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PLOS ONE: La curcumina aumenta el efecto de la quimioterapia contra células de cáncer colorrectal mediante la inhibición de NF-kB y la proteína quinasa Src señalización Pathways


Extracto

Objetivo

El desarrollo de resistencia al tratamiento y la toxicidad adverso asociado con agentes quimioterapéuticos clásicos pone de relieve la necesidad de enfoques terapéuticos más seguros y eficaces. En este documento, hemos examinado la eficacia de un régimen de tratamiento de combinación de 5-fluorouracilo (5-FU) y la curcumina en células de cáncer colorrectal (CRC).

Métodos

Tipo de células HCT116 salvajes y HCT116 + células CH3 (complementados con el cromosoma 3) fueron tratados con curcumina y 5-FU de una manera tiempo y dependiente de la dosis y evaluados por ensayos de proliferación celular, la tinción DAPI, microscopía electrónica de transmisión, análisis del ciclo celular e inmunotransferencia de las proteínas de señalización clave.

resultados

El individuo IC
50 de curcumina y 5-FU fueron de aproximadamente 20 micras y 5 micras de células HCT116 y 5 M y 1 M en las células HCT116 + CH3, respectivamente (
p & lt; 0,05
). El pretratamiento con la curcumina reducido significativamente la supervivencia tanto en las células; células HCT116 + CH3 eran considerablemente más sensibles al tratamiento con curcumina y /o 5-FU de las células HCT116 de tipo salvaje. El IC
50 valores para el tratamiento de combinación fue de aproximadamente 5 mM y 1 M en HCT116 y 5 M y 0,1 M en HCT116 + CH3, respectivamente (
p & lt; 0,05
). La curcumina indujo apoptosis en las células mediante la inducción de degeneración mitocondrial y la liberación del citocromo c. Análisis del ciclo celular reveló que el efecto antiproliferativo de la curcumina y /o 5-FU fue precedida por la acumulación de células de CRC en la fase del ciclo celular S y la inducción de apoptosis. La curcumina potenció la expresión o la escisión de las proteínas pro-apoptóticas las reguladas anti-apoptóticas (Bcl-XL) y la proliferativa (ciclina D1), proteínas (caspasa-8, -9, -3, y Bax PARP), y 5-FU-inducida . Aunque el 5-FU activa ruta de NF-kB /PI-3K /Src en células CRC, esta se había reducido regulado por el tratamiento de cúrcuma a través de la inhibición de la activación de la quinasa y la fosforilación de I? B? I? B.

Conclusiones

la combinación de la curcumina con agentes quimioterapéuticos convencionales tales como 5-FU podría proporcionar estrategias de tratamiento más eficaces contra las células de cáncer de colon quimiorresistentes. Los mecanismos implicados pueden ser mediados a través de vías PI-3K /Src NF-kB /y productos de los genes regulados NF-kB

Visto:. Shakibaei M, Mobasheri A, C Lueders, Busch M, P Shayan, Goel Un (2013) la curcumina aumenta el efecto de la quimioterapia contra células de cáncer colorrectal mediante la inhibición de NF-kB y la proteína quinasa Src vías de señalización. PLoS ONE 8 (2): e57218. doi: 10.1371 /journal.pone.0057218

Editor: Bharat B. Aggarwal, la Universidad de Texas Centro de Cáncer MD Anderson, Estados Unidos de América

Recibido: July 9, 2012; Aceptado 22 de enero de 2013; Publicado: 22 Febrero 2013

Derechos de Autor © 2013 Shakibaei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los principales. causas de muerte en hombres y mujeres, y se encuentra entre los terceros cánceres más comunes en todo el mundo [1]. La prevalencia de la CRC sigue aumentando a pesar de nuestra mejor comprensión de la patogénesis de esta enfermedad, así como el establecimiento de estrategias de detección mejorados para esta malignidad. Se ha informado de que casi el 50% de los pacientes con CCR, desarrollará la enfermedad recurrente, lo que indica que los regímenes de tratamiento disponibles en la actualidad no son capaces de controlar esta enfermedad mortal y hay una necesidad imperiosa de mejorar las terapias [2]. 5-fluorouracilo (5-FU) es uno de los medicamentos clásicos usados ​​como agente quimioterapéutico contra el CRC. tratamiento con 5-FU suprime el crecimiento de células tumorales e induce la apoptosis mediante la incorporación de sus metabolitos en el ADN y el ARN a través de la timidilato sintasa. Sin embargo, las ganancias realizadas por la eficacia de la quimioterapia de 5-FU son algo limitadas en pacientes con cáncer colorrectal, debido principalmente a la resistencia adquirida progresiva de las células de CRC a 5-FU y la toxicidad para las células sanas circundantes [3], [4].

la mayoría de los tumores activan el factor de transcripción del factor nuclear kappa B-(NF-kB), mientras que los agentes quimiopreventivos naturales que suprimen, lo que indica un fuerte vínculo entre la biología del tumor y los efectos anticancerígenos de diversos compuestos naturales [5]. En contraste con las células sanas, en la mayoría de líneas celulares de tumores sólidos y hematopoyéticos NF-kappa B es constitutivamente activa [6]. Además, las citoquinas pro-inflamatorias, agentes quimioterapéuticos y la radioterapia, que inducen la apoptosis también activan NF-kB [7] y por lo tanto puede mediar la quimiorresistencia y radioresistance de las células tumorales [8]. Curiosamente, la inhibición de NF-kappa B en células bloques tumor proliferación, provoca la detención del ciclo celular, y conduce a la apoptosis, lo que sugiere un papel central para este factor de transcripción en la proliferación celular y la supervivencia [9]. NF-kappa B desempeña un papel importante en la proliferación celular y transformación maligna en diferentes células, la unión a sitios diana de ADN como homo- o heterodímero para influir en la expresión de genes aguas abajo [10], [11].

CRC se cree que es ocurrir como consecuencia de la acumulación gradual de alteraciones genéticas en diversos genes que conducen a la inestabilidad genómica mejorada. Estas alteraciones tienen una influencia directa sobre los genes asociados a metástasis, oncogenes y genes supresores de tumores [12], [13]. Por otra parte, hoy se reconoce que, además de los eventos genéticos en el CCR, las alteraciones en la expresión de genes pueden estar mediados por alteraciones epigenéticas que incluyen la metilación aberrante del ADN, modificaciones de las histonas y la remodelación de la cromatina [14], [15]. Además, el sistema (MMR) de reparación de genes desempeña un papel esencial en la corrección de errores de la síntesis de ADN durante la replicación celular. El daño al sistema MMR causa inestabilidad genética, dando lugar a alteraciones en el fenotipo de las células, haciendo que la célula sea más susceptible a la transformación neoplásica y facilitar el desarrollo de la resistencia quimioterapéutico. proteínas de ADN MMR, como hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS2 y hMLH3 juegan un papel importante en ambas variedades esporádicos y familiares de CCR humana [16], [17], [18], [19]. De hecho, la restauración del defecto MMR por la re-expresión de hMSH2 hMLH1or por transferencia cromosoma confiere una mayor sensibilidad a los agentes [20], [21].

El CCR es una enfermedad prevenible, y está fuertemente influenciado por el medio ambiente , estilo de vida y factores dietéticos. En este contexto, hay un creciente cuerpo de literatura que sugiere que varias sustancias naturales que ocurren como suplementos dietéticos pueden reducir el riesgo de cáncer y se ha informado de mantener un papel central en el desarrollo de fármacos antitumorales [22], [23]. productos naturales con la capacidad de inhibir la activación del factor de transcripción nuclear NF-kB podría tener un potencial terapéutico contra el desarrollo de tumores como CRC. La curcumina (diferuloylmethane) es el componente fitoquímico biológicamente activo presente en la cúrcuma (
Curcuma longa
), y ha demostrado ser un potente inhibidor de la activación de NF-kB en varios tipos de células a concentraciones no tóxicas en seres humanos [ ,,,0],24]. La propiedad antitumoral de la curcumina, es en parte debido a la detención de las células cancerosas en S, fase del ciclo celular G2 /M y la inducción de la apoptosis. Además, la curcumina inhibe el crecimiento de células de cáncer de colon ADN MMR-deficientes [25], [26]. También se ha informado de que la curcumina quinasa regula a la baja activada constitutivamente PI-3K vías /Akt en células de leucemia de células T, que suprime la proliferación e induce la apoptosis dependiente de caspasa [27].

Dado que los pacientes de cáncer colorrectal con la deficiencia de desajuste de reparación del ADN no se benefician de la quimioterapia basada en 5-FU, se utilizó un par de líneas de células isogénicas, HCT116 (MMR deficiente, debido a la hipermetilación del gen MLH1) y HCT116 + CH3 (MMR-competente, debido a la transferencia estable de el cromosoma 3 de soporte de copia de tipo salvaje del gen MLH1). El objetivo de este estudio fue examinar el potencial quimiosensibilización de la curcumina en la quimioterapia basada en 5-FU en células CRC MMR-deficientes y -proficient.

Materiales y Métodos

Los anticuerpos

Los anticuerpos contra MMP-9 (MAB 911) y activa la caspasa-3 (AF835) se obtuvieron a partir amp I +; D Systems, Inc., (Heidelberg, Alemania). Monoclonal anti-PARP [poli (ADP-ribosa) polimerasa] (7D3-6) anticuerpos fueron adquiridos de Becton Dickinson (Heidelberg, Alemania). La ciclooxigenasa-2 (160-112) de anticuerpos se obtuvo de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EE.UU.). Los anticuerpos de beta-actina (A5316) fueron de Sigma (Munich, Alemania). Los anticuerpos frente a Bax se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra I? B? Fosfo-específico (Ser-32/36), p65 y p65 fosfo-específico (Ser536) se obtuvieron de Cell Technology (Beverly, MA). Anti-I? B quinasa (anti-IKK) -a y (anti-IKK) -β anticuerpos se obtuvieron de Imgenex (Hamburgo, Alemania). fosfatasa alcalina de oveja anti-ratón ligado y de oveja anti-conejo anticuerpos secundarios para la inmunotransferencia se adquirieron de Millipore (Schwalbach, Alemania). Todos los anticuerpos se utilizaron a concentraciones y diluciones recomendadas por el fabricante (diluciones fueron de 1: 100 para los experimentos inmunomorfológico a 1: 10.000 para el análisis de Western blot).

Crecimiento Media, productos químicos, y citoquinas

medio de crecimiento (F-12 de Ham /medio de Eagle modificado de Dulbecco (50:50) que contiene 10% de suero de ternera fetal (FCS), ácido ascórbico /ml 25 mg, 50 IU /ml de estreptomicina, 50 UI /ml de penicilina, 2,5 mg /ml de anfotericina B, aminoácidos esenciales y L-glutamina) se obtuvo de Seromed (Munich, Alemania). La tripsina /EDTA (CE 3.4.21.4) se adquirió de Sigma. Epon se obtuvo de Plano (Marburg, Alemania). 5-FU se adquirió de Sigma (Munich, Alemania). La curcumina con una pureza mayor que 95% se adquirió de Indsaff (Punjab, India). Esta fuente comercial de la curcumina contiene tres componentes principales: diferuloylmethane (el componente más abundante y activa de la cúrcuma) (82%) y sus derivados demetoxicurcumina (15%) y bisdemetoxicurcumina (3%), denominadas conjuntamente las curcuminoides [24], [ ,,,0],28]. La curcumina se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) como una concentración de stock de 5,000 M y se almacenó a -80 ° C. Las diluciones en serie se prepararon en medio de cultivo. A mM de 5-FU 100 se preparó en DMSO absoluto y se almacenó a -20 ° C. Para el tratamiento, la solución de 5-FU se diluyó en DMEM /F12 y se añade a los cultivos para lograr la concentración deseada. La concentración final de DMSO fue de menos de 1% de tratamiento de drogas. Después de cultivar las células a 70-80% de confluencia, fueron tratados con 5-FU, la curcumina o su combinación (en cada caso del tratamiento de combinación, las células fueron pretratadas primero con curcumina durante 12 h o los tiempos indicados y luego expuestos a 5-FU durante 24 h o los tiempos indicados).

líneas celulares y cultivo celular

células cancerosas de colon humano HCT116 (tipo salvaje) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Múnich, Alemania). HCT116 + CH3, que se hizo MLH1-competente por la transfección estable del cromosoma 3 que soporta una copia de tipo salvaje del gen
hMLH1
se prepararon como se había descrito [21]. Se utilizaron las células HCT116 y HCT116 + CH3 para investigar la eficacia de la terapia combinada de 5-FU y la curcumina. Las células se mantuvieron en matraces de cultivo de tejido en DMEM /F12 (4,5 g /L de D-glucosa) suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico /antimicótico en un incubador humidificado a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire y 5% CO2. El medio se cambió cada tres días, y las células se pasaron usando tripsina /EDTA.

proliferación de las células de ensayo

El efecto de 5-FU, la curcumina y su combinación sobre la proliferación y viabilidad de HCT116 y células HCT116 + CH3 se determinó por el 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) método de captación como se describe anteriormente [29]. Brevemente, las células (2.500 por pocillo) fueron expuestas a diferentes concentraciones de 5-FU o la curcumina, cada uno por triplicado, en una placa de 96 pocillos para los períodos de tiempo indicados a 37 ° C para determinar los individuales IC
50 valores (crecimiento celular 50% las concentraciones inhibitorias). Además, en otro conjunto de experimentos, las células fueron pretratadas con curcumina 5 M durante 4 h y luego co-tratadas con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 y 5 mM) durante 24 h a determinar la dosis óptima para el tratamiento de combinación. Se añadió solución de MTT (5 mg /ml) a cada pocillo y la placa se incubó durante 2 horas a 37 ° C. Se añadió el tampón de lisis (20% de SDS y 50% de formamida de dimetilo), y las células se incubaron adicionalmente durante la noche a 37 ° C. La absorbancia de la suspensión de células se midió a 570 nm usando un lector de microplacas Revelación MultiScanner 96 pocillos (Dynex Technologies, Chantilly, VA). Los datos obtenidos se calcularon y se representan como porcentaje de supervivencia con respecto a los controles no tratados. El IC
50 se definió como la concentración de fármaco requerida para inhibir HCT116 o HCT116 + CH3 en un 50% respecto a los controles. IC
50 valores se estimó a partir de la curva dosis-respuesta. Los datos se derivan de al menos tres experimentos independientes. Este experimento se repitió 3 veces de forma independiente, y el análisis estadístico se llevó a cabo para obtener los valores finales.

DAPI de células apoptóticas

Para examinar los cambios apoptóticos en HCT116 y células HCT116 + CH3, DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol, Hoechst 33258) se realizó ensayo de tinción nuclear. Para cultivos en monocapa 1 × 10
6 células /placa se sembraron en discos de cultivo de tejidos de 35 mm. Después de 80 a 90% de confluencia, las células se trataron con diferentes concentraciones de la curcumina o 5-FU (0, 1, 5, 10 y 20 mM) o una combinación de la curcumina (5 M) y 5-FU (0,1, 1, 2 y 3 M), calculado a partir de las IC
50 valores, por 24 h. Después de la finalización del tratamiento las células se fijaron con metanol durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad. Las células fijadas se lavaron dos veces con PBS, y luego solución DAPI se extendió sobre las placas seguido de incubación durante 1 h a 4 ° C en la oscuridad. Las células marcadas se lavaron varias veces con PBS para eliminar el exceso de tinción DAPI y se evalúan bajo el microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania).

microscopía electrónica de transmisión (TEM): perfil
HCT116 y las células de cáncer de colon HCT116 + CH3 fueron tratados con curcumina (20 mM), 5-FU (5 mM) o una combinación de ambos (curcumina 5 M y 5-FU 1 M en HCT116, la curcumina 5 M y 5-FU 0,1 M en HCT116 + CH3) para 12 , 24, 36, 48, 60 y 72 h, respectivamente, para determinar el tiempo óptimo necesario para la inhibición del crecimiento celular del 50%. La microscopía electrónica se realizó como se describe anteriormente [30]. Brevemente, los cultivos se fijaron durante 1 h en fijador de Karnovsky seguido de post-fijación en 1% de O
so solución
4. Después de la deshidratación en una serie de alcoholes ascendente, los cultivos fueron embebidas en Epon y cortar ultradelgadas con un Reichert-Jung Ultracut E (Darmstadt, Alemania). Las secciones se contrastaron con una mezcla de 2% de citrato de acetato de uranilo /plomo y se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión (Zeiss, Jena, Alemania).

La cuantificación de la apoptosis la muerte celular
secciones
ultrafinos de la las muestras se prepararon y evaluaron con un microscopio electrónico (TEM 10; Zeiss). Para cuantificar las evaluaciones morfológicas y para definir el punto de tiempo en el que 50% de las células mostraron cambios mitocondriales (MC) y /o fueron apoptóticas, se determinó el número de células con características morfológicas de la muerte celular apoptótica incluyendo MC al anotar 100 células de 20 diferentes campos microscópicos.

Ciclo celular Análisis por citometría de flujo

HCT116 células (1 × 10
6) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 60 mm y después de aproximadamente 80% de células confluencia eran tratados con curcumina 20 M, 5 M 5-FU, o su combinación (5 M curcumina y 1 M 5-FU) para 12 y 24 h. En un experimento separado, las células HCT116 + CH3 fueron tratados con curcumina 5 M, 1 M 5-FU, o su combinación (curcumina 5 M y 0,1 M 5-FU) para 12 y 24 h. Después del tratamiento, las células se fijaron usando hielo frío de etanol al 70%, se lavó 2 veces con PBS y después se resuspendieron con yoduro de propidio (10 g /ml) y ribonucleasa A (0,1%) en PBS durante 30 min. Las células se incubaron durante 30 min en la oscuridad a temperatura ambiente. eventos fluorescentes de complejos de yoduro de propidio de ADN se cuantificaron después de la excitación con láser del colorante fluorescente de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) (Becton Dickinson, CA) con un recuento de células de 10.000 células por muestra. Finalmente, el contenido de ADN de las células en diferentes fases del ciclo celular se determinó mediante el uso de la célula Quest Software (Becton Dickinson). Los experimentos y análisis se realizaron por triplicado.

Preparación de extractos nucleares y citoplasmáticos para evaluar la translocación de NF-kB

Los extractos nucleares se prepararon como se describe anteriormente [31]. Brevemente, las células se suspendieron en 400 l de tampón de lisis hipotónico que contiene inhibidores de la proteasa de 20 min. Las células se lisaron entonces con 12,5 l de 10% Nonidet P-40. El homogeneizado se centrifugó durante 1,5 minutos, y el sobrenadante (extractos citoplasmáticos) se almacenó congelado a -70 ° C. A continuación, se añadieron 25 l de tampón de extracción nuclear enfriado con hielo a los gránulos y se incubaron durante 30 minutos con mezclado intermitente. Los extractos se centrifugaron y el sobrenadante (extractos nucleares) transfirieron a tubos enfriados previamente para el almacenamiento a -70 ° C.

El aislamiento de extractos mitocondriales para la detección de la liberación de citocromo c-

Las células se lavaron en 1 ml de PBS enfriado en hielo y se colocan en tampón enfriado con hielo aislamiento mitocondrias (0,25 M de sacarosa, EDTA 0,2 mM, y 10 mM Tris-HCl, pH 7,8) durante 30 min, seguido de homogeneización utilizando un homogeneizador de vidrio pre-enfriado. Los lisados ​​celulares se centrifugaron a 1000 g durante 15 min a 4 ° C y el sobrenadante se centrifugó a 12.000 g durante 15 min a 4 ° C. mitocondrias aisladas se resuspendieron en tampón de aislamiento mitocondrias que contiene inhibidores de la proteasa (5 mg /ml de leupeptina, 5 mg /ml de pepstatina, 10 mg /ml de aprotinina, PMSF 1 mM, DTT 1 mM, ortovanadato de sodio 100 mM, fluoruro de sodio 10 mM, y 10 mM de óxido de fenilarsina).

análisis de transferencia Western

Para determinar los efectos de la curcumina, 5-FU o curcumina /5-FU en el HCT116 y las células HCT116 + CH3, lisados ​​de células enteras, citoplasmática , se prepararon extractos nucleares y mitocondriales de cultivos en monocapa y fraccionaron por SDS-PAGE [29], [32]. La concentración de proteína total de los extractos celulares se determinó utilizando el sistema de ensayo bicinconínico ácido (Uptima; Interchim, Montluçon, Francia), utilizando BSA como estándar. Las cantidades iguales de proteína (500 ng por carril) de proteínas totales se separaron por SDS-PAGE (5%, 7,5%, 12% de geles) en condiciones reductoras.

Inmune ensayo de quinasa complejo

Inmune ensayo de quinasa complejo se realizó como se ha descrito previamente en detalle [33]. En pocas palabras, para probar el efecto de la curcumina y el inhibidor de PI-3K (wortmanina) sobre la activación de IKK inducida por 5-FU, se realizaron ensayos de quinasa del complejo inmune. El complejo IKK se inmunoprecipitó a partir de lisados ​​de células enteras con anticuerpos contra IKK-α y IKK-β y posteriormente se incubaron con perlas /G-agarosa de proteína A (Pierce, Alemania). Después de 2 h de incubación, las perlas se lavaron con tampón de lisis y se resuspenden en una solución de ensayo de quinasa que contiene HEPES 50 mM (pH 7,4), MgCl2 20 mM, ditiotreitol 2 mM, 10 mM ATP no marcado y 2 mg de IKK sustrato GST-I? B? ( aminoácidos 1 a 54) y se incubó a 30 ° C durante 30 min. Esto fue seguido por ebullición en tampón de muestra SDS-PAGE durante 5 min. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras como se describió anteriormente. La fosforilación de GST-I? B? Se evaluó utilizando un anticuerpo específico contra la I? B? Fosfo-específico (Ser 32/36). Para demostrar las cantidades totales de IKK-α y IKK-β en cada muestra, las proteínas de células enteras se separaron usando SDS-PAGE en condiciones reductoras como se describió anteriormente. La detección de IKK-α e IKK-β se realizó mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-ya sea IKK-alfa o anti-IKK-β.

El análisis estadístico

Los datos numéricos se expresan como valores medios ( +/- SD) para un experimento representativo realizado por triplicado. Las medias se compararon mediante la prueba t de Student suponiendo varianzas iguales. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor de p fue inferior a 0,05.

Resultados

Este estudio fue diseñado para investigar cómo la curcumina inhibe la proliferación de células CRC y potencia los efectos de la agente quimioterapéutico 5-FU en una
in vitro de las células
modelo CRC humanos. Además, se analizó el mecanismo (s) por el cual la curcumina aumenta los efectos antiproliferativos de 5-FU, especialmente en relación con los efectos sobre la NF-kappa B y la activación de Src, productos de los genes regulados por NF-kappa B, y el crecimiento celular en las células de CRC. Se utilizaron dos células humanas (CRC HCT116 y HCT116 + CH3) en esta investigación.

La curcumina sensibiliza las células HCT116 y de cáncer de colon HCT116 + CH3 a 5-FU-tratamiento que conduce a disminución de la viabilidad y la proliferación

Los efectos de 5-FU y /o la curcumina sobre la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT en HCT116 y células HCT116 + CH3 (Fig. 1). Sobre la base de estas mediciones, se determinó la IC
50 valores (de crecimiento de células 50% las concentraciones inhibitorias) para el individuo y fármacos combinados en HCT116 y la viabilidad celular del cáncer de colon HCT116 + CH3. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de la curcumina o 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 y 80 mM) y la viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT como se describe en Materiales y Métodos (Fig 1A & amp;. 1C ). El IC individuo
50 de la curcumina y 5-FU eran aproximadamente 20 mM y 5 mM en células HCT116 y 5 M y 1 M en células HCT116 + CH3, respectivamente (
p & lt; 0,05
). Estos resultados sugieren que la curcumina y 5-FU tienen efectos antiproliferativos potentes en células CRC y que estos efectos son más pronunciados en HCT116 + CH3 que en las células HCT116

A:. HCT116 células fueron tratadas con diferentes concentraciones de curcumina o 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 y 80 mM) durante 24 h y la viabilidad celular se midió utilizando el método MTT. Las concentraciones de curcumina y 5-FU resulta en la inhibición del crecimiento del 50% se indican como individuo IC
50 valores. B: células HCT116 se trataron previamente con curcumina (5 M durante 4 h), a continuación, se expone a 5-FU en diferentes concentraciones (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 y 5 M) para 24 h y se evaluó mediante el ensayo de MTT. IC
50 para 5-FU en el tratamiento de combinación se determinó a la inhibición del crecimiento 50% de las células HCT116. Los mismos experimentos se muestra en (A) y (B) se realizaron en células HCT116 + CH3. IC
50 valores para una sola (C) y el tratamiento de combinación (D) se calcularon sobre la base de mediciones de MTT. Los resultados se proporcionan como valores medios con desviaciones estándar de al menos tres experimentos independientes. Los valores se compararon con el control y los valores estadísticamente significativos con p & lt;. 0.05

Para examinar el efecto de un tratamiento combinado de la curcumina y 5-FU, HCT116 o células HCT116 + CH3 fueron pretratados con 5 micras curcumina para 4 h y luego co-tratado con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 y 5 mM) durante 24 h (Fig 1B & amp;. 1D). MTT ensayo se llevó a cabo y se determinaron IC
50 valores. Curiosamente, el pretratamiento con 5 curcumina mu M redujo IC
50 valores para 5-FU a 1 M en HCT116 y 0,1 M en HCT116 + CH3 (
p & lt; 0,05)
células. Estos resultados indican que las células tratadas previamente con la curcumina fueron más sensibles a 5-FU de las células tratadas con 5-FU solo y la introducción del cromosoma 3 en las células HCT116 mostraron un aumento de la sensibilidad de las células al tratamiento con 5-FU y /o curcumina en comparación con el tipo salvaje HCT116.

el efecto de la combinación de la curcumina y 5-FU en la apoptosis en células HCT116 y HCT116 + CH3

para determinar si el efecto inhibidor de la curcumina y 5-FU en la viabilidad celular y el crecimiento celular se relaciona con la inducción de la apoptosis, HCT116 y células HCT116 + CH3 se tiñeron con Hoechst 33258 (DAPI). Este método de tinción basada en fluorescencia revela cuerpos apoptóticos que contienen la fragmentación nuclear y la condensación de la cromatina en las células apoptóticas. células HCT116 y HCT116 + CH3 fueron expuestas a diferentes concentraciones de la curcumina o 5-FU (0, 1, 5, 10 y 20 mM) o a una combinación de la curcumina (5 M) y 5-FU (0,1, 1, 2 y 3 M). Las concentraciones aplicadas se calcularon a partir del IC 50 valores
de la curcumina y 5-FU determinado por ensayos de MTT. Como se muestra en la Fig. 2, el número de núcleos apoptóticos se incrementó notablemente en las células del grupo de tratamiento de combinación. Esto confirmó los resultados en la Fig. 1B & amp; 1D y reveló que la curcumina sensibiliza a las células de cáncer de colon HCT116 a la apoptosis inducida por 5-FU. Además, la restauración de la actividad hMLH1 en las células HCT116, mediante la introducción del cromosoma 3, se asoció con un aumento de la sensibilidad a 5-FU y la apoptosis inducida por 5-FU.

HCT116 y células HCT116 + CH3 fueron tratados con diferentes concentraciones de la curcumina o 5-FU (0, 1, 5, 10 y 20 mM) o una combinación de curcumina (5 M) y 5-FU (0,1, 1, 2 y 3 mM) durante 24 h. Los cultivos monocapa se tiñeron con Hoechst 33258 (DAPI) para revelar cambios apoptóticos en los núcleos de las células.

La curcumina aumenta cambios mitocondriales inducidas por 5-FU y la apoptosis en células HCT116 y HCT116 + CH3

Como se muestra en la Fig. 3, células de cáncer de colon HCT116 se trataron con la curcumina (20 mM), 5-FU (5 mM) o una combinación de ambos (curcumina 5 M y 5-FU 1 M) para 12, 24, 36, 48, 60 y 72 h, respectivamente. La viabilidad y cambios morfológicos de las células se determinaron por examen ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión. HCT116 células de cáncer de colon en los cultivos de control mostraron una morfología redondeada /esférica con pequeñas prolongaciones citoplasmáticas, núcleos grandes (en su mayoría euchromatic) con nucleolos distinto y un citoplasma bien organizada durante toda la duración del tratamiento (Fig 3, Control:. A-F). El tratamiento de las culturas HCT116 con curcumina o 5-FU solo hasta 36 horas dio lugar a cambios degenerativos, tales como la aparición de múltiples vacuolas, hinchazón de las mitocondrias y RE rugoso y degeneración de otros orgánulos celulares (Fig. 3, 5-FU, Cur :C.A). períodos de incubación más largos con la curcumina o 5-FU (60 y 72 horas) resultaron en la degeneración más celular. Esto incluye áreas de heterocromatina condensada en los núcleos de las células y múltiples, vacuolas citoplasmáticas autofágicas; las células se convirtieron en apoptótica (Figura 3, 5-FU:. F, Cur: E-F). El pretratamiento de cultivos de HCT116 con curcumina (5 M) durante 4 h, seguido de co-tratamiento con 5-FU (1 M) durante el mismo período de tiempo reveló un efecto fuerte. Amplias características morfológicas degenerativas, hinchazón mitocondrial y la apoptosis se han encontrado ya a los 36 h en células HCT116 y continuaron acumulando hasta 72 h (Figura 3, Cur + 5-FU HCT116:. C). En comparación con las células HCT116, los exámenes se realizaron en las células HCT116 + CH3 tratados con una combinación de la curcumina 5 M y 0,1 M 5-FU. Aquí, estos efectos fueron aún más prominente y ya se detectaron las células apoptóticas después de 12 horas de tratamiento (Fig 3, Cur + 5-FU HCT116 + CH3:. A). Estos resultados confirmaron que la sensibilidad a 5-FU fue reforzada por el tratamiento previo con la curcumina y que esto se agrava en las células HCT116 + CH3.

células HCT116 se trataron con la curcumina (20 mM), 5-FU (5 M) o una combinación de ambos (curcumina 5 M y 1 M 5-FU) para 12, 24, 36, 48, 60 y 72 h. El uso de un enfoque de diferentes células HCT116 + CH3 fueron tratados con una combinación de curcumina 5 M y 0,1 M 5-FU para 12, 24, 36, 48, 60 y 72 h. Ultrathin secciones fueron preparadas y evaluadas por microscopía electrónica de transmisión. Las micrografías muestran son representativos de todos los cultivos evaluados. En el momento más temprano cuando la apoptosis se detectó por primera vez imágenes son resaltados flechas. se muestran los cambios mitocondriales (puntas de flecha). Ampliación: x5000, bar = 1 m

La cuantificación y evaluación estadística de los datos ultraestructurales destacan claramente los efectos dependientes del tiempo de la curcumina y /o tratamiento con 5-FU en los cambios mitocondriales (MC) y la apoptosis. en HCT116 y células HCT116 + CH3. Como se muestra en la Fig. 4A & amp; B, más de 50% de las células expuestas MC o características de apoptosis a las 24 h de tiempo de incubación en los experimentos de combinación con las células HCT116 y a las 12 h en los experimentos de combinación con células HCT116 + CH3 (
p & lt;
0.05) . De nuevo, esto sugiere que la curcumina sensibiliza y HCT116 células HCT116 + CH3 a la apoptosis inducida por 5-FU. Los resultados indican que se requiere una cantidad muy baja de 5-FU (0,1 M) para suprimir la viabilidad celular cuando se combina con una dosis moderada de la curcumina (5 M). Además, estos resultados confirman que la introducción del cromosoma 3 en las células HCT116 aumenta significativamente la sensibilidad de las células al tratamiento con 5-FU y /o curcumina en comparación con las células HCT116.

Para cuantificar los resultados ultraestructurales, HCT116 (a) y HCT116 + CH3 (B) cultivos tratados como se describe en la Fig. 3 se examinaron los cambios apoptóticos y mitocondrial (MC) contando 100 células en 20 campos microscópicos. El examen se realizó por triplicado y los resultados se proporcionan como valores medios con SD desviaciones estándar (
p Hotel & lt; 0,05). Partir de tres experimentos independientes

Efectos de la curcumina y /o 5-FU en el ciclo celular y la apoptosis en células HCT116 y HCT116 + CH3

Para examinar los mecanismos por los que la curcumina y /o 5-FU inhiben la proliferación de células HCT116 y HCT116 + CH3, que examinó y comparó su efecto sobre la tasa de inhibición del crecimiento y los niveles de apoptosis. Por lo tanto, se determinó el comportamiento de estas dos células de CRC en las diversas fases del ciclo celular mediante análisis de citometría de flujo (Fig. 5A /B). células HCT116 se trataron con curcumina 20 M o 5 M 5-FU o su combinación (5 M curcumina y 1 M 5-FU) para 12 y 24 h. En un experimento independiente, las células HCT116 + CH3 fueron tratados con curcumina 5 M o 1 M 5-FU o su combinación (5 M curcumina y 0,1 M 5-FU) para 12 y 24 h. se recogieron las células tratadas y se procesaron para análisis de citometría de flujo. El efecto más significativo tanto en el tratamiento individual y combinado fue una reducción en tiempo y dependiente de la concentración de células en la fase G1 y la acumulación de células en la fase S del ciclo celular. Este efecto fue aún más pronunciado en las células HCT116 + CH3 que en las células HCT116. Después de 12 h de tratamiento, que fue el momento más temprano que examinamos, los efectos de la curcumina y /o 5-FU en el ciclo celular ya estaban muy distinta. Además de los cambios en G1 y la distribución de la fase S, el número de células en proceso de apoptosis se eleva notablemente con el tratamiento. Curiosamente, los efectos de la combinación de tratamiento excedieron claramente los de los tratamientos individuales. En 24 h de tratamiento, la influencia sobre el ciclo celular se convirtió en general más pronunciado en las células de cáncer de colon, pero fue incluso más evidente en las células HCT116 + CH3 que en las células HCT116. Como se muestra en la Fig. Como se muestra en la Fig.

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