cáncer
Extracto
Aquí mostramos una nueva relación entre el ser humano p14ARF oncosuppressor y la oncoproteína MDM2. MDM2 sobreexpresión en diversas líneas celulares de cáncer causa la reducción de p14ARF induciendo su degradación a través de la proteasoma. El efecto no requiere la actividad de ubiquitina ligasa de MDM2 y preferentemente se produce en el citoplasma. Curiosamente, el tratamiento con inhibidores de la vía de PKC (proteína quinasa C) y uso de mutantes de fosforilación p14ARF indican que ARF fosforilación podría desempeñar un papel en la degradación de MDM2 ARF mediada reforzar nuestras observaciones anteriores de que la fosforilación ARF influye en su estabilidad y actividad biológica. Nuestro estudio revela un nuevo mecanismo potencialmente importante a través del cual ARF y MDM2 pueden compensar entre sí durante el proceso tumorigénico
Visto:. Vivo M, M Matarese, Sepe M, Di Martino R, L Festa, Calabró V, et Alabama. (2015) Degradación MDM2 mediada por p14ARF: Un nuevo mecanismo para controlar los niveles de ARF en las células cancerosas. PLoS ONE 10 (2): e0117252. doi: 10.1371 /journal.pone.0117252
Editor Académico: Thomas G. Hofmann, el Centro Alemán de Investigación del Cáncer, Alemania |
Recibido: 23 Junio, 2014; Aceptado: 19 de diciembre de 2014; Publicado: 27 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Vivo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Legge Regionale (Regione Campania) no 5/2007 de AP y GLM y Progetto "Campania Investigación en Medicina Experimental" (NATA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el conocimiento de los mecanismos que regulan el desequilibrio entre los supresores de tumores y oncogenes, es fundamental para la comprensión de la patogénesis y evolución del cáncer
.
entre los supresores tumorales más importantes, p14ARF (ratón p19ARF) (Alternativa Marco de lectura) parece desempeñar un papel importante, siendo su contribución directa al cáncer en gran medida demostrado en los últimos años [1,2].
ARF está involucrado en puesto de control oncogénico mediante la sensibilización de las células cancerosas incipientes para someterse a la detención del crecimiento o apoptosis. Hay una creciente evidencia de que la señalización de ARF es complejo, e implica vías p53-dependientes o independientes destinadas principalmente a restringir el crecimiento celular anormal y en el mantenimiento de la estabilidad genómica. El descubrimiento de una plétora de interactores ARF y la observación de que también viral, genotóxico, hipoxia y estrés oxidativo activar una respuesta ARF, sugieren que ARF tiene un papel más amplio para proteger a la célula [3]. Las células primarias en condiciones normales mantienen ARF en niveles bajos; sin embargo, cuando las células son estimuladas por insultos oncogénicos, su concentración en la célula aumenta drásticamente. Este fenómeno va acompañado generalmente por una interrupción en paralelo de la interacción inhibitoria entre Mdm2 y p53, lo que resulta en la acumulación de p53 transcripcionalmente activo que estimula la apoptosis, ya sea o detención del ciclo celular [4, 5]. El fuerte efecto sobre la proliferación celular ARF requiere que las células deben haber desarrollado mecanismos que pueden reducir rápidamente los niveles intracelulares de ARF cuando su actividad no es más requerido. Sin embargo, los mecanismos que regulan el volumen de negocios ARF van sólo recientemente se ha dilucidado. degradación ARF depende, al menos en parte, en el proteasoma y, aunque ARF carece de residuos de lisina en su secuencia, que puede someterse a la ubiquitinación N-terminal independientemente de Mdm2 y p53 [6]. Muy recientemente, una ligasa de ubiquitina específica para ARF llama ULF fue identificado [7]. Por otro lado, existen evidencias de que ARF pueden ser degradados
in vitro
por el proteasoma 20S en ausencia de ubiquitinación y que este proceso puede ser contrarrestado por TBP-1 (Tat Binding Protein 1), una multifuncional componente de la subunidad reguladora de la proteasoma [8]. Por otra parte, la REG γ proteasoma se ha implicado en la regulación de la ubiquitina-independiente de la facturación p19ARF, apoyando la idea de que la ubiquitinación podría no necesariamente implicado en la facturación ARF [9].
Curiosamente, nosotros y otros han demostrado recientemente que , después de la activación de PKC (proteína quinasa C alfa), los niveles de ARF aumentan [10, 11]. Además, una mutación puntual que imita la fosforilación en el Thr8 conservado induce la acumulación de ARF principalmente en el citoplasma e inhibe su actividad biológica [11].
Hasta ahora, la localización subcelular ARF parece jugar un papel importante en su estabilidad y funciones biológicas, aunque no de forma inequívoca. Parece ser que la localización nucleolar de la IRA puede servir para su almacenamiento o estabilización [12,13]. En el nucleolo, ARF asume una estructura estable gracias a su asociación con B23 /NPM, mientras que en el nucleoplasma se somete a una rotación más rápida. En algunos casos, el aumento en los niveles de ARF causa Mdm2 a trasladarse a la nucleolo [14, 15] y esto se ha relacionado con la estabilización de p53. Otros informaron de que, aunque la localización nucleolar de ARF provoca su estabilización, esto no es esencial para regular la actividad de ARF hacia p53 [16, 17]. Curiosamente, se ha informado de que las formas no nucleolar de ARF son sometidos a una rápida degradación por el proteasoma, con MDM2 jugar un papel en la modulación de este fenómeno aunque con mecanismos lejos de ser completamente aclarada [18]. MDM2 tiene papeles multifacéticos en la degradación de proteínas. De hecho, aparte de su papel bien descrito como ligasa E3-ubiquitina, MDM2 es capaz de p63 transportan al citoplasma mediación de su interacción con las proteínas implicadas específicamente en su volumen de negocios [19]. Además, MDM2 se ha demostrado para mediar proteasoma dependiente de ubiquitina, pero independiente de la degradación de p21Waf1 /Cip1 [20] y de Retinoblastoma proteínas [21]. Más recientemente se ha informado de que MDM2 puede interactúa con componentes de la proteasoma 19S [22] reclamando una vista más amplia de su mecanismo de acción. Nosotros investigamos aquí en una nueva interrelación entre la FRA y Mdm2 en el que Mdm2 parece estar implicado en la regulación del volumen de negocios ARF mediación de su degradación a través del proteasoma.
Resultados
Mdm2 sobreexpresión causa la degradación a través p14ARF el proteasoma
Para analizar la posible participación de MDM2 en la regulación de la estabilidad de proteínas p14ARF overexpressed un plásmido de expresión de MDM2 en diferentes líneas de células humanas y de ratón que presente o carecen de niveles detectables de p53 y /o MDM2. Como la fig. 1 muestra, p14ARF niveles endógenos tanto en células H1299 y HeLa disminuyen linealmente cuando cantidades crecientes de plásmido de expresión de MDM2 fueron transfectadas (Fig. 1, A y B). Real-Time PCR análisis en el ARN extraído de MDM2 transfectadas HeLa y células H1299 no muestra cambios significativos en la cantidad relativa de ARF mRNA (Fig. 1C), indicando que el efecto MDM2 se ejerce a nivel post-transcripcional. Por otra parte, la sobreexpresión de MDM2 resultados también en la reducción de la proteína exógena expresaron IRA en varias líneas de células humanas y de ratón (Fig. 1D, E y F), independientemente del estado de p53, lo que indica que la proteína MDM2 afecta a la estabilidad de la IRA de una manera independiente de p53. Es importante destacar que la reducción de los niveles intracelulares de MDM2 endógenos por siRNA provoca un aumento de los niveles endógenos de ARF tanto en células HeLa y H1299, confirmando además que MDM2 endógeno puede controlar p14ARF abundancia (Fig. 2). por lo tanto se investigó la estabilidad de proteínas ARF en presencia o ausencia de MDM2 sobreexpresión tras la exposición a la cicloheximida para bloquear la síntesis de proteínas. En los tiempos indicados después de la exposición al fármaco, las células se recogieron y los extractos se analizaron por Western blot. Higo. 3A y B muestra que endógeno vida media p14ARF se baja siguiente MDM2 sobreexpresión.
A las células H1299 fueron falsamente transfectadas (primera carril) o transfectadas con cantidades crecientes de plásmido de expresión de MDM2 (0.3-0.6-0.9 g). Efecto sobre los niveles intracelulares p14ARF se evaluó mediante Western Blot en lisados de proteínas enteras sondadas con anti-ARF y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina. células B HeLa fueron transfectadas de forma simulada o transfectadas con el plásmido de expresión de MDM2 (0,3-0,6 mg) y se analizaron como en
Un
. C Tiempo real cuantificación relativa de la expresión ARF en células HeLa y H1299. Las células fueron transfectadas por electroporación con MDM2 plásmido (4x10
6 células /2,5 g de plásmido de expresión de MDM2) y se sometió a extracción de ARN y análisis de QRT-PCR. los niveles de ARN fueron ARF respecto normalizado a ARN 18s. Los valores en la gráfica representa la media de tres experimentos independientes. se muestran la desviación estándar. D U2OS, E H1299 y F MEF p53
- /- MDM2
- /- células se transfectaron con una cantidad fija de p14ARF que expresa plásmido (0,3 g primero carril) solo o con cantidades crecientes de MDM2 que expresan plásmido (0,3 -0,6 a 0,9 g). Efecto sobre los niveles de p14ARF se evaluó mediante Western Blot en lisados de proteínas enteras, se sondaron con anti-ARF o anti-Xpress (para detectar de forma exógena expresada ARF) y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina. Western Blot se muestran son representativos de al menos tres experimentos independientes. ARF intensidades de las bandas se cuantificaron mediante el software Image J, actina normalizado y se expresaron como pliegue de enriquecimiento respecto a las muestras sin tratar arbitrariamente puestos a 1 (ver Materiales y Métodos para más detalles).
Células
H1299 y HeLa fueron tratados con ya sea MDM2 o control negativo dirigido siRNA (10 nM concentración final) y, después de 72 horas de incubación, recogidos y analizados por Western blot y y QRT-PCR como se describe en Materiales y Métodos.
Media análisis -life en presencia o ausencia de MDM2 sobreexpresión. Las células HeLa fueron transfectadas de forma simulada o transfectadas con el plásmido de expresión de MDM2 (0,6 mg). 24 horas después, se añadió cicloheximida y se cosecharon las células en los puntos de tiempo indicados. Los lisados fueron analizados por Western Blot con anticuerpos anti-ARF, anti-actina y anti-MDM2. La trama B representa el análisis de la vida media de IRA en presencia o ausencia de sobreexpresión de MDM2. Banda intensidades fueron cuantificados por el software Image J actina y normalizado antes de ser trazada en el gráfico. La cantidad de proteína en diferentes puntos de tiempo se expresa como porcentaje de proteína total, es decir, cantidad de proteína en el instante t0. Cada perfil representa la media de tres transfecciones independientes y experimentos Western Blot. También se muestran las desviaciones estándar. células U2OS C se transfectaron con una cantidad fija de p14ARF plásmido de expresión (0,3 g) y cantidades crecientes de plásmido de expresión de MDM2 que se indique (0,3 a 0,6 g). 24 horas después de la transfección, las células se trataron con 10 mM MG132 (carriles 4-6) o DMSO (carriles 1-3). Los niveles de p14ARF se analizaron por Western Blot de lisados de proteínas enteras, sondado con anti-FRA y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina.
A continuación pregunta si el proteasoma participa en MDM2 mediada por la degradación p14ARF. Para explorar esta hipótesis, transfectadas U2OS células con una cantidad fija de p14ARF y cantidades crecientes de MDM2 y células tratadas con el inhibidor de proteasoma MG132. Western Blot en la Fig. 3C muestra consistentemente que el tratamiento con el inhibidor del proteasoma contrarresta el efecto MDM2, lo que indica el proteasoma como el efector final de la acción MDM2 en ARF.
degradación ARF por MDM2 requiere la interacción proteína-proteína
La interacción física entre p14ARF y MDM2 ha sido objeto de estudios intensivos y múltiples dominios de interacción han sido identificados en p14ARF que contribuyen a la unión a MDM2 [14, 17, 23, 24]. Por lo tanto, hemos decidido analizar qué regiones del IRA son necesarias para observar el efecto de MDM2 en p14ARF. por tanto, hemos hecho uso de dos diferentes mutantes de deleción IRA, el IRA
1-65, que abarca el exón 1β de p14ARF y el ARF
65 a 132, correspondiente al exón ARF 2. Co-inmunoprecipitación en células U2OS mostraron que la ARF
1-65 mutante es capaz de interactuar con MDM2 mientras que retiene sólo el exón 2 (ARF
65 a 132) no es (Fig. 4A), lo que confirma un importante papel de 1β exón en la unión MDM2 [23, 24]. Los dos mutantes de deleción de ARF se transfectaron a continuación junto con cantidades crecientes de MDM2. Como la fig. 4B y C muestran claramente, el medio de terminal amino de p14ARF (ARF
1-65) aparece degradada por MDM2 sobreexpresión, mientras que el medio C-terminal (ARF
65 a 132) no se ve afectado, apoyando un papel de la unión entre las proteínas en la degradación mediada por MDM2 ARF.
a U2OS células fueron transfectadas con la misma cantidad (1 g) de MDM2 y, o bien 3xFlagARF
1 a 65 o 3xFlagARF
65-132 expresar plásmidos, como se indica. Cantidades iguales de extracto de proteína se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-MDM2 y revelaron por transferencia de Western con anti-MDM2 y anti-Flag para revelar ARF. células B U2OS se transfectaron con 0,3 g de 3xFlagARF
1 a 65 (que expresa 1β exón de p14ARF) (primera carril) solo o con cantidades crecientes de plásmido de expresión de MDM2 (0.3-0.6-0.9 g). Los niveles de p14ARF se analizaron por Western Blot en lisados de proteínas enteras, se sondaron con anti-ARF y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina. células U2OS C fueron transfectadas con 0,3 g de 3xFLAG ARF
65-132 plásmido (que expresa el exón 2 de p14ARF) (primera carril) solo o con cantidades crecientes de plásmido de expresión de MDM2 (0.3-0.6-0.9 g). Los niveles de p14ARF se analizaron por Western Blot en lisados de proteínas enteras sondadas con anti-ARF y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina. células U2OS D fueron transfectadas con 1 g de tanto ARFΔ
2-14 /82-101 y expresión MDM2 plásmido como se indica. Cantidades iguales de extracto de proteína se inmunoprecipitaron con el anticuerpo anti-ARF y revelaron por transferencia de Western con anti-MDM2 y anti-ARF. células U2OS E fueron transfectadas con 0,3 g ARFΔ
2-14 /82-101 y cantidades crecientes de plásmido de expresión de MDM2 que se indique (0,6-0,9 g). Los niveles de p14ARF endógenos fueron analizados por Western Blot de lisados proteicos enteros probaron con anti-FRA y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina.
Además, se analizó la capacidad de MDM2 a inducir la degradación de un mutante de deleción ARF (ARFΔ
2-14 /82-101) que carecen de las señales de localización nucleolar nucleares /[14]. Curiosamente, este mutante muestra una localización citoplasmática prevalente [14] y retiene la capacidad de unirse (Fig. 4D) y es degradada por la MDM2 (Fig. 4E).
Aparte del papel bien establecido como una ubiquitina ligasa, MDM2 puede afectar recambio de proteínas también a través de un mecanismo independiente de ubiquitina, inducción de una asociación directa de proteínas diana con el proteasoma [22]. Para discriminar entre estas posibilidades, se analizó el efecto de un mutante que carece del dominio MDM2 dedo anular de la ubiquitina ligasa (MDM2
1-441) (Fig. 5A) [25] niveles expresado en forma exógena ARF. Curiosamente, este mutante es capaz de inducir la degradación de ARF cuando se sobreexpresa (Fig. 5B), lo que indica que el dominio de ubiquitina ligasa MDM2 de MDM2 es prescindible para el efecto observado sobre ARF. A continuación, analizamos el efecto de un mutante de deleción MDM2 (MDM2Δ
150-230) (Fig. 5A) que, a falta tanto la importación (NLS) y la exportación señales (NES) de localización nuclear, muestra una localización citoplasmática prevalente [25 ]. Cuando se sobreexpresa en células U2OS, este mutante induce la degradación de forma exógena expresada ARF (Fig. 5C), indicando que la degradación de ARF no requiere localización MDM2 en el núcleo. Co-immunoprecipitation experimentos indican que ambos mutantes MDM2 son capaces de unirse ARF, lo que refuerza la idea de que la unión entre las dos proteínas podrían desempeñar un papel en el efecto observado (Fig. 5D).
El esquema indica MDM2 mutantes descritos en esta figura [25]. células B U2OS se transfectaron con una cantidad fija de p14ARF que expresa plásmido (0,3 g) y cantidades crecientes de MDM2
1-441 que expresa plásmido (0.3-0.6-0.9 g). Los niveles de p14ARF se analizaron por Western Blot en lisados de proteínas enteras sondadas con anti-ARF y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina. células U2OS C se transfectaron con una cantidad fija de p14ARF que expresa plásmido (0,1 g) y cantidades crecientes de MDM2Δ
150-230 plásmido que expresa (0.5-1-1.5-2-2,5-3 g). Los niveles de p14ARF se analizaron por Western Blot en lisados de proteínas enteras sondadas con anti-ARF y, como control, con anti-MDM2 y anti-actina. D células U2OS fueron transfectadas con la misma cantidad (1 g) del plásmido que expresa p14ARF y MDM2
1-441 o MDM2Δ
150-230 plásmido que expresan. Igual cantidad de extracto de proteínas se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-ARF y reveló mediante Western Blot con anticuerpos anti-MDM2 y anti-ARF.
La degradación ARF MDM2 mediada ocurre principalmente en el citoplasma
la evidencia de que un mutante de MDM2, incapaz de localizar en el núcleo, induce la degradación de ARF, junto con la observación de que un mutante de ARF que muestra una localización citoplasmática predominante (ARFΔ
2-14 /82-101) es propenso a MDM2 la degradación mediada, conducir a la sugerencia de que MDM2 degradación inducida ARF sobre MDM2 sobreexpresión puede ocurrir en el citoplasma. Esto nos llevó a verificar la capacidad de MDM2 a degradarse ARF en células tratadas con Leptomycin B (LMB), se sabe que bloquea MDM2 yendo y viniendo al citoplasma [26]. Para este propósito, las células U2OS transfectadas con una cantidad fija de ARF fueron tratados o no con Leptomycin B en presencia o ausencia de MDM2 ectópico. Como se muestra en la Fig. 6A, el tratamiento Leptomycin B no sólo determina la acumulación de IRA, pero, más importante aún, contrarresta el efecto MDM2 en ARF, lo que indica claramente que la localización forzada MDM2 nuclear impide la capacidad de afectar el volumen de negocios p14ARF.
Un U2OS células fueron transfectadas con 0,5 g de plásmido de expresión ARF sola (carriles 1, 2) o en combinación con 1 mg de plásmido de expresión de MDM2 (carriles 3, 4). 24 horas después de la transfección las células se trataron con Leptomycin B (carriles 1 y 3) o metanol (carriles 2 y 4). extractos de células totales se han sometido a transferencia Western y se analizaron con anti-ARF, anti-MDM2 y los anticuerpos anti-actina. células B HeLa fueron transfectadas con cantidades crecientes de plásmido de expresión de MDM2 (1 y 1,5 g). 24 horas después de la transfección, las células se trataron con DMSO, TPA o Bisindolylmalemide y se analizaron con anti-ARF, anti-MDM2 y los anticuerpos anti-actina en Western Blot. células HeLa C fueron transfectadas con siRNA PKCa o un control negativo siRNA (siRNActrl). 48 horas más tarde, las células fueron transfectadas de forma simulada o transfectadas con cantidades crecientes de plásmido que expresa MDM2 que se indique (0,6 y 0,8 g de ADN plásmido). extractos celulares totales se analizaron por transferencia de Western con anti anticuerpos anti-actina ARF, anti-MDM2 y. células U2OS D fueron transfectadas con 0,3 g de cualquiera de ARFT8A o ARFT8D solo (primeros carriles) o en combinación con cantidades crecientes de MDM2 plásmidos de expresión (0.3-0.6-0.9 g). 24 horas después de la transfección extractos celulares se sometieron a transferencia de Western con anti ARF, anti-MDM2 y anti-actina.
se evita la degradación mediada por MDM2 ARF tras la activación de la PKC.
Recientemente demostrado que TPA (un activador conocido de las PKCa enzimas de transducción de señales) los resultados del tratamiento en un incremento de la piscina citoplásmica ARF [11]. Aquí abordamos si la activación de la PKC podría influir en la degradación mediada por MDM2 ARF. Para este propósito se trataron células HeLa, transfectadas con cantidades crecientes de MDM2, ya sea con TPA o Bisindolylmalemide (Bim, un inhibidor de la activación de PKC). Higo. 6B muestra que el tratamiento Bim, como se esperaba, induce una disminución de ARF. Curiosamente, MDM2 sobreexpresión reduce aún más los niveles de ARF en comparación con los controles. Por el contrario, el tratamiento TPA contrarresta principalmente MDM2 inducida por la degradación de p14ARF, lo que sugiere que la vía PKC no debe ser activada para obtener la degradación eficiente ARF MDM2 mediada. Para analizar más a fondo el papel de PKC en la degradación mediada por MDM2 ARF, las células U2OS fueron tratados con PKC α siRNA específico o control de siRNA y se transfectaron con cantidades crecientes de MDM2 (Fig. 6C). La sobreexpresión de MDM2 en las células agotadas SI-ctr induce la degradación de la IRA como se esperaba. Curiosamente, se observa una disminución de los niveles de ARF en el agotamiento del PKC en ausencia de MDM2 sobreexpresión (comparar el carril 5 con el carril 2). Esto está de acuerdo con la observación de que la activación de PKC induce un aumento de los niveles de proteína ARF y PKC inactivación provoca una disminución de los niveles de ARF (Vivo et al., 2013 y la Fig. 6B). En realidad observamos que también los niveles de MDM2 están regulados negativamente por el agotamiento de la PKC, (comparar el carril 5 con el carril 2). Es importante destacar que, de acuerdo con nuestros experimentos anteriores, la sobreexpresión de MDM2 en las células de la PKC empobrecido aún puede reducir los niveles de proteína ARF (compárese el carril 5 con carriles 6 y 7).
Para profundizar más en el interior del papel potencial de fosforilación IRA en MDM2 la degradación mediada por ARF, hicimos uso de dos mutantes puntuales, la ARFT8D y ARFT8A en el que Treonina 8 se ha sustituido, con el fin de imitar, respectivamente, una fosforilados y una forma no fosforilada de ARF [11]. Curiosamente, la forma desfosforilado de ARF (mutante T8A) es muy inestable, con una relativamente corta vida media, mientras que el T8D aparece enriqueció consistentemente en el compartimiento citoplasmático [11].
Ambos mutantes se transfectaron en células U2OS junto con cantidades crecientes de MDM2. Curiosamente, el mutante T8D fosfo-mimético aparece más resistentes a la degradación mediada por MDM2, mientras que el mutante T8A parece más sensible al efecto MDM2 (Figs. 6D y 1D), lo que confirma que la fosforilación ejerce un papel protector en ARF.
Este resultado planteó la hipótesis de que la localización nuclear prevalente de ARF (T8A y proteínas WT) podría ser el resultado de un aclaramiento eficiente de proteína desfosforilado, y por lo tanto inestable, ARF desde el citoplasma. Para explorar esta hipótesis, las células U2OS, transfectadas con el tipo salvaje o proteínas mutantes fueron tratadas con MG132 y distribución subcelular ARF se analizó mediante inmunofluorescencia. Como se muestra en la Fig. 7A y B se observó, tras el tratamiento MG132, un aumento constante de la tinción citoplásmica ARF tanto en WT y las células transfectadas T8A, lo que sugiere, además, que la degradación del IRA se produce predominantemente en el citoplasma. Del mismo modo, Western Blot de extractos nucleares y citoplasmáticos de las células transfectadas U20S, y tratados como los anteriores, muestra un aumento constante de los dos niveles de proteína ARF y ARFT8A wt en el compartimento citoplásmico de la inhibición del proteasoma (Fig. 7C).
a U2OS células fueron transfectadas con 1,5 g de peso, ya sea o mutantes ARF plásmidos que expresan. 16 horas después de la transfección, las células se trataron con DMSO o 10 M MG132 durante 5 horas y se sometieron a IF con el anticuerpo anti-ARF. se muestran imágenes representativas que muestran ARF y mutantes ARF localización subcelular en las células U2OS con o sin tratamiento MG132. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio de fluorescencia Nikon en condiciones de exposición similares. B El histograma, que representa la media de tres experimentos independientes, informa el porcentaje de células transfectadas que muestran cada patrón de localización. También se muestran las desviaciones estándar. El análisis de transferencia Western C de cantidades iguales de ambos citoplásmica (30 g) y nuclear (6 g) extractos de proteínas de células U2OS transfectadas tratadas o no con MG132. Eficiencia de fraccionamiento celular se comprobó con anti-lamina A /C y los anticuerpos anti-tubulina. intensidades de las bandas ARF normalizados, que se muestran debajo de cada banda correspondiente, se expresan como pliegue de enriquecimiento respecto a las muestras sin tratar arbitrariamente puestos a 1 (ver Materiales y Métodos para más detalles).
Discusión
La importancia de la interacción funcional entre ARF y MDM2 salió desde el descubrimiento inicial de que ARF tiene el potencial de actuar como un supresor de tumor mediante la unión a y la inhibición de la p53 antagonista de MDM2. Este conocimiento fue reforzado y refinado durante años a pesar de las controversias relativas a la función de localización nucleolar ARF en este proceso [16, 17, 27]. Por otra parte, la importancia de esta interacción es claro a partir de la observación de que la inactivación /desregulación del eje p53-MDM2-ARF es crucial en el desarrollo de la mayoría de los cánceres humanos. Curiosamente, MDM2 sobreexpresión y la pérdida p14ARF se correlacionan con un fenotipo más agresivo en los tumores humanos de pulmón primario subyacente una relación inversa entre los dos en tumores humanos [28]. Por otra parte, las observaciones anteriores apuntan a un efecto controversial de acción MDM2 en p14ARF: se demostró que la pérdida de Mdm2, o bien podría suprimir [29] o restaurar [14] de la capacidad de ARF p19 murino para inducir la detención del ciclo celular independiente de p53 . Por lo tanto, dependiendo del contexto (tipos celulares, las señales de aguas arriba, el nivel de expresión), Mdm2 podía comportarse bien como un mediador o inhibidor de la función p14ARF sobre la proliferación celular [28]. De todos modos, el primer "repunte" en nuestra forma de ver la relación MDM2 /ARF salió de la observación de que un corto mutante ARF (aa2-29) parecía estabilizado significativamente después de silenciamiento de MDM2 o sobreexpresión de MDMX (un MDM2 relacionados, interfiriendo proteínas), lo que lleva a un modelo en el que la unión al ARF MDM2 hace que, de alguna manera, su suicidio porque lleva en sí a la degradación ( "culpabilidad por asociación modelo") [18]. Nuestro estudio encaja bien con estas observaciones, lo que demuestra que MDM2 aumento intracelular puede, de hecho, causar la destrucción ARF por el proteasoma. Se demuestra que la interacción física entre ARF y MDM2 es necesaria, aunque no suficiente con el fin de observar el efecto, como ARFT8D mutante es capaz de interactuar con MDM2 [11], pero no se degrada. El hecho de que la región de interacción de MDM2 con MDMX (es decir, el dominio de dedo de anillo) es prescindible para este efecto sugiere que, de hecho, esta proteína no está involucrado. Por otra parte, la observación de que el anillo de dedo de dominio ligasa /ubiquitina de MDM2 es prescindible para afectar los niveles de ARF, sugiere que, aunque esto no se puede excluir formalmente, no se requiere la ubiquitinación ARF [8, 9]. Por otro lado, Rodway et al. [18] postula un papel de MDM2 en la mediación de la entrega ARF a la proteasoma sin ningún requisito para la ubiquitinación. Esto probablemente podría estar mediada por la interacción directa MDM2 con el proteasoma [22]. En particular, Mdm2 se ha demostrado que interactúan directamente con varias subunidades del proteasoma a través de ambas regiones N-terminal y C-terminal, mientras que su dominio central (aa200-300) parece ejercer un control regulador negativo en la unión [22]. Nuestra mutantes MDM2 (MDM2
1-441 y MDM2Δ
150-230) retener al menos una de las regiones necesarias para la interacción con el proteasoma y dos de ellos son capaces de inducir la degradación del ARF. Curiosamente, también se observa una reducción ARF más eficiente con la MDM2Δ
150-230 mutante, que carece del dominio central.
Sin embargo, como ARF ubiquitinación no ha sido abordado directamente en el presente estudio, no podemos excluir la intervención de ULF [7] o cualquier otra ubiquitina ligasa aún no identificado en el efecto observado. Sin embargo, mientras ULF mediada por la degradación ARF aparece ejercida en el nucleoplasma, diferentes observaciones en este documento indican que el efecto MDM2 se produce en el citoplasma. En primer lugar, las mutaciones en ambos ARF y MDM2 que obligan a su localización en el citoplasma, no afectan a la degradación mediada por MDM2 ARF. Por otra parte, Leptomycin tratamiento B, que inhibe la exportación nuclear de MDM2, provoca la acumulación de ARF y contrarresta el efecto de la degradación de MDM2 en ARF. Finalmente, los experimentos de inmunofluorescencia demuestran claramente que los resultados del tratamiento MG132 en un aumento de los niveles de ARF en el citoplasma, lo que sugiere fuertemente que, de hecho, la razón por la ARF generalmente no es detectable en este compartimiento subcelular reside en un volumen de negocios más rápida.
se ha de notar que, desde su descubrimiento inicial, IRA fue descrita con un nucleo de localización prevalente /nucleolar. En consecuencia, se ha informado de que un papel protector en los niveles de ARF se ejerce en el nucleolo por B23 /NPM. Por otra parte, la interacción con TBP1, que protege ARF de la degradación del proteasoma, se produce en el núcleo [8].
Más recientemente, ARF ha informado de localizar también en el citoplasma aunque asociado principalmente a las mitocondrias, debido a su papel en la autofagia [30]. Curiosamente, la tinción citoplasmática p14ARF se ha descrito en algunos tipos de cáncer [28].
Por último, recientemente hemos informado de que, tras la activación de la PKC, la proteína ARF es fosforilada y se acumula en el citoplasma [11].
Aquí nos muestran que la activación de la vía de PKC por TPA contrarresta la acción MDM2 mientras que la inhibición de la vía de cualquiera de los tratamientos por Bisindolylmalemide o PKCa dirigido siRNA, provoca una disminución de los niveles de ARF y mejora MDM2 mediada por la degradación de ARF. De acuerdo con ello, el mutante T8D ARF que imita el estado fosforilado de la proteína, aunque más presente en el citoplasma, parece ser menos sensibles al tratamiento MG132 y MDM2 sobreexpresión. Estos datos refuerzan nuestra sugerencia anterior de que la fosforilación ejerce un efecto protector sobre la IRA. Parece que los mecanismos independientes más de una de transcripción están implicados en la regulación de la proteína ARF, es decir, proteasoma degradación mediada [6-8] y la fosforilación.
En general, nuestras observaciones conducen a la hipótesis de que en un entorno oncogénica en MDM2, que se sobreexpresa, los niveles de ARF se mantiene baja debido a una rápida rotación causada por MDM2 provocó la degradación. El aumento de la degradación y /o fosforilación ARF podría por lo tanto ser estrategias comunes que orquestan una célula de escapar rápidamente funciones de supresión del crecimiento ARF ya sea en condiciones fisiológicas o cuando las células se ven obligados a proliferar durante la progresión del cáncer. Son necesarios más estudios para aclarar los mecanismos moleculares que subraya estas observaciones y su relevancia para el desarrollo del cáncer de
in vivo
.
Materiales y Métodos
Las construcciones
pcDNARF , 3xFLAG ARF
1-65, 3xFlagARF
65-132, ARFΔ
2-14 /82-101 fueron descritos en [8]. pcDNAARFT8A y T8D plásmidos se describen en [11]. pCMVMDM2 en peso, pCMVMDM2
1-441, pCMVMDM2Δ
150-230 se describe en [31].
Los cultivos celulares, transfecciones
U2OS, H1299, se adquirieron líneas celulares Hela de las líneas de servicio de telefonía celular (CLS).
MEF
p53 - /- MDM2 - /- línea celular
se describe en [32]. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal (Euroclone, Life Science) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% (v /v) de CO2 en aire.
Células fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technology) [33] o con RNAiMAX (Life Technology) [34] de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
para los experimentos descritos en la fig. 7C, las células U2OS se transfectaron por electroporación usando el sistema de transfección de neón (Life Technology) siguiendo las instrucciones del fabricante.