Extracto
Antecedentes
La curcumina inhibe el crecimiento de líneas celulares de cáncer de esófago; sin embargo, el mecanismo de acción no se entiende bien. Cada vez es más claro que la activación aberrante de la señalización de Notch se ha asociado con el desarrollo de cáncer de esófago. Aquí, hemos determinado que la curcumina inhibe el crecimiento del cáncer de esófago a través de un mecanismo mediado a través de la vía de señalización Notch.
Metodología /Principales conclusiones
En este estudio, mostramos que la curcumina tratamiento dio lugar a una dosis y la inhibición dependiente del tiempo de la formación de la proliferación y la colonia en líneas celulares de cáncer de esófago. apoptosis Además, el tratamiento curcumina inducida a través de la activación de caspasa 3, confirmado por un aumento en la relación de Bax a Bcl2. Análisis del ciclo celular demostró que el tratamiento con curcumina inducida por la muerte celular y los niveles de ciclina D1 abajo regulados. tratamiento de cúrcuma también resultó en número y tamaño de esophagospheres reducida. Además, el tratamiento curcumina condujo a la reducción de la activación de Notch-1, la expresión de Jagged-1 y su objetivo aguas abajo Hes-1. Esta reducción de la activación de Notch-1 se determinó que era debido a la baja regulación de los componentes fundamentales de las proteínas del complejo gamma-secretasa como la presenilina 1 y Nicastrin. La combinación de un inhibidor conocido DAPT γ-secretasa y la curcumina disminuyó aún más la proliferación y la apoptosis inducida en células de cáncer de esófago. Por último, el tratamiento de curcumina disminuye la expresión de Notch-1 específica microARN miR-21 y miR-34a y regulada por incremento supresor de tumores let-7a miARN.
Conclusión /Importancia
La curcumina es un potente inhibidor del crecimiento del cáncer de esófago que se dirige a los Notch-1 de activación proteínas complejas gamma-secretasa. Estos datos sugieren que la inhibición de la señalización Notch es un nuevo mecanismo de acción de la curcumina durante la intervención terapéutica en el cáncer de esófago
Visto:. Subramaniam D, Ponnurangam S, Ramamoorthy P, D Permanente, Battafarano RJ, Anant S, et al . (2012) La curcumina induce la muerte celular en células de cáncer de esófago través de la modulación de señalización Notch. PLoS ONE 7 (2): e30590. doi: 10.1371 /journal.pone.0030590
Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: Octubre 31, 2011; Aceptado: 19 de diciembre de 2011; Publicado: 17 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Subramaniam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de esófago es el octavo cáncer incidente más común en el mundo y el sexto lugar en la mortalidad por cáncer [1]. En los Estados Unidos, 4-10 en 100.000 personas sucumben a la enfermedad por año y la incidencia global de la enfermedad es mayor en los hombres mayores de 50 años de edad [2]. La Sociedad Americana del Cáncer (ACS) estima que en 2011, 16.980 estadounidenses (13.450 hombres y 3.530 mujeres) sería diagnosticado con cáncer de esófago. La ACS también estima que la mayoría de estas personas [14, 710 estadounidenses (11.910 hombres y 2.800 mujeres)] moriría de cáncer de esófago en 2011 [3]. El adenocarcinoma de esófago, la principal forma de cáncer de esófago en los EE.UU., es el cáncer más rápido aumento en el mundo occidental. En general se diagnostica en una etapa avanzada y tiene un mal pronóstico, con una supervivencia a los 5 años de menos del 10%. Aunque el tratamiento actual incluye la quimioterapia, terapia de radiación, y, si es posible, la resección esofagogástrica, muchos pacientes con esófago experiencia adenocarcinoma progresión de la enfermedad a pesar de dicho tratamiento, lo que sugiere que estos tumores son resistentes a la terapia estándar.
Debido a que las terapias convencionales , incluyendo la resección quirúrgica, quimioterapia y radiación a menudo son inadecuados para el tratamiento de esta enfermedad, se necesitan con urgencia nuevas opciones de tratamiento. A pesar de la aparición de nuevos agentes dirigidos y el uso de diversas combinaciones terapéuticas, no hay opciones de tratamiento disponibles que son curativa en pacientes con cáncer avanzado. La magnitud de este problema exige la necesidad de nuevos agentes terapéuticos, específicamente el uso de agentes para la quimioprevención. Esto es más atractivo para el adenocarcinoma de esófago desde una condición pre-maligna del esófago de Barrett es una lesión bien reconocida.
La curcumina, un pigmento fito-polifenólico derivado de la cúrcuma (
Curcuma longa
), se ha demostrado que tiene múltiples efectos contra el cáncer, incluyendo la inhibición de la proliferación, la inducción de apoptosis, inhibición de la angiogénesis, y la inhibición de la ADN topoisomerasa II [4]. La curcumina también induce la apoptosis independiente de muerte tales como la autofagia en las células de cáncer de esófago [5]. Estudios recientes han demostrado que la curcumina promueve la apoptosis, aumenta la quimiosensibilidad, e inhibe NF-kB en el adenocarcinoma esofágico [6] [7].
señalización Notch desempeña un papel crítico en el desarrollo y la homeostasis de los tejidos mediante la regulación por células las decisiones del destino, la proliferación, diferenciación y apoptosis. vía de señalización Notch está implicada en células madre de auto-renovación, la determinación la celda de destino, la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [8]. la señalización de Notch está regulada positivamente en los cánceres de esófago y se ha propuesto como una diana terapéutica para los cánceres de esófago [9] [10]. la señalización de Notch se inicia cuando un ligando muesca interactúa con un receptor Notch transmembrana en un células adyacentes [11] [12]. Este proceso por lo general inicia la γ-secretasa liberación proteolítica mediada por el dominio intracelular Notch (NICD), que, a su vez, se transloca en el núcleo de las células [13]. El NICD en el núcleo interactúa con la unión promotor-factor-1 de (CBF1) cofactor transcripcional C y transactiva los genes diana, tales como los que están en el potenciador cabelludo y de división (HES) y Hes relacionados con motivo YRPW (Hey) familias [ ,,,0],12] [14]. Estudios recientes han demostrado una relación entre la curcumina, Notch y NF-kB. Notch-1 vía de señalización se ha demostrado directamente para ser activado por NF-kB en las células de cáncer oral [15]. Por otra parte, la inhibición curcumina mediada por la activación de Notch-1 también condujo a la regulación a la baja de NF-kappa B y sus genes diana, incluyendo Bcl-2, ciclina D1, factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), y metaloproteinasa de la matriz -9 (MMP-9 ) en células de carcinoma de células escamosas orales [4].
los microARN (miRNA) son los ARN no codificantes cortos que se unen a la región no traducida 3 '(UTR) de los ARN mensajeros afines (ARNm) a través totalmente complementarias o imperfecto apareamiento de bases reprimir la traducción o la disminución de la estabilidad de los ARNm unidos [16]. Algunos miRNAs son reportados como oncomiRs que podría funcionar como oncogenes o supresores tumorales [17]. Por ejemplo, miR-21 disminuye supresor de tumor expresión Pdcd4 y promueve la invasión, intravasación y la metástasis en el cáncer de colon [18]. La regulación positiva de miR-21 se asocia fuertemente a la vez una alta Ki-67 índice de proliferación y la presencia de metástasis en el hígado [19]. miR-21 también regulada vía PTEN dependiente y el crecimiento celular afectada, la migración y la invasión de carcinoma hepatocelular [20]. Recientemente, hemos demostrado miRNAs como biomarcadores para la progresión de esófago de Barrett. miR-21 está regulada positivamente 12,57 veces en el cáncer de esófago [21]. Otra importante miRNA es miR-34, que se ha encontrado para participar en la regulación de p53 y Notch vías consistentes con actividad supresora de tumores [22]. Un estudio reciente demostró que existe una estrecha relación entre miARN y Notch vías de señalización en el desarrollo y progresión del tumor [23]. Por otra parte, la señalización de Notch y sus regulaciones son muy importantes a nivel de post-transcripcional y /o la regulación de traducción de los genes de miRNAs en el glioblastoma [24]. Por otro lado, let-7a disminuye la proliferación celular y la migración de glioblastoma y reduce el tamaño del tumor en el modelo de xenoinjerto [25].
En este artículo, se ha determinado el efecto de la curcumina en células de cáncer de esófago y el mecanismo mediadas a través de la vía de señalización Notch.
Materiales y Métodos
células y Reactivos
TE-7, TE-10 son humanos y eSO-1 es células de cáncer de adenocarcinoma de esófago de ratones que eran proporcionado amablemente por el Dr. Richard J. Battafarano, Universidad de Maryland y se cultivaron en RPMI 1640 que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y solución de antibiótico-antimicótico al 1% (Mediatech Inc, Manassas, VA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. La curcumina se adquirió de LKT Laboratories, St. Paul, MN. N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanil] -S-fenilglicina éster t-butílico (DAPT) se adquirió (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Proliferación y ensayos de apoptosis
para evaluar la proliferación, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos y se cultivan durante la noche. A continuación, las células se trataron con dosis crecientes de la curcumina en 10% de FBS que contiene RPMI 1640. Análisis de la proliferación celular se realizó mediante ensayo enzimático como se describe [26]. Para la apoptosis, se midió la caspasa 3/7 actividad usando el Apo-homogéneo caspasa-3/7 kit de ensayo (Promega, Madison, WI).
Colonia ensayo de formación de
Brevemente, 6 así platos se sembraron con 500 células viables y se dejaron crecer durante 24 h. Las células fueron incubadas en presencia o ausencia de la curcumina 30 M durante 24 h. A continuación se retiró la curcumina que contiene el medio, y se lavaron las células en PBS y se incubó durante una 10 d adicional en medio completo. Cada tratamiento se realizó por triplicado. Las colonias obtenidas se lavaron con PBS y se fijaron en formalina al 10% durante 10 min a temperatura ambiente y después se lavaron con PBS seguido por tinción con cristal violeta. Las colonias se contaron y se compararon con células no tratadas.
análisis del ciclo celular
Las células se trataron con 30 mM de la curcumina para 12 y 24 h, a continuación se trataron con tripsina y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (células PBS). una sola célula suspensiones fueron fijadas usando 70% de etanol durante 2 h, y posteriormente se permeabilizaron con PBS que contenía 1 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich), 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) y 2 RNasa g de DNasa libre de (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente. La citometría de flujo se realizó con un analizador FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain, View, CA), la captura de 10.000 eventos en cada muestra. Los resultados se analizaron con el software ModFit LT ™ (Verity Software House, Topsham, ME).
Análisis de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real con transcripción inversa
ARN total aislado de TE-7 células usando el reactivo TRIZOL transcrito fue inversa con Superscript II de la transcriptasa inversa en presencia de cebadores de hexanucleótidos aleatorios (todos de Invitrogen, Carlsbad, CA). ADN complementarios fueron utilizados para PCR en tiempo real utilizando Taq ADN polimerasa Jumpstart (Sigma-Aldrich) y SYBR Green colorante de ácidos nucleicos (Molecular Probes, Eugene, OR). Cruce de valores umbral para los distintos genes se normalizaron a ß-actina. Los cambios en la expresión de mRNA se expresaron como factor de cambio con respecto al control. Los cebadores utilizados en este estudio fueron los siguientes: β-actina: 5'-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 'y 5'-ATCATTCTCCTCCTCAGCG-3'; Ciclina D1: 5'-AATGACCCCGCACGATTTC-3 'y 5'-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3'; Notch-1: 5'-CACTGTGGGCGGGTCC-3 'y 5'-GTTGTATTGGTTCGGCACCAT-3'; Hes-1 5'-AGGCGGACATTCTGGAAATG-3 'y 5'-CGGTACTTCCCCAGCACACTT-3'; Presenilina-1 5 'ATCATGCTCTTTGTCC-3' y 5'-TCTTCTGTGAATGGG-3 '; Nicastrin 5'-CAGATTGGCTGCCAGT-3 'y 5'-CTCCAGCAGAACCAT-3'.
análisis de miARN
Total miARN se aisló utilizando el kit de aislamiento mirVana ™ miARN (Ambion Inc, Grand Island, NY) . Total miRNA aislado de TE-7 células se sometieron a transcripción inversa con superíndice ™ II RNasa H-Reverse Transcriptase y cebadores de hexanucleótidos aleatorios (Invitrogen). El cDNA se utilizó después para realizar la PCR en tiempo real por la química SYBR (SYBR Green I; Molecular Probes) para primaria
let-7a Versión taquigráfica utilizando cebadores específicos y Taq ADN polimerasa Jumpstart (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO). El valor de cruce del umbral evaluados por PCR en tiempo real se caracteriza por
pri-let-7a
miARN y se normalizó con
U6
pri-miARN. Los cambios en la pri-miARN se expresaron como factor de cambio en relación al control con el valor ± SEM. Los cebadores utilizados son:
pri-U6
: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 'y 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3',
pri-let-7a
: 5'-GAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAA-3 ', 5'-AAAGCTAGGAGGCTGTACA-3 '. Pri-miR-34 un 5'-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3 'y 5'-GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT-3', pri-miR-21:. GCTTATCAGACTGATGTTGACTG 5'-3 'y 5'-CAGCCCATCGACTGGTG-3'
Análisis de transferencia Western
Los lisados celulares se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y se transfirieron a membranas Immobilon-P de difluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). Notch-1, caspasa 3, los anticuerpos Bcl2 y Bax se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Ciclina D1, Notch-1, Jagged-1, Hes-1 y anticuerpos de actina se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA). Presenilina 1, 2, anticuerpos Nicastrin, APH1 y pen2 de GenScript Inc. (Piscataway, NJ) y proteínas específicas fueron detectados por el sistema de quimioluminiscencia (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
ensayo esferoide
Para la formación de esferoides, las células se cultivaron en RPMI 1640 (Mediatech) suplementado con 20 ng /ml de bFGF (Invitrogen) 10 ml por 500 ml de 50x B27 suplemento (Invitrogen) EGF 20 ng /ml (Invitrogen) y los antibióticos y antimicóticos solución. Las células se sembraron a baja densidad (5000 células /ml) en placas de 6 de adhesión bien bajos. Las células se trataron con concentraciones crecientes de la curcumina (0-50 mM). Después de 7 días se fotografiaron los esferoides.
inmunofluorescencia tinción
Las células se cultivaron durante la noche en cubreobjetos en placas de seis pocillos. Después del tratamiento con 30 M de curcumina durante 24 h, las células fueron fijadas con paraformaldehído durante 15 minutos, se enjuagaron con PBS, y se incubaron con 2% de albúmina de suero bovino en PBS durante 30 min. Las células fueron incubadas durante la noche con anti-Notch-1, anti-Jagged-1, anti-Hes-1, anti-presenilina 1 y anti-Nicastrin anticuerpo, respectivamente. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anticuerpo secundario-3 conjugado con Cy durante 30 min y se lavaron con PBS. No se observaron imágenes de células bajo un microscopio de fluorescencia.
El análisis estadístico
Todos los valores se expresan como la media ± SEM. Los datos se analizaron utilizando una prueba t de 2 colas no apareada.
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La curcumina inhibe el crecimiento de células de cáncer de esófago
Se determinó el efecto de la curcumina en el esófago proliferación de células cancerosas en una variedad de líneas de células cultivadas (TE-7, TE-10 y ESO-1). La curcumina suprimió significativamente la proliferación de líneas celulares de cáncer de esófago TE-7, TE-10 y ESO-1 en la dosis y manera dependiente del tiempo. Este efecto anti-proliferación de las células tumorales fue visto dentro de un periodo de 24 h, y que siguió aumentando significativamente en los próximos 72 h (Figura 1A). Para determinar el efecto a largo plazo del tratamiento de curcumina, las células se trataron con 30 mM curcumina durante 24 h, después de lo cual se dejó que las células de crecer en medios normal. tratamiento curcumina suprime la formación de colonias en todas las líneas celulares de cáncer de esófago (Figura 1B), lo que sugiere el efecto de que la curcumina sobre las células tumorales era irreversible. Ciclina D1 es una proteína reguladora del ciclo celular que regula la G1 a la transición de la fase S del ciclo celular y funciona como un cofactor para varios factores de transcripción en numerosas líneas celulares. Este ciclina forma un complejo con y funciona como subunidad reguladora de CDK4 o CDK6, cuya actividad es necesaria para la transición G1 /S. Ciclina D1 sobreexpresión se ha relacionado con el desarrollo y progresión del cáncer [27]. tratamiento curcumina inhibe la ciclina D1 mRNA y expresión de la proteína lo que sugiere que inhibe la proliferación de células cancerosas. Por otro lado, la expresión de la proteína p21 se incrementó (Figura 1C y D).
(A) La curcumina inhibe la proliferación de células de cáncer de esófago. Las células se incubaron con dosis crecientes de la curcumina (0-50 mM) para un máximo de 72 h y se analizaron para la proliferación celular. tratamiento curcumina resultó en una disminución de la dosis y dependiente del tiempo significativo en la proliferación celular en las tres células en comparación con controles no tratados. (B) La curcumina inhibe la formación de colonias. células de cáncer de esófago se incubaron con 30 M de curcumina durante 24 h y se dejaron crecer en colonias durante 10 días. La incubación con la curcumina inhibe la formación de colonias. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes. (C) La ciclina D1 es una proteína reguladora del ciclo celular y que está implicada en la detención del ciclo celular. ARN de TE-7 incubadas con 30 mM curcumina fue sometido a PCR en tiempo real para la ciclina D1 expresión de ARNm. tratamiento curcumina inhibe significativamente la ciclina D1 expresión mRNA (* p & lt; 0,05). (D) Los lisados de TE-7 incubadas con 30 mM curcumina se analizaron por Western blot para la ciclina D1 niveles de expresión utilizando anticuerpos anti-ciclina D1 ratón. el tratamiento de cúrcuma inhibe la expresión de la proteína ciclina D1.
curcumina induce la muerte celular por apoptosis
Teniendo en cuenta los efectos de la curcumina en la supresión de la proliferación y la formación de colonias, el próximo fin de determinar si la curcumina afecta ciclo celular progresión. El tratamiento con curcumina indujo significativamente la muerte celular de TE-7 células dentro de las 12 h y aumentó continuamente hasta 24 h (Figura 2A). Tales aumentos similares en la muerte celular se han observado en otros tipos de células [28]. La curcumina se sabe que inducen apoptosis en una variedad de células cancerosas. Las caspasas son una familia de proteínas conocidas para la ejecución de apoptosis. La caspasa-3 y caspasa-7 son moléculas efectoras de llave conocidas para inducir la apoptosis en una variedad de células cancerosas mediante la amplificación de la señal de caspasas iniciadoras, tales como la caspasa-8 o caspasa-10. se observó aumento de la activación del efector caspasa-3 y caspasa-7 dentro de las 24 horas en la línea celular TE-7 tratados con curcumina lo que sugiere la inducción de la apoptosis (Figura 2B). Western blot análisis de TE-7 lisados de células demostrado una disminución significativa en la procaspasa-3 en las células tumorales tratadas curcumina (Figura 2C). La confirmación adicional de que las células fueron sometidas a la apoptosis se obtuvo mediante análisis de Western blot para anti-apoptóticos Bcl2 y BclxL y proteínas Bax pro-apoptóticos. el tratamiento de cúrcuma inhibe la expresión de Bcl2 y BclxL y el aumento de los niveles de proteína Bax. Estos datos sugieren que la curcumina es un potente inductor de la apoptosis en células de cáncer de esófago (Figura 2D). Análisis del ciclo celular
(A) de las células tratadas con la curcumina. TE-7 células fueron tratadas con 30 mM de la curcumina para 12 y 24 h, se examinaron por citometría de flujo después de tinción con yoduro de propidio para el contenido de ADN. tratamiento curcumina conduce a un mayor número de células muertas. Los gráficos son representativos de los datos obtenidos de tres experimentos. (B) La curcumina induce la caspasa-3, un mediador de la apoptosis. TE-7 células se incubaron con 30 M de curcumina se analizaron para la apoptosis mediante caspasa-3 y 7-activación. tratamiento de cúrcuma aumentó el número de células que experimentan apoptosis en comparación con los controles no tratados (* p & lt; 0,05). (C) Los lisados de las células TE-7 incubadas con 30 M de curcumina se analizaron por transferencia de Western para la caspasa-3 niveles de proteínas utilizando anticuerpo de conejo anti-caspasa-3. La curcumina tratamiento produjo una disminución de la procaspasa-3. (D) Los lisados de las células TE-7 incubadas con 30 M de curcumina se analizaron por transferencia de Western de las proteínas Bcl2, BclxL, y Bax. La curcumina reduce la expresión de las proteínas anti-apoptóticas Bcl2 y BclxL, mientras que el aumento de expresión de proteínas pro-apoptóticas en las células tratadas en comparación con las células no tratadas.
inhibe la formación de la curcumina esophagosphere
Teniendo en cuenta que curcumina inhibe la formación de colonosphere en células de cáncer de colon y que afectan a las proteínas de la vía de señalización Notch. A continuación se determinó los efectos de la curcumina en la formación de esferoides de células de cáncer de esófago. tratamiento curcumina inhibió significativamente esophagosphere formación de una manera dependiente de la dosis tanto en las células TE-7 y TE-10 (Figura 3A). El tamaño esferoides, se contaron los números. tratamiento curcumina reduce tanto la formación de esferoides primaria y secundaria (Figura 3B y C)
.
células (A) TE-7 y TE se cultivaron en placas de baja adherentes y se tratan con concentraciones crecientes de la curcumina (0-50 mM) y realizado para el ensayo esferoide. Después de una semana, se fotografiaron los esferoides. (B) esferoide se contó y se realizó diagrama de barras. tratamiento curcumina inhibió significativamente esofágicas esferoides células cancerosas (* p & lt; 0,05). (C) Se recogieron los esferoides primarias y se separan en células individuales y se volvieron a sembrar. tratamiento de curcumina inhibió significativamente las células de cáncer de esófago esferoides secundarios (* p & lt; 0,05).
La curcumina inhibe la activación de Notch por la regulación negativa de la γ-secretasa
Notch-1 es una membrana celular asociada proteína. compromiso ligando hace que el dominio intracelular del receptor Notch transmembrana (NICD), que se escindió de la membrana a través de la acción del complejo γ-secretasa. NICD se transloca al núcleo, donde se asocia con una familia de proteínas de unión de ADN para activar la transcripción de genes diana Notch tales como cabelludo y potenciador de-split 1 (
Hes1
) [29]. Se determinó el efecto de la curcumina en Notch-1, su ligando escalonado-1 y Hes-1 en TE-7 células. tratamiento curcumina downregulated significativamente los niveles de proteína (Figura 4A y B) Notch-1 y su ligando proteínas diana Jagged-1 y aguas abajo Hes-1 tanto ARNm y. Los niveles de proteína se confirmó por tinción inmuno-fluorescencia, donde se observaron niveles significativamente más bajos de Notch-1 nuclear y citoplásmica Jagged-1 en las células tratadas curcumina (Figura 4C).
(A) en tiempo real de transcripción inversa análisis -PCR de RNA total de TE-7 células después de 30 M de tratamiento de cúrcuma durante 24 h mostró una reducción en la expresión de Notch-1, su ligando Jagged-1 y sus Hes-1 del gen diana de ARNm (* p & lt; 0,05). (B) lisados de tratamiento de cúrcuma causó una reducción significativa en la expresión de Notch-1 escindido, su ligando Jagged-1 y su gen diana Hes-1 los niveles de proteína en TE-7 células. (C) Las células TE-7 tratadas con 30 M de curcumina durante 24 h fueron sometidas a tinción inmuno-fluorescencia utilizando, anticuerpos anti-Jagged-1 y anti-Hes-1 anti-Notch-1. La curcumina tratamiento dio como resultado niveles más bajos de proteína Notch-1 en el núcleo y reduce Jagged-1 y Hes-1 de expresión en TE-7 células.
A continuación se determinó el mecanismo por el que la curcumina afecta Notch 1 de activación. γ-secretasa es un complejo multi-proteína que contiene una proteasa de escisión dentro de la membrana. El complejo dispone de una lista cada vez mayor de proteínas sustratos, incluyendo los receptores Notch. Los cuatro componentes del complejo γ-secretasa, presenilina 1, Nicastrin, Pen2 y APH1 están cree que son esenciales para la actividad [13] [30] [31]. El dominio catalítico reside dentro de presenilina, mientras Nicastrin ha sugerido que son críticos para el reconocimiento de sustrato [32]. La curcumina tratamiento dio lugar a baja regulación de la expresión de las proteínas del complejo gamma-secretasa, la presenilina 1 y 2, Nicastrin, APH1 y PEN2 (Figura 5 A, B y C). Estos datos sugieren que la curcumina mediada baja regulación de la vía de señalización Notch se produce en parte a través de la inhibición del complejo γ-secretasa
.
(A) reversa en tiempo real análisis de PCR con transcripción del ARN total de TE- 7 células siguientes 30 M de tratamiento de cúrcuma durante 24 h mostraron una reducción en la expresión de la presenilina 1 y mRNA Nicastrin (* p & lt; 0,05). (B) lisados de tratamiento de cúrcuma causó una reducción significativa en la expresión de proteínas del complejo gamma-secretasa Presenilin 1 y 2, Nicastrin, APH1 y los niveles de proteína en pen2 TE-7 células. (C) TE-7 Las células tratadas con 30 M de curcumina por 24 h se sometieron a tinción de inmuno-fluorescencia utilizando anti-presenilina 1 y los anticuerpos anti-nicastrin. La curcumina tratamiento dio como resultado niveles más bajos de la presenilina 1 y la expresión Nicastrin en TE-7cells.
Combinación de curcumina y un DAPT inhibidor del complejo γ-secretasa más afecta el crecimiento del cáncer de esófago
El tratamiento con combinación de curcumina y un inhibidor del complejo (GSI) DAPT γ-secretasa inhibe además proteínas Notch-1 objetivo Hes-1 y ciclina D1 expresión (Figura 6A). Se realizó combinación de curcumina con un DAPT inhibidor del complejo γ-secretasa en la proliferación y la apoptosis. Combinación de más curcumina y el tratamiento DAPT inhibe la proliferación e induce la apoptosis en TE-7 células (Figura 6B y C). Se observaron resultados similares en TE-10 células (datos no presentados).
células TE (A) tratados con DAPT (50 M) y la curcumina (30 mM) solo y en combinación para 24 h. Los lisados se analizaron mediante transferencia Western. proteínas HES-1 y la ciclina D1 se redujeron aún más con la combinación de los dos compuestos. (B) las células tratadas con TE DAPT (50 M) y la curcumina (30 mM) solo y en combinación para 48 h. La proliferación celular se inhibe de manera significativa tras el tratamiento con la combinación de DAPT y curcumina en comparación con cada curcumina sola usando el ensayo de enzima hexosaminidasa (*
P
& lt; 0,05). (C) La apoptosis se indujo significativamente después del tratamiento con la combinación de DAPT y curcumina en comparación con cada curcumina sola usando Apo-uno de la caspasa-3/7 kit de ensayo homogéneo (*
P
& lt; 0,05).
La curcumina inhibe oncomir miARN y aumenta supresor de tumores de miARN en células de cáncer de esófago
La curcumina altera la expresión de microARN en el colon [33] páncreas [34], de mama [35], la vejiga [36] y pulmón [37] las células cancerosas. Recientemente, hemos demostrado que miRNAs como biomarcadores para la progresión de esófago de Barrett y miR-21 está regulada positivamente 12,57 veces en el cáncer de esófago [21]. A continuación se determinó los efectos de la curcumina en células de cáncer de esófago oncomir miARN y miARN supresor de tumores. el tratamiento de cúrcuma significativamente regulada por la expresión de miR-21 y miR-34a, mientras que la regulación positiva de la expresión de miRNA let-7a (Figura 7A y B)
.
(A) inversa en tiempo real análisis de PCR de transcripción de los genes miARN total a partir de TE- 7 células siguientes 30 M de tratamiento de cúrcuma para 24 h. el tratamiento de cúrcuma inhibe significativamente la expresión de los genes miARN oncomiR en TE-7 células (*
P Hotel & lt; 0,05). (B) el tratamiento de cúrcuma significativamente hasta reguladas supresor de tumores let-7a miARN expresión en TE-7 células.
Discusión
El cáncer esofágico es una de las causas principales de sexto cáncer- muertes relacionadas en el mundo occidental. La incidencia global de la enfermedad es mayor en los hombres mayores de 50 años de edad [2]. El cáncer de esófago es generalmente diagnosticado en una etapa avanzada y tiene un mal pronóstico, con una supervivencia a los 5 años de menos del 10%. La morbilidad significativa, la toxicidad y las tasas de respuesta pobres de los regímenes de quimioterapia actuales han dado lugar a la búsqueda de terapias alternativas menos tóxicas. Nosotros y otros han demostrado que la curcumina suprime la proliferación e induce la apoptosis en una variedad de células tumorales, incluyendo páncreas, mama, colon, oral, pulmón, melanoma, mieloma, leucemia y carcinoma de próstata. Estudios anteriores han demostrado que la curcumina inhibe la proliferación y aumenta la apoptosis en células de cáncer de esófago [5] [6] [38] [39].
Los datos presentados en este artículo muestran que la curcumina inhibe selectivamente la proliferación de esófago células de cáncer, suprime la formación de colonias de células de cáncer de esófago, promueve la detención del ciclo celular y la apoptosis, inhibe la formación de esophagosphere, abajo regula la señalización de notch y sus proteínas complejas gamma-secretasa, y también inhibe la expresión de los genes miARN oncomir e induce la expresión supresor de tumores miRNA. Estos resultados se presentan más en el diagrama esquemático en la Figura 8. Los resultados muestran que la curcumina puede suprimir de manera efectiva la proliferación de células dentro de 24 h. Además, los efectos inhibidores sobre las células tumorales parecen estar sostenida e irreversible después de 24 h de tratamiento. Nuestros datos con la ciclina D1 es intrigante en que había una reducción de su expresión a las 24 h. Esto debería haber resultado en las células sometidas a detención G0-G1 ya que la proteína es responsable de la progresión a través de la transición de fase G0-G1 /S [40]. detención G0 /G1 curcumina inducida similares también se ha demostrado que se producen en otros tipos de células de cáncer, incluyendo cánceres de colon y gástricos, y en el linfoma de células del manto [28] [41]. De hecho, se observó un aumento significativo de células muertas en las células de cáncer de esófago, incluso a 12 h después de la incubación con la curcumina, que posteriormente se llevó a la muerte celular.
Nuestros estudios demuestran que la curcumina inhibe la expresión de Jagged-1 y el receptor Notch-1. La curcumina también inhibe proteínas complejas gamma-secretasa, inhibiendo de este modo la escisión del receptor Notch. Como resultado, el dominio intracelular Notch (NICD) no se libera y por lo tanto no trasladar al núcleo para activar la aguas abajo genes diana c-myc y ciclina D1. Esto resulta en la inhibición de la proliferación celular y de la regeneración de células madre, mientras que al mismo tiempo la inducción de la apoptosis.
En el presente estudio, también se encontró que la curcumina regula hacia abajo Notch señalización a través de la inhibición de la el complejo γ-secretasa. La curcumina inhibe Notch-1 y su ligando Jagged-1 en células de cáncer de esófago. También se encontró que la curcumina inhibe la expresión de la Notch-1 blanco de abajo
Hes-1 |. Recientemente, se ha informado de que la vía de Notch desempeña un papel crítico en los procesos de proliferación de células tumorales, la apoptosis y el vástago de mantenimiento celular y está estrechamente asociada con la tumorigénesis en células de cáncer de esófago [42]. Por lo tanto, la inhibición de crecimiento de células mediada por la curcumina podría estar mediado en parte a través de la inactivación de la actividad de Notch-1. Esto se confirmó adicionalmente mediante la combinación de un GSI y curcumina, más que inhibió la proliferación y la apoptosis inducida. Del mismo modo, la combinación de la curcumina con un GSI más inhibidos Hes-1 y ciclina D1 expresiones. Sin embargo, Notch-1 no es la única vía activa en el cáncer de esófago se activan como muchas otras vías celulares [7] [39]. Sería interesante determinar si la curcumina es igualmente potente en la inhibición de otras vías de transducción de señales. Además, sería interesante determinar si la expresión ectópica de Notch aguas abajo genes diana tales como Hes-1 y c-myc en la condición de caída Notch o de rescate protege de la muerte celular curcumina mediada.
señalización Notch se requiere para células madre auto-renovación y mantenimiento de la troncalidad [43].