera, se aplicaron los imitadores y los inhibidores de la cuenta-miR-526b (GenePharma Co, Shanghai) para analizar el efecto de la cuenta-miR-526b en psiCHECK-2-lincRNA-rs8506 genes indicadores
in vitro
. Las células 293T o HGC-27 se sembraron en placas de 24 pocillos (1 x 10
5 células por pocillo) y se cultivaron a 60-70% de confluencia antes de la transfección; células fueron transfectadas con los plásmidos indicadores descritos más arriba usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [25]. En cada uno imita bien, co-transfección se realizó usando 800 ng de ADN plásmido construido y 0, 1, o 40 pmol microRNA ha-miR-526b (Shanghai GenePharma Co., Ltd.), y con o sin 40 pmol tiene-miR inhibidor -526b, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad luciferasa se midió con el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI, EE.UU.) utilizando un 20 TD-/20 luminómetro (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, EE.UU.), y los resultados se normalizaron en contra de la actividad de
Renilla
gen de la luciferasa. Cada grupo incluyó a 6 repeticiones, y se realizaron tres experimentos independientes.
vector de expresión de la construcción
Para estudiar más a fondo el papel de
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albergar rs8506G y alelos rs8506A se sintetizaron por la Sociedad GENEWIZ (Suzhou, china) y después se clonó en los vectores pcDNA3.1. La construcción resultante con
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rs8506 SNP (pcDNA-lincRNA-rs8506G y pcDNA-lincRNA-rs8506A) fue confirmada por secuenciación.
Aislamiento de ARN y Análisis Cuantitativo de RT-PCR
Treinta y dos muestras de tejido NCGC se obtuvieron de biopsias de pacientes individuales y se almacenaron a -80 ° C antes del análisis. El ARN total se obtuvo a partir de estos tejidos cancerosos con el reactivo Trizol (Molecular Research Center, Inc.). Se generó ADNc a partir de ARNm usando el cebador aleatorio y Superscript II (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (RT-PCR) se llevó a cabo para cuantificar la expresión génica relativa de
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, usando un ABI Prism 7500 sistema de detección de secuencia (Applied Biosystems) basado en el SYBR verde método, y
GAPDH
se utilizó como un gen de referencia interno en cada reacción.
Cell Visibilidad Ensayo
96 pocillos, placas de fondo plano (BD Biosciences, Bedford , MA), 100 l HGC-27 células cotransfectadas con pcDNA-lincRNA-rs8506SNP y tiene-miR-526b o control se dividen en partes alícuotas en cada pocillo. La viabilidad celular se midió por Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Laboratorio Dojindo, Kumamoto, Japón) en base a las instrucciones del fabricante.
Análisis estadístico
Las diferencias en la distribución de los seleccionados variables demográficas entre los casos y controles, así como las frecuencias alélicas y genotípicas fueron evaluados por dos caras pruebas de chi-cuadrado. Los modelos de regresión logística incondicional fueron utilizados para estimar las asociaciones de genotipos de SNP con el riesgo de cáncer gástrico mediante la odds ratio (OR) y sus intervalos de confianza del 95% (IC), seguido por el análisis de la estratificación por edad, sexo, tabaquismo y el estado de la bebida. El modelo de regresión logística se utilizó en la prueba de tendencia, así como para evaluar el potencial gen-gen multiplicativo y aditivo y las interacciones gen del factor-ambiental. Por otra parte, los datos fueron estratificados además por subgrupos de las variables clínico-patológica. el poder estadístico se calcula aplicando el software PS (http://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize, consultado el 14 de Dic, 2010). Se utilizó una sola vía prueba de ANOVA para evaluar el efecto de diferentes SNPs en el
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transcripción de expresión. Todas las pruebas fueron dos caras utilizando el software SAS (versión 9.1; SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.). Un
P
. & Lt; 0,05 se utilizó como criterio de significación estadística
Resultados
Los genotipos y riesgo de falta de cardias gástrico cáncer
En el presente estudio, cinco SNPs se genotipo entre los casos y controles. Como se muestra en la Tabla 2, se observó una asociación significativa con el riesgo NCGC para rs8506G & gt; A. En concreto, los resultados de la determinación del genotipo mostraron que, en comparación con el rs8506GG o genotipo AG,
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portadora rs8506AA se asoció significativamente con el riesgo de cáncer gástrico no cardias (odds ratio [OR] = 1,56, 95% CI = 1,03-2,39). Además, se examinaron diferencias significativas en los otros cuatro SNPs (
P
& gt; 0,05). Por lo tanto, podemos concluir que la variante genética rs8506G & gt; Un polimorfismo en
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juega un papel significativo en la mediación del riesgo de NCGC
Análisis Estratificación de Rs8506G & gt;. Un genotipos y riesgo de NCGC
Se realizó además un análisis de la estratificación de las asociaciones entre los genotipos variantes y riesgo de NCGC por subgrupos de características clinicopatológicas de NCGC en este estudio. Como se muestra en la Tabla 3, se observó una asociación significativa entre los genotipos variantes y el riesgo de NCGC en sujetos con el tabaquismo (OR ajustada IC = 1,63-3,78, = 2.48, 95% prueba de homogeneidad
P
= 0,001) , lo que sugiere que el tabaquismo modula la asociación entre el
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rs8506G & gt; una variante genotipos y el riesgo de NCGC. No se encontró asociación significativa se encontró en otros subgrupos.
Caracterización celular de
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Los niveles de transcripción de control nuclear (
U6
), transcripción citoplasmática de control (
GAPDH
ARNm), y
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fueron evaluados por RT-qPCR en fracciones nucleares y citoplasmáticas de las células HGC-27, respectivamente. Los resultados mostraron que
GAPDH
mRNA se detectó exclusivamente en la fracción citoplásmica, mientras que núcleo retenida
U6
se encuentra predominantemente en la fracción nuclear. Y
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expresión era predominantemente citoplasmática (Figura 1B)
in silico,
Análisis del efecto de Rs8506G & gt;. A en
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plegable
Uso RNAfold y SNPfold algoritmos en
in silico-
análisis, se predijo cambios estructurales locales de
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causados por el rs8506G & gt; Un polimorfismo localizado dentro la región exonic de
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. Como se muestra en la figura 1C y D, los resultados sugieren que el G a un cambio de base de rs8506G & gt; afecta a un directamente el plegado de
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, que puede afectar el sitio de unión para el microARN. Esto puede entonces influir en el
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expresión génica
Rs8506G & gt;. A genotipos influir en el
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Expresión mediante la interrupción de la unión de Has-miR-526b
in vitro
Dos construcciones de gen reportero luciferasa contenían rs8506G o alelo a se ensayaron por transitoriamente co-transfección con mímica y el inhibidor de la cuenta-miR-526b que se basa la unión a rs8506G & gt; Un sitio polimórfico por análisis de la bioinformática. El resultado de la actividad luciferasa mostraron que las células HEG-27 transitoriamente cotransfectadas HAS-miR-526b imita y construcción que contiene el alelo rs8506G exhibido reducido significativamente la actividad de la luciferasa, de una manera dependiente de la concentración, y los inhibidores de la cuenta-miR-526b significativamente invertida y upregulated sus actividades. Sin embargo, no se observó ningún cambio evidente para el gen reportero con un alelo tratados con imita o inhibidores tiene-miR-526b (
P
& gt; 0,05) (Figura 2A). Los mismos resultados se observaron también cuando estos experimentos se repitieron usando células 293T (Figura 2B).
gráfico representativo de la actividad luciferasa del alelo variante de genes informadores de luciferasa que lleva el
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región exonic que abarca 160 pares de bases que flanquean la rs8506G & gt; A segmentos de polimorfismo en HEG-27 (A) y las células 293T (B). Los resultados se muestran como porcentaje relativo a la actividad de luciferasa (se midió la actividad de luciferasa de Renilla y se normalizó para la luciferasa de luciérnaga). la actividad de luciferasa relativa del psiCHECK-2-
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-G-alelo y psiCHECK-2- construcciones
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-A-alelo cotransfected con HAS-miR-526b y mímica inhibidor. Seis repeticiones para cada grupo y el experimento repitieron al menos tres veces. Los datos son la media ± SEM. El asterisco indica un cambio significativo (
P Hotel & lt; 0,001). (C)
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niveles de expresión en treinta y dos pacientes con cáncer gástrico no cardias para diferentes rs8506G & gt; A genotipos (15 rs8506GG, 11 rs8506AG y 6 rs8506AA); los datos son la media ± error estándar de la media. HEG-37 células (D) se cotransfectaron pcDNA-lincRNA-rs8506G o pcDNA-lincRNA-rs8506A con cuenta-miR-526b. Después de 24 h, se recogieron las células, el ARN extraído y PCR en tiempo real realizado. Los datos son la media ± error estándar de la media. "Asterisco" representa
P Hotel & lt; 0,05. tasa de proliferación (E) Cells fue significativamente inhibido cuando las células cotranfected
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haboring rs8506G alelo y tiene-miR-526b. La proliferación celular se realizó por el ensayo de viabilidad celular y el efecto se hizo evidente a partir de día 2. Seis repeticiones para cada grupo y el experimento repitió al menos tres veces. Los datos son la media ± error estándar de la media. "Asterisco" representa
P
. & Lt; 0,05
Asociación de Rs8506G & gt; A genotipos con
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Expresión
Nos recogieron 32 tejidos tumorales de los pacientes no tratados con NCGC diferentes genotipos y realizaron PCR en tiempo real para evaluar los efectos de los
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rs8506G & gt; a en
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expresión. El resultado mostró que los pacientes con los genotipos rs8506AG y rs8506AA expresadas significativamente mayor
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niveles de mRNA (media ± SEM) en comparación con los portadores del genotipo rs8506GG (AG: 0,029 ± 0,005; AA: 0,040 ± 0,005; GG: 0,019 ± 0,004;
P = 0,023
), como se muestra en las figuras 2C
Reglamento El efecto de los genes miARN dependientes de
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Expresión de la proliferación celular.
además, investigó si el
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rs8506G & gt; a genotipos tienen efectos sobre la proliferación celular en
in vitro
. Como se muestra en la Figura 2D,
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disminución en la expresión después de 24 h de la transfección en las células transitoriamente co-transfectadas con pcDNA-lincRNA-rs8506G y tiene-miR-526b en comparación con los co-transfectadas con pcDNA-lincRNA- rs8506A y tiene-miR-526b (
P Hotel & lt; 0,001). Las células con disminución de la expresión de
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tenido una tasa de crecimiento de las células débiles en comparación con las células transfectadas con pcDNA-lincRNA-rs8506A y tiene-miR-526b desde el día 2 (
P = 0,004
) (Figura 2E)
Dicussion
En el presente estudio de casos y controles de base hospitalaria que contiene un total de 438 pacientes y 727 controles sanos, nuestro grupo encontramos la rs8506G & gt;. a se asocia con riesgos de NCGC. Nuestros datos mostraron que los sujetos portadores de los genotipos rs8506AG y rs8506AA tenían un riesgo significativo aumento de NCGC en comparación con el genotipo GG (
P Hotel & lt; 0,05). Además, parecía que un alto efecto de riesgo de este polimorfismo fue más pronunciado en sujetos fumadores. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para evaluar integralmente la asociación entre las variantes en exonic de lincRNA y el riesgo de NCGC.
Como otra clase de ARNs no codificantes reguladoras, lincRNAs, se han mudado recientemente a la vanguardia de la no codificante estudio de ARN. Estas moléculas de ARNm similar, carecen de un marco de lectura abierto significativa, generalmente se capsulado, empalmado y poliadenilado se han implicado en una amplia gama de procesos celulares, tales como la arquitectura nuclear, la regulación de la expresión génica, la vigilancia inmune, o la pluripotencia de células madre embrionarias. Un puñado de estudios han demostrado lincRNAs surgido como un nuevo aspecto de la biología en una variedad de estados de enfermedad, y los cambios en los niveles de expresión de lincRNAs puede contribuir a la biología del cáncer a nivel transcripcional, post-transcripcional y epigenéticos [18], [30] - [32]. Una lincRNA prominente,
ANRIL
, habían sido implicado funcionalmente en la progresión del cáncer, por lo general la represión de la expresión génica a través de la unión a epigenética y la contratación de la modificación de la cromatina complejos [33], [34]. Otro ejemplo famoso es el lincRNA,
GAS5
; aberraciones genéticas en este locus lincRNA se han encontrado en muchos tipos de tumores, incluyendo melanoma, mama y cánceres de próstata [35] - [37]. Estas líneas de evidencia apoyan la importancia de lincRNAs en la biología celular y la oncogénesis. Recientemente, dos Glass han informado de un subconjunto de NCGC loci de susceptibilidad (5p13.1, 3q13.31, 8q24.3, 6p21.1 y 7p15.3) que el asociado con el desarrollo de NCGC. Bioinformática análisis reveló varios lincRNAs cerradas para estos loci. Además, se han identificado varios polimorfismos relevantes nucleótido único (SNP) que se encuentran en las regiones exonic de lincRNAs que pueden asociarse con NCGC. Como todos conocemos, en la última década, con la disponibilidad de la secuenciación del ARN a gran escala, se está convirtiendo en muy claro que miles de variantes genéticas relacionadas con la enfermedad residían fuera de los genes o incluso en las transcripciones no codificantes ya han sido obtenidas por proyecto del genoma de los mamíferos [24]. Recientes evidencias emergentes han indicado la asociación entre los SNPs residía en lincRNAs y los cánceres humanos. Por ejemplo, en base a los datos de 1000 genomas, Guangfu Jin y colleages que han encontrado que las regiones de lncRNA tenían una densidad SNPs similares a las regiones codificantes de proteínas y anotado aún más los SNPs relacionados fenotipo-reportados por GWAS en la región de lncRNA puede contribuir a la próstata riesgo [ ,,,0],38]. Un estudio reciente informó también que un polimorfismo genético en
lincRNA-uc003opf.1
gen se asocia con un mayor riesgo de desarrollar carcinoma de células escamosas de esófago en la población china [39]. En conjunto, nuestro estudio es consistente con los hallazgos previos demostraron que
lincRNA-NR_024015
fue moderadamente más abundantes en el citoplasma que en el núcleo de las células de cáncer gástrico fraccionadas, lo que sugiere que la función de este lincRNAs se ejerce en el citoplasma . Nuestros resultados proporcionan una fuerte evidencia de apoyo a una hipótesis para la regulación citoplasmática, en la que el
lincRNA-NR_024015
rs8506G & gt;. Un SNP puede afectar a la expresión de este lincRNA mediante la modificación del sitio de unión para la tiene-miR-526b
en el presente estudio, nuestro resultado de la asociación entre un polimorfismo genético en las regiones exónicas de un lincRNA y la susceptibilidad a NCGC se obtuvo en primer lugar en la población china. Los tamaños de muestra relativamente grandes utilizados se redujo el tamaño de las RUP que se pueden detectar estadísticamente. Por otra parte, hemos logrado una potencia estudio de más de 90% (prueba de dos caras, α = 0,05) en la detección de un OR de 1,28 para los genotipos rs8506AG + AA (que ocurre a una frecuencia de 42,5% entre los controles), en comparación con el genotipo rs8506GG. Cabe destacar que la asociación es biológicamente plausible y es consistente con los hallazgos de nuestros estudios funcionales.
En conclusión, el presente estudio proporciona la primera evidencia de que los polimorfismos genéticos en las regiones exonic de lincRNAs juegan un papel vital en la mediación individuo susceptibilidad a NCGC. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que las variantes genéticas en las regiones exonic lincRNA pueden afectar la regulación microRNA mediada y se asocia con el riesgo de GC. Nuestros resultados justifican la validación de, preferiblemente, estudios de casos y controles, así como por estudios sobre el mecanismo bien diseñados basados en la población de mayor tamaño.