Extracto
Objetivo
La interacción de las células del estroma del tumor y juega un papel dinámico en la iniciación y la mejora de la carcinogénesis. En este estudio, se investigó la diafonía entre el cáncer colorrectal células (CRC) con fibroblastos del estroma y los efectos anticancerígenos de la curcumina y 5-fluorouracilo (5-FU), especialmente en el cáncer de células madre de supervivencia (CSC) en un 3D-co -cultura modelo que imita
in vivo
microambiente tumoral.
Métodos
colon HCT116 carcinoma de células y fibroblastos MRC-5 se co-cultivan en un microambiente tumoral monocapa o alta densidad modelo de
in vitro
con /sin la curcumina y /o 5-FU.
resultados
monocapa microambiente tumoral co-cultivos intensivos apoyados diafonía entre las células cancerosas y los fibroblastos y optimizada de hasta -Regulación de moléculas activas metastásicos de adhesión (β1-integrina, ICAM-1), de crecimiento transformante moléculas de señalización del factor-β (TGF-β3, p-Smad2), proteínas de proliferación asociado (ciclina D1, Ki-67) y epitelial-a- mesenquimal (EMT) de los factores (vimentina) en HCT116 en comparación con los tumores monocultivos. Alta densidad microambiente tumoral co-cultivos aumentaron sinérgicamente factores promotores de tumores (NF-kB, MMP-13), el TGF-β3, favoreció la supervivencia CSC (caracterizado por la sobre regulación de CD133, CD44, ALDH1) y EMT-factores (aumento de la vimentina y Slug, disminución de la e-cadherina) en HCT116 en comparación con alta densidad HCT116 monocultivos. Curiosamente, esta diafonía sinérgico fue aún más pronunciada en presencia de 5-FU, pero disminuyó drásticamente en presencia de la curcumina, la inducción de cambios bioquímicos a mesenquimal-epitelial (MET), de esta manera sensibilizar células madre cancerosas al tratamiento con 5-FU.
Conclusión
el enriquecimiento de células madre cancerosas, notable activación de factores promotores de tumores y EMT en alta densidad de co-cultivo destaca que la diafonía en el microambiente tumoral juega un papel esencial en el desarrollo y progresión del tumor, y esta interacción parece estar mediada al menos en parte por el TGF-β y EMT. Modulación de esta diafonía sinérgico por la curcumina podría ser una terapia potencial para suprimir la metástasis CRC y
Visto:. Buhrmann C, Kraehe P, C Lueders, Shayan P, Goel A, Shakibaei M (2014) La curcumina suprime la diafonía entre de colon y cáncer de células madre estromales fibroblastos en el microambiente tumoral: papel potencial de la EMT. PLoS ONE 9 (9): e107514. doi: 10.1371 /journal.pone.0107514
Editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Singapur, Singapur
Recibido: 26 de Junio, 2014; Aceptado: August 13, 2014; Publicado: 19 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Buhrmann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se incluyen dentro del papel
Financiación:.. Los autores no recibieron ninguna financiación específica para este trabajo
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer cáncer más común en el mundo y plantea importantes problemas clínicos debido a su alta tasa de recurrencia y metástasis [1], [2]. La acumulación de pruebas sugiere que el desarrollo y progresión del cáncer colorrectal es debido a alteraciones genéticas y epigenéticas que son el resultado de interacciones complejas de las células transformadas con su microambiente [1], [3]. El microentorno del tumor es considerado como la base del tumor, que se compone de componentes residentes, tales como las células del estroma y los factores que son estables en el medio del estroma, y componentes no residentes tales como diferentes poblaciones de células inmunes, que influyen en la invasión tumoral y metástasis [4]. El impacto sinérgico del microambiente en las respuestas inflamatorias y la progresión del tumor se considera ahora como una característica esencial de la carcinogénesis [1], y existe un creciente interés en la identificación de agentes que se dirigen específicamente la interacción vía entre las células tumorales y del estroma [5 ].
se ha propuesto que la formación de CRC surge de una pequeña subpoblación de células madre tumorales auto-renovación situadas dentro de la cripta del colon [6], [7]. De hecho, la CDN Células madre propiedades (CSC) de exposición similares a las células madre fisiológicos y son responsables de la progresión del tumor [7], [8]. Recientemente, se ha propuesto que los CAC son el tipo de célula única en el microambiente tumoral que mantener el microambiente y mejorar la metástasis del cáncer y la invasión [4], [9]. Además, se ha demostrado que CSC puede interactuar directa o indirectamente con varias poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral, que se cree para influir notablemente la progresión del tumor [4].
agentes que son capaces de suprimir la diafonía Identificar entre el cáncer y las células del estroma en el microambiente tumoral podría ser una importante diana terapéutica para reprimir el potencial metastásico de células madre cancerosas. Con el fin de desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para CRC, lo que es esencial para estudiar con más detalle la interacción de las células madre cancerosas con el
residente Opiniones y
componentes
no residentes en su microambiente para dilucidar el detalle mecanismos por el cual se controla el desarrollo y la progresión de CRC.
a medida que una gran proporción de los CRC están relacionados con factores ambientales [1], nutracéuticos ofrecen a sí mismos como candidatos ideales para modular el microambiente del tumor y así apoyar la quimioterapia. De hecho, esto es importante ya que más del 15% de los pacientes desarrollan resistencia a la quimioterapia convencional /corriente con 5-fluorouracilo (5-FU) y más de 50% de los pacientes desarrollan la recaída [10]. Nosotros y otros han demostrado previamente que los nutracéuticos, tales como la curcumina, pueden influir directamente en las células madre CRC por aumentando su quimiosensibilidad al tratamiento quimioterapéutico, lo que aumenta notablemente resultado positivo terapéutico [11] - [13]. Derivado de los rizomas de la planta
curcuma longa
, la curcumina (diferuloylmethane) es un polifenol amarillo natural que media sus efectos mediante la modulación de varias dianas moleculares importantes, incluyendo factores de transcripción (NF-kB, AP-1, β catenina), enzimas (por ejemplo, Cox-2, MMP), las citoquinas pro-inflamatorias (por ejemplo, TNF-a, IL-1 e IL-6), y moléculas de adhesión de la superficie celular (por ejemplo, cadherinas, integrinas) [14] - [ ,,,0],dieciséis]. La modulación de la expresión de metaloproteinasas de matriz (MMP) en el -Medioambiente tumor (micro) es importante como MMPs son conocidos marcadores de CRC progresión [17] - [19]. metástasis tumoral y la invasión a su vez influenciada por la interacción de las células tumorales con las células epiteliales y endoteliales. La adhesión y la señalización de moléculas, tales como las integrinas juegan un papel importante durante la progresión y metástasis CRC [20], [21]. Además, la molécula de adhesión intracelular-1 (ICAM-1) se ha demostrado que aumentar la proliferación de células tumorales y la invasión y se ha identificado como responsable de la adhesión endotelial de las células cancerosas, por lo tanto influir fuertemente potencial metastásico [22], [23]. El microentorno del tumor induce, además, la activación de NF-KB que es conocido para regular varios genes implicados en la iniciación del tumor, la promoción, y la metástasis [24], [25], e inducir la actividad de Wnt que desempeña un papel fundamental en la biología de las células madre de CRC [ ,,,0],26].
factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) es un polipéptido multifuncional que juega un papel esencial en la diferenciación, la proliferación y el desarrollo embrionario en los tejidos normales. células de tejido sintetizar y secretan TGF-β en el microambiente donde se une a los receptores de TGF-beta específicos para paracrino y autocrino de señalización. Este complejo de ligando y receptor estimula cascadas de señalización intracelulares que incluyen la canónica Smad2 vía de señalización [27], que forman complejos con Smad4 y se acumula y se transloca en el núcleo. En el núcleo, los complejos de Smad activadas regulan la transcripción de genes específicos y en última instancia regular el ciclo celular y la reparación de tejidos [27]. Se sabe que el TGF-β es un supresor de tumor en las células de tejido normal y en las primeras etapas de la progresión tumoral. En las células tumorales del efecto inhibidor del crecimiento de la señalización de TGF-β es desregulada y que cambia de supresor de tumor a tumor factor promotor en diferentes órganos [27], [28]. Por otra parte, se ha informado de que la estimulación de TGF-β en las células del estroma provoca la secreción de IL-11 y aumenta la capacidad de metástasis de las células de CRC, mientras que los animales tratados con un inhibidor específico del receptor de TGF-β 1 son resistentes a la formación de metástasis [ ,,,0],29]. Curiosamente, se ha informado de que la secreción de citocinas y factores de crecimiento de células estromales en un microambiente tumoral activa una transición epitelio-mesenquimal (EMT) que soporta la resistencia a fármacos, la recurrencia del tumor, invasión y metástasis de células neoplásicas [30]. Además, E-cadherina expresión es el regulado durante EMT y esto puede ser bloqueada por los supresores de la transcripción de dedos de zinc, tales como Slug y este proceso es reversible [31] - [34].
Caracterización de los mecanismos moleculares implicados en el papel promotor de tumores de la señalización de TGF-β y EMT en un microambiente tumoral entre los fibroblastos y las células tumorales puede ayudar a desarrollar estrategias terapéuticas contra el desarrollo de tumores tales como CRC. Por lo tanto, el objetivo del estudio presentado fue investigar con más detalle la interacción de las células de CRC con fibroblastos estromales, la activación de las proteínas de la inflamación que promueven el cáncer, mediadores paracrinos y los efectos moduladores de la curcumina y 5-FU, especialmente en las células madre de CRC y EMT en un
in vitro
microambiente del cáncer de co-cultivo, que simula los
in vivo
tumor microambiente.
Materiales y Métodos
los anticuerpos
monoclonal anti-ALDH1 se obtuvo de Acris anticuerpos GmbH (Herold, Alemania). Monoclonal anti-CD133 y anti-CD44 se compraron de Abcam PLC (Cambridge, Reino Unido). Anti-β-actina, anti-ciclina D1, anti-ICAM-1, anti-vimentina, anti-E-cadherina, anti-Slug, anti-TGF-β3, anti-TGF-β3R y anti-p-Smad2 eran obtenidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Anti-MMP-1, anti-MMP-9 y anti-MMP-13 se adquirieron de R & amp; D Systems, Inc., (Heidelberg, Alemania). Anti-fosfo-específico de p65 (NF-kB) y p50 anti-fosfo-específico (NF-kB) se obtuvieron a partir de la célula Tecnología (Beverly, MA, EE.UU.). La neutralización de anticuerpo pan-TGF-β, IgG normal de conejo y anti-β1-integrina se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemie (Munich, Alemania). Anti-Ki-67 y anticuerpos secundarios utilizados para el marcaje de fluorescencia fueron adquiridos de Dianova (Hamburgo, Alemania). anticuerpos secundarios fosfatasa alcalina ovejas ligada anti-ratón y de oveja anti-conejo de inmunotransferencia se adquirieron de Millipore (Schwalbach, Alemania).
El medio de crecimiento, productos químicos y citocinas
medio de crecimiento (F- de Ham 12 /medio de Dulbecco modificado de Eagle (50:50) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS), ácido ascórbico /ml 25 mg, 50 UI /ml de estreptomicina, 50 UI /ml de penicilina, 2,5 mg /ml de anfotericina B, aminoácidos esenciales y L-glutamina), tripsina /EDTA (CE 3.4.21.4) fueron adquiridos de Biochrom (Berlín, Alemania). 5-FU se adquirió de Sigma (Munich, Alemania). BCM-95 curcumina, con una pureza superior al 95% se adquirió de Dolcas Biotech LLC (NJ, EE.UU.). Esta fuente comercial de la curcumina contiene tres componentes principales: diferuloylmethane (el componente más abundante y activa de la cúrcuma) (82%) y sus derivados demetoxicurcumina (15%) y bisdemetoxicurcumina (3%), denominadas conjuntamente las curcuminoides [35], [ ,,,0],36]. La curcumina se disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) como una concentración de stock de 5,000 M y se almacenó a -80 ° C. Las diluciones en serie se prepararon en medio de cultivo. 100 mM de 5-FU (5-fluorouracilo) se preparó en DMSO absoluto y se almacenó a -20 ° C. La concentración de DMSO fue de menos de 1% de tratamiento de drogas. Para el tratamiento, el 5-FU se diluyó en DMEM y se añade a las culturas para dar la concentración final deseada.
Líneas celulares y cultivo celular
células de cáncer de colon humano (HCT116) y células de fibroblastos humanos normales (MRC-5) se obtuvieron de la Colección Europea de cultivos celulares (Salisbury, Reino Unido). Las células se mantuvieron en matraces de cultivo de tejidos con medio de crecimiento en un incubador humidificado a 37 ° C en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO
2. El medio se cambió tres veces por semana y las células a pases cuando se alcanzó 70% de confluencia. Para monocapa microambiente tumoral co-cultivos, HCT116 y MRC-5 fueron co-cultivadas en una proporción de 01:01 en cultivo en monocapa y los co-cultivos se dejaron durante un máximo de 3 días. Los medios de comunicación DMEM suplementado se cambió cada 3-4 días y células recogidas en los puntos de tiempo indicados. Todos los co-cultivos se sembraron a una confluencia para asegurar un contacto óptimo entre las células. Para una alta densidad microambiente tumoral co-cultivos, cultivos de alta densidad HCT116 fueron co-cultivadas con células MRC-5 en monocapa. Para la formación de cultivos de alta densidad, una caída de 10μl de suspensión de células que contiene alrededor de 1 millón de células HCT116 se colocó sobre un filtro de nitrocelulosa en la parte superior de un puente steelnet, como se describe anteriormente [37]. En este sistema, las células se agregan y se nutren por difusión. Células MRC-5 se cultivan en monocapa en la parte inferior de la placa de Petri. Este modelo imita una dimensional
in vivo
situación tres y permite el intercambio entre los componentes de residentes y de las células cancerosas en el microambiente tumoral en la interfase medio de aire. Alta densidad microambiente tumoral co-cultivos se dejaron sin tratar o tratados con curcumina sola (5μM) o 5-FU solo (1, 5, y 10μM) o fueron pretratados durante 4 h con curcumina (5μM) seguido de tratamiento con 5-FU (0,1, 1, 2 y 3μM) durante el tiempo indicado. En algunos experimentos, para investigar el papel de TGF-β durante la diafonía en el microambiente tumoral co-cultivos, los cultivos se trataron con un anticuerpo neutralizante para el TGF-β (10, 20, 30 ng /ml) o IgG de control (10 , 20, 30 ng /ml) durante el tiempo indicado.
análisis de microscopía de inmunofluorescencia indirecta de la monocapa y microambiente tumoral alta densidad de co-cultivos
HCT116 y MRC-5 se co-cultivaron a una proporción de 01:01 sobre placas de vidrio en una sola capa o de alta densidad microambiente tumoral co-cultivos. Después de la fijación con metanol durante 10 min, las células se enjuagaron tres veces con PBS y se cubrieron con albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 min. Los anticuerpos primarios se diluyeron 1:50 en PBS /BSA, se incubaron durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda, se lavaron tres veces con PBS /BSA seguido de incubación con anticuerpos secundarios acoplados a rodamina (diluido 1:80 en PBS /BSA) para 1 h a temperatura ambiente y finalmente se lavaron de nuevo tres veces con agua destilada. Contra la tinción se realizó con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol, Sigma) para visualizar los núcleos celulares. Los portaobjetos se cubrió con medio de montaje Fluoromount y se examina bajo un microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania).
toluidina tinción con azul de monocapa y microambiente tumoral alta densidad de co-cultivos
MRC-5 células fueron cultivadas en monocapa de alta densidad microambiente tumoral co-cultivos con células HCT116. Alta densidad microambiente tumoral co-cultivos se dejaron sin tratar, tratados con curcumina sola (5μM), 5-FU solo (con 1 m) o se trataron previamente durante 4 horas con la curcumina (5μM) seguido de tratamiento con 5-FU (0,1, 1, 2, 3 M). Se evaluaron las culturas HCT116 y MRC-5 después de 10 días. alta densidad microambiente del tumor HCT116 co-cultivos fueron incorporados en Tissue-Tek (Sakura Finetek Europa, Países Bajos), criopreservados a -80 ° C y se corta en secciones de 5-7 micras utilizando un criomicrotomo (Zeiss, Alemania). Monocapa células MRC-5 se fijaron con metanol durante 10 min. secciones HCT116 y MRC-5 monocapas se tiñeron con azul de toluidina y se examinan bajo un microscopio óptico (Leica, Alemania).
La absorción de la curcumina en la monocapa y microambiente tumoral alta densidad de co-cultivos
La la captación celular de la curcumina en los monolayer- y de alta densidad co-cultivos, como se describió anteriormente, se evaluó con el método de fluorescencia. En pocas palabras, para las secciones HCT116 examen de fluorescencia y MRC-5 cultivos se fijaron con paraformaldehído, cubierto con medio de montaje Fluoromount y se examina bajo un microscopio de fluorescencia (Leica, Alemania).
Western blot
células enteras lisados de HCT116 mono- alta densidad o de co-cultivos se prepararon y se fraccionaron por SDS-PAGE [12]. Brevemente, las células fueron lavadas en PBS, y las proteínas se extrajeron con tampón de lisis (50 mM Tris /HCl (pH 7,2), NaCl 150 mM, 1% (v /v) de Triton X-100, ortovanadato de sodio 1 mM, 50 mM pirofosfato de sodio, fluoruro de sodio 100 mM, 0,01% (v /v) de aprotinina, pepstatina a (4 g /ml), leupeptina (10 g /ml), y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF)) por 30 min en hielo. Después de ajustar la concentración de proteína total con el sistema de bicinconínico ácido (Pierce) usando albúmina sérica bovina como estándar, cantidades iguales (proteína de 500 g por carril) de proteínas totales se separaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Las proteínas separadas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron en tampón de bloqueo (5% (w /v) leche desnatada en polvo en PBS, 0,1% de Tween 20) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo a 4 ° C en un agitador, se lavaron 3 veces con tampón de bloqueo, y luego incubadas con el anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina durante 90 minutos a temperatura ambiente. Las membranas se lavaron 3 veces en 0,1 M Tris (pH 9,5) que contiene 0,05 M MgCl
2 y 0,1 M NaCl. complejos específicos antígeno-anticuerpo se detectaron utilizando nitroazul de tetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3-indoylphosphate (
p
sal toluidina; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). como sustrato para la fosfatasa alcalina
el análisis estadístico
los datos numéricos se expresan como los valores medios (+/- SD) de un experimento representativo realizado por triplicado. Las medias se compararon mediante
t de Student
suponiendo varianzas iguales. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativos si el
valor de p
era inferior a 0,05.
Resultados
Para entender algunos de los comportamientos biológicos clave de las células del estroma y del tumor y a simular un
in vivo
microambiente tumoral,
in vitro se establecieron sistemas
de co-cultivo. El objetivo de este estudio fue investigar la interacción de las células de cáncer colorrectal HCT116 con fibroblastos humanos células MRC-5 en un modelo microambiente de co-cultivo de alta densidad, con o sin la curcumina y /o 5-FU sobre la proliferación de células tumorales, los factores promotores de tumores , invasión, EMT y células madre cancerosas colorrectales.
el intensiva diafonía entre HCT116 y células MRC-5 en la monocapa de co-cultivo influencias microambiente expresión de moléculas implicados en la adhesión, invasión y /o la proliferación
Las células HCT116 y MRC-5 fueron co-cultivadas en una proporción de 1:01 durante tres días en monocapa y evaluados con microscopía de luz. Las células HCT116 literalmente acumulan y se agrupan en torno a las células MRC-5 en busca y el establecimiento de un estrecho contacto célula-célula con las células MRC-5 en el co-cultivo de tumor (Fig. 1, PC). A continuación, se realizó la tinción de inmunofluorescencia de co-cultivos en monocapa para investigar si la interacción celular observada conduce a cambios funcionales en las células. células HCT116 en un cultivo monocapa o HCT116 y MRC 5-células en monocapa co-cultivos se marcaron con β1-integrina, ICAM-1, Ki-67, ciclina D1, TGF-β3, p-Smad2 y vimentina (Fig. 1, IF ). Se observó una fuerte expresión de adhesión y moléculas metastásicos β1-integrina, ICAM-1, de proteínas del ciclo celular activos Ki-67, ciclina D1, de TGF-β3, p-Smad2 y de EMT vimentina marcador en HCT116 co-cultivos en comparación con HCT116 mono-cultivo (Fig. 1). Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que la interacción de las células del estroma es crucial en la promoción de tumores, creando así un microambiente celular que regula la progresión del cáncer.
células HCT116 (flechas) fueron cultivadas ya sea solo o fueron co-cultivadas con células MRC-5 células (*) en una proporción de 1:01 durante tres días en placas de vidrio en monocapa y fijado con metanol. Para immunolabeling células se incubaron con anticuerpos primarios contra β1-integrina, ICAM-1, Ki-67, ciclina D1, TGF-β3, p-Smad2 y vimentina) seguido de incubación con anticuerpos secundarios de rodamina-acoplado y la contratinción con DAPI para visualizar células núcleos. Las imágenes mostradas son representativos de tres experimentos diferentes. PC: contraste de fase; SI: inmunofluorescencia; Magnificación × 400; bar = 30 nm.
curcumina y /o 5-FU afectan en gran medida la integridad celular en alta densidad microambiente tumoral co-cultivos
A continuación, se evaluó de alta densidad microambiente tumoral co-cultivos , HCT116 en alta densidad co-cultivadas con células MRC-5 en monocapa, que imitan los
in vivo
situación para investigar la influencia de agentes terapéuticos paracrinos en la diafonía entre las células y en la proliferación de células tumorales, tumor de promoción factores, la invasión y la formación de esferas de tumores, una característica prominente de células madre de cáncer. De hecho, se ha informado de que las células de fibroblastos normales son capaces de inducir la diferenciación de las células tumorales tales como de una línea celular de carcinoma de colon humano [38], [39]. Los efectos de 5-FU y /o la curcumina sobre la integridad celular y la formación de colonosphere en cultivos microambiente tumoral se evaluaron en las células HCT116 después de 10 días. Las células se trataron con diferentes concentraciones de la curcumina o 5-FU (0, 0,1, 1, 5 y 10μM) y la formación colonosphere fue evaluada por microscopía de luz como se describe en Materiales y Métodos. El individuo IC
50 de la curcumina o 5-FU fueron aproximadamente 5μM o 3.5 micras, respectivamente (p & lt; 0,05). Para evaluar el efecto del tratamiento combinado, las células HCT116 se trataron previamente con 5μM curcumina para 4 h y luego co-tratadas con diferentes concentraciones de 5-FU (0, 0,1, 1, 5 y 10μM) durante 10 días. Curiosamente, el tratamiento previo con la curcumina reduce IC
50 valores para 5-FU a 0.1μM en HCT116 (p & lt; 0,05) (Fig 2A.). Esto sugiere que la curcumina sensibiliza a las células HCT116 a 5-FU. Además, la tinción con azul de toluidina en cultivos de control mostró que las células formadas bien desarrollados colonias esferoide durante el periodo de cultivo (Fig. 2B: a). El tratamiento de cultivos de HCT116 con 5-FU (5μM) o curcumina (5μM) solo o con la curcumina y 5-FU (5μM /0.1μM) ha demostrado ser muy eficaz en la inhibición de la formación de colonosphere y la mejora de la desintegración de las esferas tumorales de alta densidad en comparación con los controles correspondientes (Fig. 2B: a). Este efecto fue mayor en con curcumina o curcumina /5-FU tratada co-cultivos (Fig. 2B: a). A continuación, se determinó la captación celular de curcumina por HCT116 en microambiente tumoral co-cultivos con microscopía fluorescente. Los resultados mostraron claramente que la curcumina se recogió por todas las células HCT116 tratados en la curcumina microambiente co-cultivos (Fig. 2B: b). Para investigar si la monocapa de células MRC-5 en el microambiente co-cultivos sobreviven al tratamiento con 5-FU, la curcumina y /o 5-FU, las células teñidas con azul de toluidina. Como se muestra en la Fig. 2C: una, las células MRC-5 se tiñó así que es un signo de vitalidad. Por otra parte, la curcumina fue considerado por todas las células MRC-5 en la curcumina tratada microambiente tumoral co-cultivos (Figura 2C:. B).
A: Cuantificación del número de colonosheres se logró mediante el recuento del número de esferoides colonias de 10 campos microscópicos en el microambiente de alta densidad co-cultivos. Los cultivos se dejaron sin tratar (Co) o se trataron con 5-FU (0,1, 1, 5 o 10μM), curcumina (0,1, 1, 5 o 10μM) o se trataron previamente con curcumina (5μM) durante 4 h, y luego expuestos a 5-FU (0,1, 1, 5 o 10μM) durante 10 días y se evaluó por microscopía de luz. Los valores se compararon con el control y los valores estadísticamente significativos con
p & lt; 0,05
fueron designados por un asterisco (*) y
p & lt; 0,01
fueron designados por un asterisco (**). Toluidina perfil tinción de azul (2B /C, a) y la absorción de la curcumina celular (2B /C, b) de HCT116 (B) en alta densidad y en MRC-5 (C) en monocapa de co-cultivo. Tumor microambiente co-cultivos se dejaron sin tratar (Co) o se trataron con 5-FU (5μM) (5-FU), la curcumina (5μM) (act) o se trataron previamente con curcumina (5μM) durante 4 h, y luego expuestos a 5-FU (0.1μM) (Cur + 5-FU) por 10 días y evaluados bajo una luz o un microscopio de fluorescencia. Las imágenes mostradas son representativos de tres experimentos independientes. F = Filtro. (*) = Colonosheres HCT116. Ampliación 4B, 4ca: 200x, 4CB: 400x; bar = 30 nm.
células madre cancerosas de colon en poblaciones celulares de CRC están dirigidos en alta densidad microambiente tumoral co-cultivos de 5-FU, la curcumina y el tratamiento combinado
Se ha informado que el microambiente tumoral juega un papel esencial en la perpetuación de la CSC promoción de afectados por estroma, células inflamatorias, las citoquinas y factores de crecimiento secretados por los fibroblastos del estroma [26], [40]. Por lo tanto, se analizó el comportamiento de las células madre cancerosas dentro de la población de células CRC, de alta densidad mono-cultivos de células HCT116 se dejaron sin tratar. Tumor microambiente co-cultivos de células MRC-5 /HCT116 se dejaron sin tratar o tratados con 5-FU (5μM), curcumina (5μM) o pretratadas con curcumina (5μM) durante 4 h y luego expuestos a 5-FU (0,1 M) durante 10 días. Los cultivos se sometieron a inmunofluorescencia etiquetado con anticuerpos primarios para CSC marcador (CD133). la expresión de CD133 ligera se detectó en el control de los monocultivos basales (Fig. 3A). Curiosamente, en contraste, las células CD133 positivas de las células HCT116 en microambiente co-cultivos fueron más altos en comparación con los que en el control de mono-cultivo (Fig. 3A), indicando el papel sinérgico importante de la diafonía entre HCT116 y células MRC-5 en el apoyo la promoción de tumores. Además, las células CD133 positivas de la población de células HCT116 línea mostraron un aumento significativamente la supervivencia después del tratamiento con 5-FU en comparación con la curcumina o /y 5-FU (Fig. 3A). En presencia de curcumina y /o 5-FU, ellos mostrado una marcada baja regulación de las células CD133 positivas (Fig. 3A y 3B), lo que demuestra el destacado efecto quimiosensibilizador de la curcumina en células madre cancerosas. Por la cuantificación, se confirmó que el número de células CD133 marcado aumento en el microambiente HCT116 co-cultivos en comparación con el control del tumor mono-cultivo de células positivas (Fig. 3A), y CD133 aumento en la población de células supervivientes después del tratamiento con 5-FU , pero no con la curcumina o el tratamiento combinado (figura 3B).
A:. alta densidad de mono-cultivos de células HCT116 se dejaron sin tratar (A, Co.HD-mono-cultura) de alta densidad microambiente tumoral, co-cultivo de HCT116 /MRC-5 células se dejaron sin tratar (A, Co.Microenv-HD-co-cultivo), o tratados con 5-FU (5μM) (A, 5-FU-Microenv-HD-CO- cultura), curcumina (5μM) (a, Cur-Microenv-HD-Co-cultivo) o pre-tratados con curcumina (5μM) durante 4 h, y luego se exponen a 5-FU (0.1μM) (a, Cur + 5FU -Microenv-HD-Co-cultivo) durante 10 días. Immunolabeling se realizó con anticuerpos primarios para dos puntos CSC marcador (CD133), seguido de incubación con anticuerpos secundarios acoplados a rodamina y la contratinción con DAPI para visualizar los núcleos celulares. Las imágenes mostradas son representativos de tres experimentos diferentes. 400 × magnificación. bar 30 nm. B: Para cuantificar la cantidad de células CD133 positivas en cultivos de alta densidad descritos anteriormente, se contaron 100 células de 15 campos microscópicos. El examen se realizó por triplicado y los resultados se proporcionan como los valores medios con S. D. de tres experimentos independientes. Los valores se compararon con el control y los valores estadísticamente significativos con
p & lt; 0,05
fueron designados por un asterisco (*) y
p. & Lt; 0,01
fueron designados por un asterisco (**)
La curcumina tiene efecto quimiosensibilización potente sobre las células madre del cáncer de colon en poblaciones celulares de CRC en alta densidad microambiente tumoral co-cultivos
a continuación, marcadores CSC (CD133, CD44 y ALDH1) expresión fue examinado por capacidad de la formación de tumores y el efecto quimiosensibilización de la curcumina en marcadores CSC en HCT116 3D microambiente tumoral alta densidad co-cultivos. Los co-cultivos se dejaron sin tratar, se trata con la curcumina (5μM), 5-FU (1, 5, y 10μM) solo o se trataron previamente durante 4 h con curcumina (5μM) seguido de tratamiento con 5-FU (0,1, 1 , 2, 3μM) durante 10 días (Fig. 4). Además, en otro conjunto de experimentos, las células HCT116 se incubaron en alta densidad monocultivos, sin fibroblastos como un control basal. De control de alta densidad mono-cultivos de HCT116 mostraron expresión basal de los marcadores CSC (Fig. 4: a, b, c). En contraste con esto, el análisis de inmunotransferencia de lisados de células enteras mostraron un marcado sobre regulación de CD133, CD44 y ALDH1 en HCT116 en el control y en la alta densidad microambiente tumoral co-cultivos tratados con 5-FU en una manera dependiente de la concentración (Fig. 4 :a B C). Sin embargo, curiosamente pre-tratamiento con curcumina seguido de tratamiento con 5-FU de manera significativa el regulado de expresión de marcador CSC de una manera dependiente de la concentración en las células HCT116 en alta densidad tumorales co-cultivos (Fig. 4: a, b, c). El análisis densitométrico de experimentos típicos de transferencia Western muestran la regulación negativa de los marcadores de CSC en las células HCT116 en los cultivos tratados con 5-FU, la curcumina y /o la curcumina 5-FU (Fig. 4: a, b, c). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la interacción paracrina entre las células tumorales y estroma es crucial en la promoción de CSC y que hay un fuerte efecto quimiosensibilizador de la curcumina en dos puntos CSC en alta densidad microambiente tumoral co-cultivos.
HCT116 alto densidad mono-cultivos se dejaron sin tratar (HCT, co) o fueron co-cultivadas con células MRC-5 en el microambiente tumoral. Tumor microambiente co-cultivos se dejaron sin tratar (Co.), se trató con la curcumina sola (5μM), 5-FU solo (1, 5, y 10μM) o fueron pretratados durante 4 h con curcumina (5μM) seguido de tratamiento con 5 -FU (0,1, 1, 2, 3μM). Después de 10 días de cultivo, se prepararon lisados celulares totales de cultivos de alta densidad de HCT116 y se analizaron por Western Blot y densitometría cuantitativa para CSC marcador ALDH1 (a), CD133 (b) y CD44 (c). evaluación densitométrica de expresión de la proteína como se revela por análisis de transferencia Western se realizó por triplicado. Limpieza de proteína β-actina sirvió como control de carga en todos los experimentos. Los valores se compararon con el control y valores estadísticamente significativos con
p
& lt; 0,05. Los valores significativos están marcados con (*).
La curcumina y /o 5-FU interfiere en la diafonía entre sinérgico /CSC-células y fibroblastos CRC- de alta densidad microambiente tumoral co-cultivos
para examinar la interacción entre células /CSC-CRC- y fibroblastos y para evaluar el efecto de la curcumina y /o 5-FU en esta diafonía sinérgica, en la proliferación de células tumorales, invasión y factores promotores de tumores (MMP, NF -κB) expresión en más detalle, se realizó un análisis Western Blot de la alta densidad microambiente tumoral co-cultivos.