Extracto

La hipericina perileno quinona perihydroxylated ha informado que poseen actividades anti-metastásicos y antiangiogénicos potentes, generados por la orientación diversas cruce de los procesos que promueven el cáncer a través de mecanismos únicos. La hipericina es el único reactivo exógeno conocido que puede inducir poli-ubiquitinación forzada y acelerada degradación de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90) en las células cancerosas. proteínas Hsp90 cliente de ese modo se desestabilizan y se degrada rápidamente. proteínas Hsp70 cliente potencialmente pueden también afectaron a través de la prevención de la formación de complejos de hsp90-Hsp70 intermedios. Mostramos aquí que la hipericina también induce una mayor degradación de factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) en dos líneas de células tumorales humanas, U87-MG glioblastoma y RCC-C2VHL - /- carcinoma de células renales y en el pigmento de la retina no maligno ARPE19 línea de células epiteliales. El volumen de negocios hipericina-acelerada de HIF-1α, el precursor de regulación del factor de transcripción HIF-1 que promueve estrés hipóxico y respuestas angiogénicas, supera la estabilización de la proteína HIF-1α fisiológico que se produce en las células hipóxicas. El efecto hipericina también elimina los altos niveles de HIF-1α expresan constitutivamente en la proteína de von Hippel-Lindau (pVHL) deficiente en RCC-C2VHL - /- línea celular de carcinoma de células renales. A diferencia de la facturación dependiente de la vía ubiquitina-proteasoma normal de proteínas HIF-α que se produce en normoxia, el catabolismo de HIF-1α hipericina inducida puede ocurrir independientemente de los niveles de oxígeno celular o promovidas por el pVHL ligadura de ubiquitina de HIF-1α. Se está mediada por las enzimas lisosomales catepsina-B con la actividad de la catepsina-B está optimizando en las células a través de la reducción mediada por hipericina en el pH intracelular. Nuestros hallazgos sugieren que la hipericina puede ser potencialmente útiles en la prevención de crecimiento de tumores en los que HIF-1α juega un papel fundamental, y en pVHL ablación células tumorales tales como el carcinoma de células renales mediante la eliminación de los contenidos de HIF-1α elevadas en estas células, la ampliación por la excesiva angiogénesis que caracteriza estos tumores

Visto:. Barliya T, M Mandel, Livnat T, Weinberger D, G Lavie (2011) la degradación de HIF-1 alfa en condiciones de hipoxia combinada con la inducción de la Hsp90 polyubiquitination en células de cáncer de hipericina: una terapia contra el cáncer único. PLoS ONE 6 (9): e22849. doi: 10.1371 /journal.pone.0022849

Editor: Anil Kumar Tyagi, Universidad de Delhi, India

Recibido: 30 Marzo, 2011; Aceptado: 30 de junio de 2011; Publicado: 19 Septiembre 2011

Derechos de Autor © 2011 Barliya et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue financiado por la Asociación de cáncer de Israel, Grant 20090033 (http://ica.cancer.org.il/english/) gracias a la contribución de Rick y Rita Weinstein, y dos becas competitivas de la Universidad de Tel Aviv: la Fundación Maratier y la Elsa y Leo Abramson Fundación, Universidad de Tel Aviv. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Dr. G. Lavie tiene interés financiero en el Hy Biopharma Corporation, que desarrolla el hipericina droga (que se describe aquí) como un agente anti-cáncer. Sin embargo, la compañía se encuentra en ensayos clínicos avanzados y es poco probable que ganar algo de esta publicación. La investigación no fue financiada por esta empresa y no existen otras remuneraciones a cualquiera de los autores. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.

Introducción

La formación de metástasis tumorales mediante la difusión de las células cancerosas y su crecimiento explosivo sigue siendo la causa más frecuente de fracaso del tratamiento del cáncer y la muerte. Las células tumorales remodelación de la matriz extracelular, modificar las propiedades de adhesión celular, invaden los tejidos circundantes y transmigrar a órganos distales para formar focos metastásicos. focos en desarrollo generan hipoxia y una necesidad de neoangiogénesis para apoyar el crecimiento. La hipoxia estabiliza la respuesta de estrés precursor HIF-1α [1], que conduce a su translocación al núcleo a través de un proceso dependiente de hsp90 [2], [3] y heterodimerización con HIF-1β, la generación de la HIF-1 factor de transcripción funcional. HIF-1 promueve la transcripción de ~ 100 proteínas diana respuesta al estrés, incluyendo VEGF. VEGF estimula el aumento de expresión de su receptor VEGFR2 primaria. Los complejos de VEGF-VEGFR2 que forma requieren asociación con hsp90 para activar la señalización corriente abajo que inicia la cascada neoangiogenic, [4] y activa la quinasa de adhesión focal integrina señalización (FAK) -Src complejo. Tanto FAK y Src también son Hsp90 proteínas cliente, requiriendo asociación con esta chaperona para el mantenimiento de sus conformaciones funcionales [5], [6]. Estas funciones incluyen la formación de adhesiones focales asociados con un aparato contráctil F-actina que están vinculados a la membrana celular y activar la maquinaria de la migración a través de la interacción con la matriz extracelular [7]. Por lo tanto, la inhibición de Hsp90 puede interrumpir varios sitios en cascadas de señalización celular y la dispersión angiogénico e interferir con la progresión tumoral.

Los marcados aumentos en el contenido de HIF-1α que se producen en muchos tipos de tumores implican HIF-1 en la promoción de la oncogénesis. La progresión tumoral se acelera a través de mecanismos heterogéneos que incluyen gen disfuncional /borrado de la BVS en el carcinoma de células renales y hemangioblastoma [8], el gen inactivado Idh1 en el glioblastoma [9], las mutaciones en las deshidrogenasas mitocondriales en succínico paraganglioma, y ​​otros [10]. En efecto, HIF-1α intratumoral elevada (o HIF-2α) están asociados con la mortalidad del paciente acelerada, evidente a partir de los análisis retrospectivos de inmunohistoquímica embebidos en parafina secciones de biopsia de diversos tumores [11]. Actualmente se acepta que la reducción de los niveles de HIF-1α tumorales puede abarcar los beneficios clínicos importantes, estimulando búsquedas intensivas para los inhibidores de molécula pequeña de HIF-1α.

Reactivos con diversas actividades capaces de interferir con la proliferación de células tumorales, la migración y neoangiogenic señalización es probable de inhibir más eficazmente la formación de metástasis y beneficiar a pacientes con cáncer. Uno de estos reactivos potencialmente prometedora es la quinona perileno perihydroxylated - hipericina. Se encontró que la hipericina inhibe eficazmente la formación de metástasis de mama por tumores murinos y carcinoma de células escamosas
in vivo
[12], al parecer al interferir con vías que promueven la angiogénesis [13] y la proliferación de células tumorales [14] de señalización. El denominador común que une a estas diferentes actividades es una capacidad única de hipericina para actuar como inductor exógeno de obligado poli-ubiquitinación de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), desestabilizadora y la rápida degradación de una gran cantidad de proteínas Hsp90 cliente [14].

Aquí mostramos que la hipericina puede degradar HIF-1α en las células a través de un único e hipoxia proteasoma mecanismo independiente. Aunque HIF-1α es una proteína cliente de Hsp90 [15] degradado por otros inhibidores de HSP90 [16], el catabolismo HIF-1α hipericina inducida parece implicar un mecanismo dependiente lisosomal catepsina-B único, que se activa en un entorno intracelular pH reducido. También se muestra que la cascada de señalización angiogénica puede verse afectada por la hipericina en múltiples sitios, lo que hace que esta molécula potencialmente prometedor en la terapia contra el cáncer.

Resultados

Forzada degradación de HIF-1α en condiciones de hipoxia mediante tratamiento de células con hipericina

con el objetivo de descifrar el mecanismo para la actividad anti-angiogénica de hipericina [13], se examinó si la hipericina afecta a la estabilización de adaptación HIF-1α, que se produce en condiciones de hipoxia en ausencia de prolina e hidroxilación de asparagina [1 ] en tres líneas celulares humanas: células de glioblastoma U87-mG, RCC-C2
BVS - /- (C2
BVS - /-) células de carcinoma renal deficientes en pVHL y ARPE-19 células del epitelio pigmentario de la retina. Las células se expusieron primero a la hipericina durante 72 horas, el tiempo requerido para efectos óptimos de hipericina para desarrollar e hipoxia generado químicamente con CoCl
2 y con un ambiente bajo en oxígeno (0,5% O
2, 5% de CO
2 y el 94,5% N
2) para las últimas 6 horas de tratamiento para prevenir la citotoxicidad hipóxica. los niveles de HIF-1a se analizaron en las fracciones citosólicas y nucleares por transferencias de Western. Los resultados, Fig. 1 muestran que la exposición a 10 mM y 30 mM de hipericina reducen eficazmente los aumentos de la hipoxia inducida en los niveles de HIF-1α de una manera dependiente de la dosis de hipericina en células ARPE-19 (Fig. 1A) y en células U87-MG (Fig. 1B ). Las reducciones de HIF-1α fueron más pronunciados en las fracciones nucleares de ambas líneas celulares, particularmente cuando la hipoxia fue inducida químicamente con CoCl
2.

[A] ARPE19, [B] U87-MG, [C ] El CCR-C2
BVS - /- y [D]. (Reconstituido gen VHL) las líneas celulares MCF-C2
+ BVS fueron expuestos a 10 y 30 mM hipericina durante 72 horas. Los cultivos se sometieron a condiciones de hipoxia con 150 mM CoCl
2 (A & amp; B, dobletes panel superior) y la mínima atmósfera de oxígeno (0,5% de O
2, el 94,5% de N
2 y el 5% CO
2) (a & amp; B, dobletes inferiores del panel) durante los últimos 6 horas de tratamiento. Hipericina causó la degradación de HIF-1α. El mediador de la escisión proteolítica HIF-1α se caracterizó por la inhibición de la degradación de HIF-1α con el CA-074 inhibidor de la catepsina B, con MG-132 y con inhibidores de proteasomal calpaína ALLN, se administra a los cultivos para las últimas 6 horas de incubación con el Células. extractos citosólicos y extractos nucleares se prepararon, separaron en SDS-PAGE y transferencias Western desarrolladas con anti-HIF-1α. La igualdad de carga fue confirmada con β-actina. [MI]. Efectos de la hipericina en el pH intracelular de U87-MG y C2
BVS - células - /. BCECF cuantitativa, la fluorescencia dependiente del pH se midió spectrofluorimetrically (FRU denota unidades relativas de fluorescencia). [F]. Análisis de la función de la reducción del pH intracelular mediada por hipericina en la promoción de rotación de HIF-1α bajo CoCl
2 hipoxia, determinada después alcalinización citoplasmática con 20 mM NH
4Cl aplica durante los últimos 6 horas de incubación. alcalinización citoplasmática disminuye el volumen de negocios de HIF-1α hipericina inducida bajo CoCl
2 hipoxia.

Para determinar la hipericina aumenta la degradación de HIF-1α se utilizó el C2 con deleción de gen VHL
BVS- /- línea celular. pVHL, el reconocimiento del sustrato y el módulo de unión de un complejo ligasa E-3 ubiquitina se une HIF-1α siguiente hidroxilación prolil en la HIF-1α dominio prolil-hidroxilasa proteína-2 [17], ubiquitinating por lo tanto HIF-1α y mediar la degradación proteasomal de esta respuesta de estrés factor de transcripción precursor [18]. La deficiencia de pVHL interrumpe esta respuesta degradación dependiente de oxígeno, lo que lleva a la acumulación constitutiva de HIF-1α. Se examinó el contenido de HIF-1α en C2
BVS - células después de 72 hr tratamientos con hipericina - /. El constitutivamente alto contenido de HIF-1α en C2
BVS - /- células disminución tras la exposición a la hipericina (Fig. 1C exposiciones) de una manera similar a las reducciones de HIF-1α observados en U87-MG y las células ARPE-19 tratadas con hipericina en condiciones de hipoxia. eliminación HIF-1α por hipericina en C2
BVS - /- las células se produjo de forma independiente de pVHL y se encontró que era insensible a la inhibición con inhibidores MG132 o ALLN proteasomal calpaína (figura 1C.), excepto la implicación de la vía de la ubiquitina-proteasoma por lo tanto en este proceso. la degradación de HIF-1α por hipericina fue, sin embargo efectivamente inhibida por el inhibidor de la catepsina-B CA-074 en C2
BVS - /- las células (Figura 1C.) y no afectados por el CLI-III, un inhibidor de la catepsina-L (datos no mostrado). Estas observaciones indican que el volumen de negocios de HIF-1α hipericina mejorada está mediada por el catabolismo por una enzima de tipo catepsina-B independientemente de la vía de la ubiquitina-proteasoma

La transfección estable de la BVS en C2
BVS -. /- células restauraron el E3 ubiquitina ligasa funcionalidad compleja [19], incluyendo HIF-1α degradación proteasomal bajo normoxia y la estabilización de HIF-1α en condiciones de hipoxia (Fig. 1D). En este hipericina ajuste también acelerada degradación de HIF-1α en condiciones de hipoxia, la derogación de la estabilización de HIF-1α inducida por hipoxia en la BVS-reconstituido RCC-C2
+ células VHL (C2
BVS + células) (Fig. 1D). la degradación de HIF-1α por hipericina en C2
BVS + células también fue inhibida por la CA-074 (Fig. 1D). Por lo tanto, la vía de la catepsina-B sigue siendo la principal vía de degradación de HIF-1α por hipericina en condiciones de hipoxia tras la reconstitución pVHL.

hipericina provoca reducciones en el pH intracelular

El cambio en la rotación de HIF-1α de el fisiológica pVHL mediada por la degradación proteasomal a un mecanismo dependiente de la catepsina-B causada por la hipericina nos llevó a investigar si los cambios en las condiciones intracelulares contribuyeron a este cambio. Puesto que las actividades fotodinámica inducidos por la luz de la hipericina provocan reducciones en el pH intracelular (pH
i) de las células tumorales [20], la hipótesis de que la hipericina también puede causar la reducción del pH intracelular en la oscuridad a través de actividades redox, la optimización de condiciones para la enzima lisosomal actividad. pH
i se midió en U87-MG y C2
BVS - /- células tratadas con 10, y 30 mM hipericina durante 72 horas en la oscuridad, la supervisión depende del pH de escisión esterolıtica del derivado acetoximetil-éster de BCECF ( consulte Métodos para más detalles). A pesar de mantenimiento estricto de condiciones de oscuridad, se registraron reducciones dependientes de la concentración de hipericina en el pH intracelular en células U87-MG y C2
BVS - células - /(figura 1E.). El pH citosólico
i disminuyó en las células U87-MG de una línea de base de 7,12 ± 0,08 a 6,75 ± 0,06 con 10 M de hipericina (p = 0.05), y a 6,45 ± 0,20 con 30 mM hipericina (p≤0.03). En C2
BVS - /- las células del pH
me he apartado de 7.18 ± 0.04 a 6.85 ± 0.28 (p≤0.08) con 10 mM hipericina y de 6,42 ± 0,2 con 30 mM hipericina (p = 0.05). Estos estudios muestran que la hipericina también provoca reducciones dependientes de la concentración de pH celular
i en la oscuridad.

Para determinar si la reducción del pH
i es esencial para la catepsina-B mediada la degradación de HIF-1α por hipericina, efecto de la alcalinización citoplasmática con NH
4Cl en el contenido citosólico HIF-1α se examinó en las células tratadas con hipericina. células U87-MG fueron expuestos a la hipericina durante 72 horas en la oscuridad y 150 mM CoCl hipoxia
2 inducida durante los últimos 6 hrs de incubación en medios suplementados con cloruro de amonio 20 mM para obtener la alcalinización citoplasmática. extractos citosólicos se prepararon y desarrollaron transferencias Western con el anticuerpo a HIF-1α. Higo. 1F muestra que la prevención de intracelular reducción del pH disminuye la degradación de HIF-1α por hipericina, sin embargo en la mayor concentración de 30 mM hipericina cierta degradación de HIF-1α en condiciones de hipoxia tuvo lugar. Esta degradación parece ser menos sensible al inhibidor de la catepsina-B CA-074 y puede reflejar la implicación de un mecanismo dependiente de proteasoma.

hipericina interfiere con HIF-1α unión a VEGF y secuencias HRE promotor del gen GLUT1

La degradación hipericina mejorado HIF-1α y la consiguiente deficiencia de HIF-1 contenido nuclear, se plantearon la hipótesis de disminuir HIF-1 interacciones con elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) en los promotores de genes de respuesta al estrés como el VEGF y GLUT1. HIF-1 vinculante para el promotor del gen VEGF humano HRE era, por lo tanto, analiza en hipericina tratados U87-MG, C2
BVS - /- y las células ARPE-19 utilizando fluorescencia electromovilidad Shift ensayos (F-EMSA). Las células se expusieron a la hipericina durante 72 horas, los extractos nucleares preparados y ADN-proteína formación de complejos con el promotor de VEGF EDH sondas fluorescentes que contiene elemento-se analizaron para SYPRO Rubí fluorescencia. En C2
BVS - células portadoras de alto contenido de línea de base de HIF-1, HIF-1 se forman los complejos ADN-proteína con la sonda de la EDH (Fig. 2A) - /. No se detectó la sonda libre (tinción SYBER verde, panel izquierdo), lo que refleja una sonda de ADN sobre todo unido. Tras el tratamiento con 30 mM hipericina, HIF-1-HRE la formación del complejo se redujo marcadamente con la mayoría de sonda de ADN no unido restante (carril 2)

Encontrados en promotores de:. [A]. El gen VEGF, se analizan mediante fluorescencia de electromovilidad Shift Ensayo (F-EMSA). proteínas nucleares fueron separados en 6% de SDS-PAGE, se tiñeron con SYBER etiqueta verde sonda de ADN y la proteína no unida se detectó con fluorocromo de unión a proteínas SYPRO Ruby. Los geles fueron escaneados utilizando FL-5000 escáner basado en láser. [SEGUNDO]. El gen GLUT1 analizó por inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP). cromatina esquilada se inmunoprecipitó con anticuerpo anti HIF-1α y ADN aislado de esta cromatina se amplificó con cebadores específicos para la región promotora del gen GLUT1. [DO]. La interferencia de la hipericina con la activación del promotor de VEGF en las líneas celulares tumorales. figura de la izquierda - C2
BVS - células - /. Carril 1 - células sin tratar, el carril 2 las células tratadas con 30 hipericina mu M durante 72 horas. figura de la derecha - células U87-MG. El carril 1 - células no tratadas, carril 2 - células sometidas a hipoxia (150 M CoCl
2 para los últimos 6 horas), calle 3 - CoCl
2-hipoxia durante los últimos 6 horas y hipericina 30 M durante 72 horas, y carril 4 -. hipericina, 30 mM durante 72 horas

En las células U87-mG normoxia, complejos niveles de HIF-1-HRE eran bajos y el aumento en condiciones de hipoxia sin dejar sonda de ADN libre detectable. Inducida por hipoxia, la formación del complejo HIF-1-HRE ha sido abrogada por tratamiento con células hipericina (Fig. 2A, el panel medio), dejando la sonda de ADN en su mayoría no unido. En las células hipóxicas ARPE-19 niveles complejos de proteína-HRE eran más altas en comparación con las líneas de base de normoxia y una reducción en las hipericina HIF-1 - sonda de fijación. Del mismo modo, los niveles de sonda libre baja en las células hipóxicas, se incrementaron tras la exposición a la hipericina (Fig. 2A, panel derecho). El tratamiento con hipericina de líneas celulares con niveles debido a la hipoxia o pVHL defectuosa alta HIF-1 (C2
BVS - /- las células) dio lugar a interacciones reducidas con elementos de respuesta a la hipoxia

HIF-1 interacciones con otros. de respuesta al estrés gen promotor HREs como el gen GLUT1 también se vieron afectados por la hipericina como se muestra por análisis de inmunoprecipitación cromatina. Cromatina preparado a partir de núcleos de las células tratadas con hipericina y de control fue cortado y HIF-1 que contienen fragmentos inmunoprecipitada con anti-HIF-1 anticuerpo. con destino a HRE niveles de HIF-1 se determinaron a partir de la amplificación del ADN extraído mediante PCR utilizando sondas específicas promotor GLUT1. En U87-MG células exposición a la hipoxia como consecuencia un aumento de HIF-1 interacciones con el promotor GLUT1 HRE (Fig. 2B panel central), mientras que la exposición concomitante a la hipericina reduce las cantidades de promotor con destino HIF-1 (carril 3). Reducciones similares se produjeron en células ARPE19 (Fig. 2B, panel izquierdo). En C2
BVS - /- las células, hipericina causó una disminución dramática en destino a GLUT1 promotor de HIF-1 (Figura 2B, panel de la derecha.). En general, las reducciones en el contenido citoplásmico HIF-1α en células hipóxicas tratadas con hipericina también resultaron en la reducción de HIF-1 actividades de transcripción que promueven la maduros en los núcleos de las células, disminuyendo interacciones HIF-1 con los promotores de genes de VEGF y GLUT1.

la hipericina interfiere con la activación del promotor de VEGF en líneas celulares tumorales

las disminuciones de HIF-1 se unen a VEGF y promotores GLUT1 causadas por la hipericina, llevaron a los análisis de los efectos de la hipericina sobre la activación del promotor de VEGF. U87-MG y C2
BVS - /- células fueron transfectadas transitoriamente con un constructo indicador, que contiene el elemento HRE de VEGF-A de genes (pGL3P-1100). Las células se dividieron en 30 grupos M hipericina tratado (durante 72 horas) y el grupo control no tratado. La actividad de luciferasa se midió frente a las células control de vehículo pGL3P vector transfectadas desprovistos de la construcción indicadora. Higo. 2C (a la izquierda de exposiciones) muestra la expresión de la actividad alta de la luciferasa en el control sin tratar C2
BVS - células transfectantes, que mostró una tendencia a la actividad de la luciferasa suprimido en C2
BVS hipericina tratados - - //- las células en aproximadamente un 40% , lo que sugiere que la hipericina tiende a interferir con la activación del promotor de VEGF en C2
BVS - /- las células, sin embargo, las diferencias no alcanzaron significación estadística (
P
= 0,06, Mann Whitney). los niveles de luciferasa del plásmido vehículo pGL3P fueron bajas y similares en ambos grupos (no se muestra).

En las células U87-MG, el promotor de VEGF también es fuertemente activa en respuesta a la hipoxia (Fig. 2C), mientras que el tratamiento de células con 30 hipericina M abolido por completo la activación del promotor inducida por hipoxia (
P
= 0,05) (3
ª columna). La hipericina solo sin hipoxia no tuvo efecto sobre la activación del promotor (4
ésima columna). pGL3P de control del vehículo transfectantes del vector eran bajos en todos los grupos (no mostrados). Por lo tanto, la hipericina puede inhibir la activación del promotor de VEGF-bajo condiciones de hipoxia a través de la degradación de HIF-1α en células U87-MG.

hipericina modula la transcripción del gen VEGF en líneas de células tumorales

La regulación a la baja de la activación del promotor de VEGF debido a la hipericina inducida por el catabolismo de HIF-1α en las células hipóxicas se le solicite la investigación de los efectos de la, catabolismo HIF-1α hipericina-suscitó en la transcripción de genes VEGF. U87-MG y ARPE-19 células expuestas a la hipericina (72 hrs en la oscuridad) se sometieron a CoCl
2 hipoxia durante las últimas 6 horas de tratamiento. Se preparó el ARN y la transcripción de VEGF analizada por semi-cuantitativos RT-PCR utilizando cebadores que abarcan el exón 1 y exon8 del gen VEGF-A. Estos cebadores amplifican las seis variantes de corte y empalme de VEGF y los análisis semicuantitativos permiten analiza el perfil diferencial de los niveles de cada una transcripción de VEGF empalme. Los resultados muestran que en células ARPE-19, hipoxia modulaciones en los perfiles de transcripción variante de empalme VEGF inducida. Cuando la hipoxia se combinó con la exposición a la hipericina, la transcripción de VEGF
189 y VEGF
165 isoformas que se incrementaron drásticamente en condiciones de hipoxia se redujo (Fig. 3A), en particular con la dosis de 30 mM (Fig. 3A, carril 4). VEGF
145 expresado en las células control no tratadas, suprimida en condiciones de hipoxia fue re-expresado después del tratamiento con hipericina (Fig. 3A, carril 4).

A. En las células ARPE-19, en las células B. U87-MG y C en C2
BVS - /-. Células

En las células U87-MG niveles de referencia de algunas isoformas del VEGF en virtud de normoxia, principalmente VEGF
189 eran altos debido a los mecanismos de hipoxia-independiente especies de oxígeno como reactivos [21], NO [22], fosfatidilinositol-3-quinasa y la activación de MAP quinasa a través de la acción de mTOR [23], o la pérdida de genes IDH1 función en glioblastoma [9]. Sin embargo transcripción de VEGF isoformas del VEGF principalmente
206, VEGF
165 y VEGF
121 aumentó después de la exposición a la hipoxia celular. Su transcripción disminuyó después de la exposición de células a 30 M hipericina (Fig. 3B, carril 3). En C2
BVS - /- células que expresan constitutivamente HIF-1α, la transcripción de VEGF era por lo tanto muy alta al inicio del estudio. La exposición a la hipericina (72 horas) inducida por las reducciones de VEGF
206, VEGF
189 y marginalmente también VEGF
165 (Fig. 3C). Curiosamente, cuando las células de hipericina tratados también fueron expuestos a CA-074 (100 mg /ml), el inhibidor de la catepsina-B que impidió la degradación de HIF-1α hipericina mejorada, la transcripción de genes VEGF fue también estimuló en comparación con las células tratadas con hipericina sólo se (Fig. 3C). En resumen, la hipericina estimula los cambios en los patrones de expresión de VEGF variante de empalme más notablemente en células ARPE-19 (Figura 3A.) Y también detectable en U87-MG y C2
BVS - /-.
Células
Prevención de la expresión VEGFR2 /KDR en células tratadas hipericina

las modulaciones en los patrones de transcripción de genes VEGF inducida por la degradación acelerada de HIF-1α hipericina mediada, análisis aseguradas de efectos de hipericina en mediadores de la angiogénesis en el nivel de proteínas. Las posibles correlaciones con las actividades de Hsp90 también se evaluaron debido a polyubiquitination hsp90, inactivación y degradación que también son inducidos por la hipericina [14], y los papeles Hsp90 juega en sitios clave de la cascada angiogénica [2], [24].

Efectos del tratamiento con hipericina sobre la expresión de VEGFR2 /KDR fueron examinados en las tres líneas celulares, incluyendo células ARPE-19 debido a VEGFR2 también se expresa en las células RPE [25]. El tratamiento con hipericina inducida marcada supresión del contenido celular VEGFR2 en U87-MG y las células ARPE-19, sin embargo, los niveles del receptor no se vieron afectados en C2
BVS renal - /- las células (Fig. 4A). Para determinar si la expresión de VEGFR2 reducido el resultado de la producción de VEGF disminuida que se complementó el medio de crecimiento de U87-MG y ARPE-19 células con VEGF (10 ng /ml) con o sin heparina (1 unidad /ml durante 48 horas) un día después de la hipericina la administración y la expresión de VEGFR2 analizado en estas células. Estos tratamientos no modificaron la expresión de VEGFR2 hipericina regulados a la baja y no aumentan los niveles de VEGFR2 (datos no mostrados). Por lo tanto, examinamos si la hipericina modula VEGFR2 los niveles de mRNA de expresión en estas células. El ARN se preparó a partir de células tratadas con hipericina (72 horas en la oscuridad) y análisis de RT-PCR semicuantitativa realizó con cebadores VEGFR2-específicos, utilizando VEGFR1 como referencia comparativa. Estos experimentos revelaron que VEGFR2 la transcripción de genes fue eficaz y selectivamente inhibida por la hipericina en las tres líneas celulares, mientras que la transcripción VEGFR1 se vio menos afectada (Figura S1). Ellos sugieren que la hipericina desencadena efectos epigenéticos downregulating selectivamente la expresión de VEGFR2 y varios genes adicionales. Sin embargo, este gran tema excede el alcance de este manuscrito y se volverá a tratar en otro lugar.

[A]. Western blot análisis de los niveles de proteína VEGFR2 en extractos citosólicos de células no tratadas de control (C), o las células tratadas con 30 mM hipericina durante 72 horas (HYP). [SEGUNDO]. La tinción de las células U87-MG con faloidina-FITC. (1) Las células no tratadas y (2) las células tratadas con hipericina 30 mM durante 72 horas. flechas naranjas muestran filamentos de actina F; flechas amarillas representan colapsaron glóbulos de actina tras la exposición a la hipericina. [DO]. VEGFR2-hsp90 la formación del complejo después del tratamiento con la hipericina 30 mM durante 72 horas. Los resultados de inmunoprecipitación con anti-Hsp90 anticuerpo y el desarrollo de transferencias de Western con anticuerpo anti-VEGFR2. La hipericina disminuye la formación de complejos VEGFR2-Hsp90. [RE]. La inducción de la Hsp90 forzada poli-ubiquitinación por hipericina (30 mM durante 72 horas) en líneas celulares cancerosas humanas. Panel superior - inmunoprecipitación con anti-hsp90 y Western blot con el anticuerpo anti-Hsp90 (control); El panel medio - inmunoprecipitación con anti-hsp90 y Western blot con anti-ubiquitina, e inferior del panel inmunoprecipitación con anti-ubiquitina y Western blot con anti-Hsp90. (I.p. - inmunoprecipitación; W. B. - transferencias de Western).

VEGFR2 señalización corriente abajo después de la activación por interacciones VEGF-VEGFR2 también requiere asociación con Hsp90 [24]. la participación de la Hsp90 es relevante para nuestro análisis de efectos antiangiogénicos, porque ya se ha informado de mama murino y células tumorales de carcinoma escamosas que la hipericina induce polyubiquitination hsp90 y la degradación acelerada, las proteínas Hsp90-cliente desestabilizadores y degradantes en estas células [14]. aguas abajo de señalización de VEGFR2 activa alphavbeta3 y la quinasa de adhesión focal (FAK) para formar adhesiones focales del citoesqueleto y polímeros de F-actina [24]. FAK y Src también son Hsp90 proteínas cliente y de hecho hipericina tratamiento interfiere con la polimerización de actina F (Fig. 4B). Por ello, investigó los efectos de hipericina en asociación con hsp90 VEGFR2, el análisis de VEGFR2 tire hacia abajo después de inmunoprecipitación con anticuerpo anti-hsp90. Higo. 4C muestra que VEGFR2 con hsp90-inmunoprecipitados CO, sin embargo, este co-inmunoprecipitación fue abrogada después del tratamiento con 30 mM de hipericina en las tres líneas celulares. Este hallazgo aparentemente universal, indica que el VEGF-VEGFR2-Hsp90 formación de complejos disminuye debido a las acciones de hipericina.

También confirmamos aquí que la hipericina induce polyubiquitination hsp90 en líneas celulares humanas. La inmunoprecipitación de U87-MG y C2
BVS - /- lisados ​​celulares con anti-Hsp90 se bajó ubiquitina después de la exposición hipericina y viceversa: inmunoprecipitación con anti-ubiquitina se bajó hsp90 (Figura 4D).

. Hsp90 poli-ubiquitinación interfiere con el transporte nuclear de HIF-1α antes de la degradación de HIF-1α

para determinar si la desestabilización hipericina mediada por HIF-1α también depende de la hipericina inducida poli-ubiquitinación de hsp90 hemos realizado evaluaciones dependientes del tiempo de los efectos de la hipericina en hsp90 poli-ubiquitinación y al mismo tiempo el contenido celular de HIF-1α hsp90-asociado en células U87-mG en condiciones de hipoxia. Las células fueron expuestas a 10 y 30 mM de hipericina durante 48 horas momento en el que hsp90 poli-ubiquitinación convirtió detectable y durante 72 horas cuando la chaperona se ha degradado [14]. La hipoxia se indujo con CoCl
2 para las últimas 6 horas del experimento, las células se lisaron y se prepararon tanto citosólica y extractos nucleares. Hsp90 se inmunoprecipitó con su correspondiente anticuerpo y transferencias Western desarrolladas con anticuerpos anti-HIF-1α para monitorizar hsp-90 unido HIF-1α y con anti-hsp90 como control (Fig. 5A). los niveles de HIF-1a unidos a hsp90 se compararon con el total de HIF-1α analizada en las transferencias Western directamente desde citosólica enteros y fracciones nucleares. Los resultados muestran que tras la exposición a la hipericina durante 48 hrs hsp90 se convirtió en poli-ubiquitinated, sin embargo, la degradación de chaperona se observó principalmente en la dosis más alta de 30 M hipericina (Fig. 5A, imagen de la izquierda). Citosólica HIF-1α empezó a degradarse en el punto de tiempo de 48 horas, sólo después de tratamiento con 30 mM de hipericina (Fig. 5B, panel superior izquierdo). Sin embargo, el transporte nuclear HIF-1α fue más fuertemente abrogada por ambos niveles de dosis de hipericina (Fig. 5B, 48 horas de duración punto 2
nd del panel, fracción nuclear). Esto fue debido a la alta dependencia del transporte nuclear HIF-1α en la actividad chaperona Hsp90 intacta [26]. Hsp90 poli-ubiquitinación por la hipericina causó la pérdida de la actividad chaperona y evita que el HIF-1α fisiológica trans-migración en el núcleo donde normalmente se disocia de hsp90 [27]. HIF-1α unido a hsp90 y co-inmunoprecipitó con anticuerpo anti hsp90 también fue más fuertemente degradada debido a la ubiquitinación hsp90 después de 48 horas (Fig. 5B, panel inferior izquierdo). A las 72 horas hsp90 citosólica era muy degradada a por debajo del nivel de detección (5A. La figura, imagen de la derecha) y afectó tanto a la co-inmunoprecipitó HIF-1α y HIF-1α transportados en el núcleo (Fig. 5B, tercera y cuarta imágenes). El contenido de HIF-1α citosólica total a 72 horas de duración punto también fue fuertemente degradada, sin embargo, un poco de proteína HIF-1α permaneció detectable. Por lo tanto, citosólica HIF-1α asociado con hsp90 disminuyó como poli-ubiquitinación de hsp90 aumentado (Figura 5A & amp;. 5B), pero correlacionado menos con la degradación hsp90 real

U87-MG células fueron expuestas a 10 & amp.; Se analizaron 30 M hipericina durante 48 horas (paneles de la izquierda) y 72 horas (paneles de la derecha) bajo condiciones de hipoxia (150 M CoCl
2) y la expresión de Hsp90 y actividades de chaperona. extractos citosólicos se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-hsp90 y transferencias de Western desarrolladas con: [A] anticuerpos anti-HSP90. [B] contra HIF-1α. Higo. Higo. [44].