Extracto
PHB es un oncogén y el tumor supresor reportado en el cáncer gástrico. A continuación, se evaluó si el
PHB
número de copias y el polimorfismo rs6917 afectan su expresión en el cáncer gástrico. El descenso de regulación y regulación de
PHB
fueron observados en los tumores evaluados. La reducción de expresión se asoció con desdiferenciación tumor y el inicio del cáncer. El alelo T del polimorfismo rs6917 se asoció con una reducción
PHB
niveles de mRNA. Por otra parte, la sobre regulación de
PHB
que parecía ser regulada por la ganancia de copias adicionales de genes. Por lo tanto,
PHB
copiar la variación del número y de la expresión diferencial del polimorfismo rs6917 pueden desempeñar un papel en
PHB
regulación transcripcional
Visto:. Leal MF, Cirilo PDR, Mazzotti TKF , Calcagno DQ, Wisnieski F, Demachki S, et al. (2014) La desregulación Prohibitin expresión en el cáncer gástrico se asocia con la región no traducida 3 '1630 C & gt; T polimorfismo y número de copia variación. PLoS ONE 9 (5): e98583. doi: 10.1371 /journal.pone.0098583
Editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Febrero, 2014; Aceptado: 5 Mayo 2014; Publicado: 30 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Leal et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior (CAPESP), Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq; RC, MACS y RRB) y la Fundación de Amparo a la Investigación del Estado de São Paulo (FAPESP; MFL, PDRC y DQC ) en forma de subvenciones y becas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. RC es un editor académico de PLOS ONE. Los otros autores han declarado que no existen intereses en competencia para ellos. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
El cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de los importantes avances en el estudio de la GC, las alteraciones moleculares implicados en la carcinogénesis gástrica siguen siendo desconocidos.
El cromosoma 17 es uno de los cromosomas más comunes que presentan aberraciones numéricas en GC (véase la revisión [2]). Nuestro grupo ha informado anteriormente la presencia de aneuploidía del cromosoma 17, las ganancias y las pérdidas, en el GC en las personas en el norte de Brasil [3], [4], [5], [6] y en todas las líneas celulares GC establecidas a partir de las neoplasias en este población [7], [8]. Por lo tanto, este cromosoma puede contener importantes genes implicados en la carcinogénesis gástrica.
El prohibitina-1 (
PHB
) mapas de genes del cromosoma 17q21 al locus. Este gen codifica una proteína ubicua, evolutivamente conservado que se encuentra en una amplia gama de organismos, incluyendo bacterias, plantas, levaduras, protozoos y los mamíferos [9]. PHB fue pensado originalmente para desempeñar un papel central en la inhibición de la progresión del ciclo celular. Más recientemente, PHB se ha caracterizado como una chaperona que participan en la estabilización de las proteínas mitocondriales; Por lo tanto, PHB ha sido implicado en varios procesos celulares, incluyendo la regulación de la proliferación, la apoptosis y la transcripción de genes [10].
PHB parece jugar un papel en el desarrollo de diferentes tipos de cáncer. La sobreexpresión de PHB se ha informado en el cáncer del cuello del útero, esófago, mama, pulmón, vejiga, tiroides, ovario y próstata. En contraste, la reducción de la expresión de PHB se ha observado en gliomas, y las mutaciones somáticas en
PHB
se han detectado en cánceres de mama esporádicos [9]. Además, un polimorfismo de nucleótido único funcional (SNP) en el
PHB
gen, el cambio de una citosina para una timina en la posición 1630 en el 3 'UTR (rs6917), crea una variante que carece de actividad antiproliferativa [11] , [12] y, posteriormente, puede aumentar el riesgo de crecimiento maligno. El alelo T de este SNP se ha asociado con un mayor riesgo de cáncer de mama [13] y melanoma [14]. Por lo tanto, el papel de PHB en la proliferación del cáncer y /o supresión sigue siendo controvertido.
El papel de PHB en la carcinogénesis gástrica no ha sido completamente aclarada. Algunos estudios previos han descrito aumento de la expresión de PHB en muestras de GC [15], [16], [17], [18] y el suero de pacientes con cáncer gástrico [19]. Sin embargo, otros estudios han informado de PHB baja regulación de este tipo de cáncer [20], [21]. La investigación de los mecanismos moleculares implicados en la regulación transcripcional de
PHB
puede proporcionar nuevos conocimientos sobre su papel en GC y ayudar al desarrollo de nuevos tratamientos contra el cáncer.
En este estudio, se evaluó la primera la expresión del ARNm y la proteína de PHB en GC y muestras de tejido gástrico no neoplásicas emparejados. Además, las posibles asociaciones entre los
PHB y las características clinicopatológicas fueron investigados. Debido a que el
PHB
gen se localiza en una región cromosómica implicada con frecuencia en aberraciones numéricas en GC [2], también se evaluó la
PHB
número de copias en las muestras tumorales. Por otra parte, la expresión específica de alelo de
PHB
ARNm se evaluó para investigar la transcripción relativa de cada alelo en sujetos heterocigotos con el polimorfismo rs6917 como un posible mecanismo implicado en
regulación de PHB
. Hasta donde sabemos, ningún estudio previo ha evaluado
PHB
número de copias y la expresión específica de alelos en muestras de tumores.
Materiales y Métodos
Muestras de Tejido
Cuarenta y ocho pares de muestras de GC y las correspondientes muestras de tejido gástrico no neoplásicas (& gt; 5 cm desde el borde del tumor) se utilizaron para evaluar
PHB
la expresión de ARNm y el genotipo SNP rs6917. En 38 de estas muestras de GC, el
PHB
copia también se evaluó número. PHB inmunorreactividad se evaluó en 12 muestras de GC.
Todas las muestras gástricas se obtuvieron de pacientes que se sometieron a gastrectomía por GC el Hospital Juan de Barros Barreto Universidad (HUJBB) en el norte de Brasil. Todos los pacientes tenían antecedentes negativos de la exposición a la quimioterapia o la radioterapia antes de la cirugía, y no había co-ocurrencia de otros tipos de cáncer diagnosticados. consentimiento informado por escrito con la aprobación del comité de ética de HUJBB se obtuvo.
Una parte de cada muestra de tumor fue diseccionado fijado en formol e incluidas en parafina (FFPE). Secciones de tejido FFPE se tiñeron con hematoxilina-eosina para la evaluación histológica o se utilizan para el análisis de inmunohistoquímica (IHC). Las porciones adicionales de cada tumor y muestra de tejido no neoplásicas pareados se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta la purificación de ácidos nucleicos.
Todas las muestras fueron clasificadas de acuerdo con Lauren [22], y los tumores se clasifican de acuerdo a los criterios TNM de estadificación [23].
ADN y purificación de ARNm
ADN total y el ARNm se simultáneamente aisladas de muestras de tejido gástrico utilizando un /RNA Kit DNA AllPrep /Protein (Qiagen, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de ADN y ARN y la calidad se determinaron usando un espectrofotómetro NanoDrop (Kisker, Alemania), y la integridad del ARN se determinó por electroforesis en gel.
Expresión génica PHB
PHB
expresión se evaluó mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR). En primer lugar, el ADN complementario (ADNc) se sintetizó usando un cDNA Archivo kit de alta capacidad (Applied Biosystems, Polonia) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Análisis en tiempo real de RT-qPCR se realizó utilizando QuantiFast SYBR Green Master Mix (Qiagen, Alemania) en una máquina de PCR 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems, EE.UU.). Los siguientes cebadores (150 nM cada uno) fueron diseñados para la amplificación por RT-qPCR:
PHB
F5'-GTGTGGTTGGGGAATTCATGTGG-3 'y R5'-CAGGCCAAACTTGCCAATGGAC-3';
ACTB
F5'-AGAAAATCTGGCACCACA-3 'y R5'-AGAGGCGTACAGGGATAG-3'. Todas las reacciones se realizaron por triplicado tanto para el gen diana y el control interno (
ACTB
).
PHB
expresión se normalizó a
ACTB
expresión. La abundancia de la expresión de mRNA se ajustó por la eficiencia de amplificación (
PHB
= 99%,
ACTB
= 102%) [24]. Una muestra de tejido gástrico no neoplásica fue designado como un calibrador para cada tumor se combina para calcular la cuantificación relativa (RQ) [24].
Protein Expression PHB
Las secciones de parafina fueron sometidas a IHC . secciones de tejido tumoral (3 o 4 mm de espesor) se deparaffinized en xileno y rehidratada en una serie de etanol. Recuperación del epítopo se realizó en tampón citrato, pH 6,0, en el calor húmedo en una olla a presión. A continuación, las secciones de tejido se incubaron con un anticuerpo primario monoclonal de ratón contra PHB (II-14 a 10, la dilución 1:100; ThermoFisher Scientific, EE.UU.). Sitios de inmunorreactividad se visualizaron utilizando un kit de detección SuperPicTure Polymer (Invitrogen, EE.UU.). Las diapositivas fueron vistos por microscopía óptica usando un microscopio Nikon Eclipse E600 (Nikon, EE.UU.) equipado con una cámara digital Nikon DSM1200F (Nikon, EE.UU.). Se seleccionó la región no manchado (región blanca) y se establece como el fondo. Cualquier tinción se considera un resultado positivo, independientemente de la intensidad. Los controles negativos, en los que el anticuerpo primario fue reemplazado por 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se incluyeron en todas las series, y las secciones de tejido de próstata humana normal se utilizaron como controles positivos.
PHB
copia Número
para evaluar las variaciones del número de copias (CNV), el procedimiento PCR cuantitativa se realizó mediante ensayos cuantitativos de la CNV TaqMan (Life Technologies, EE.UU.) para el
PHB
gen (Hs00178432_cn) y para el control interno
ARNasa P gratis (# 4403326). qPCR reacciones multiplex se realizaron por cuadruplicado con ADNg acuerdo con el protocolo de ciclismo y condiciones del fabricante de una forma rápida máquina de PCR en tiempo real 7500 (Life Technologies, EE.UU.). El número relativo de copias de cada muestra se calculó utilizando Copia de llamadas Software V1.0 (Life Technologies, EE.UU.). gDNAs comerciales humanos (G1471 y G1521; Promega, EE.UU.) se utilizaron para la calibración
PHB
Genotipado
ADN a partir de muestras no neoplásicas se utilizó para
PHB.
genotipado. Los sujetos fueron genotipo para el polimorfismo rs6917 utilizando sondas y cebadores Custom TaqMan SNP (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los siguientes cebadores y sondas MGB fue diseñada para la discriminación alélica: cebadores F5'-TTGGTCCCTCTCAGATACCCA-3 'y R5'-CCGTGAGAAGGGCAGTCTCT-3'; sonda marcada con FAM 5 'CTGCCAAAGACGTGT-3'; y la sonda 5'-CTGCCAAAGATGTGT-3 'alelo menor VIC-etiquetado.
PHB
alelo-específicas expresión Expresión
El alelo-específica se determinó en primer lugar por la secuenciación. Veinte a 40 ng de DNA o cDNA se utilizó como molde para la amplificación por PCR con los cebadores utilizados para
PHB
genotipado. Antes de la secuenciación, los productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, y la banda específica se extrajo y se purificó. La secuenciación se realizó usando el cebador directo usado para la amplificación PCR y un kit BigDye Terminator Cycle Sequencing v3.1 (Applied Biosystems, EE.UU.). productos de secuenciación se separaron usando un ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, EE.UU.). Algunas de las muestras se analizaron al menos dos veces, incluyendo distintas RT-PCR y ensayos de secuenciación.
El alélica niveles de expresión se determinaron usando software PeakPicker [25]. El software se utiliza para realizar una primera etapa de normalización, en el que la altura alelo SNP se comparó con la altura de los picos de referencia en las secuencias flanqueantes. Hemos limitado el paso de normalización dentro de una ventana de 21-base. valores de relación de por encima de 1 se transformaron a /(ratio) 1 para transformar todos los valores de una escala de 0-1, y los valores se ajustaron a la media de las relaciones de intensidad de pico de una muestra de ADN heterocigoto referencia para el polimorfismo rs6917. El ADN genómico de heterocigotos (N = 3) y muestras homocigóticas (N = 3, para el genotipo CC; N = 2, por genotipo TT) se utilizó para validar el análisis y para confirmar las proporciones alélicas de 50:50 y 0:100, respectivamente. Además, cDNA a partir de muestras de tejido (tumorales y no tumorales especímenes) de los dos sujetos homocigotos para el alelo menor en el polimorfismo rs6917 también se utilizaron como controles.
alelo-específica
PHB
expresión también se evaluó en muestras heterocigóticas por RT-qPCR, como se describe anteriormente [26]. El uso de un ensayo de genotipificación de SNP TaqMan personalizada para
PHB
genotipado, que generó una curva de regresión lineal para la intensidad de fluorescencia log10
vs
la relación log10 alélica en base a la dilución en serie de CC y TT genotipo ADN genómico de muestras de control (muestras de dos individuos homocigotos) en varias proporciones (CC: TT 08:01, 04:01, 02:01, 01:01, 01:02, 01:04, 01:08) por RT -qPCR (Figura 1A). La relación alélica de la expresión génica se extrapoló por la intersección de la log10 de FAM: intensidad VIC en la curva estándar. ROX (colorante de referencia interna) y FAM no específica y la fluorescencia VIC se normalizó en todos los análisis. Todas las reacciones se realizaron por duplicado.
A) El registro
10 de la relación de intensidad FAM /VIC para
PHB
trazan en función del registro
10 de FAM /VIC alelo proporción de la mezcla de ADN homocigotos en diferentes proporciones (08:01, 04:01, 02:01, 01:01, 01:02, 01:04, 01:08 FAM /VIC alelo). B)
PHB
expresión del genotipo rs6917 en las muestras gástricas. C) C /razón alélica T en cDNA a partir de muestras gástricas de pacientes heterocigotos por secuenciación; D) relación alélica FAM /VIC en muestras gástricas de pacientes heterocigotos utilizando un ensayo de encargo de genotipificación TaqMan, en el que una sonda específica para el alelo C se marcó con colorante FAM y una sonda alelo T menor se marcó con colorante VIC. * Expresados diferencialmente entre los grupos mediante la prueba t para muestras independientes,
P
. & Lt; 0,05
En las muestras de cDNA heterocigóticos, proporciones alélicas & lt; 0,8 o & gt; 1,2 eran considera indicativo de la expresión específica de alelo.
análisis estadístico
para el análisis de la expresión de ARNm, se evaluó por primera vez la hipótesis de que los datos tenían una distribución normal mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para determinar la adecuada pruebas para comparaciones estadísticas posteriores. El
PHB
niveles de mRNA fueron no distribuyen normalmente y se transformaron (z-score) para su análisis. Observaciones & gt; 2 o & lt; -2 fueron considerados valores atípicos y excluidos de los análisis. Se realizó una prueba t pareada para comparar la media
PHB
expresión entre las muestras no tumorales y tumorales. La prueba t para muestras independientes y ANOVA de una vía seguido por la prueba post-hoc de Games-Howell se utilizaron para evaluar las posibles asociaciones entre los
PHB
expresión y las características clínico-patológicas, la inmunorreactividad de la proteína, el número de copias de genes y genotipos . La prueba de Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher se utilizó para evaluar la relación entre el
PHB
número de copias y la inmunorreactividad y los factores clínico-patológicos. de correlación de Pearson se utilizó para evaluar una posible correlación entre la secuencia y el ensayo de TaqMan para el análisis de la expresión específica de alelo. En todos los análisis,
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
PHB
expresión mRNA en tumores gástricos
PHB
expresión no fue diferente entre las muestras gástricas no neoplásicas y neoplásicas emparejados (0,173 ± 0,255
vs
0,227 ± 0,297,
P = 0,149
). Sin embargo, los niveles de mRNA se redujeron al menos 1,5 veces en 20 (45,5%) de las muestras de GC y aumentaron en 9 (20,5%) en comparación con muestras de tejido gástrico no neoplásicas pareadas.
La Tabla 1 muestra las asociaciones entre
PHB
expresión y las características clinicopatológicas, así como el número de la inmunorreactividad de proteínas, genotipo rs6917 y de copias de genes. tumores mal diferenciados presentaron reducción de
PHB
expresión en comparación con los tumores moderadamente diferenciados (
P = 0,029
, Tabla 1). Sin embargo, tanto GC pobremente diferenciado (0,025 ± 0,022
vs
0,239 ± 0,303;
P Hotel & lt; 0,001, ANOVA seguido de la prueba post-hoc de Games-Howell) y moderadamente diferenciado GC (0,057 ± 0,051
vs
0,239 ± 0,303;
P Hotel & lt; 0,001, ANOVA seguido de los de Games-Howell prueba post-hoc) presentaron reducción de
PHB
expresión en comparación con la no neoplásicas muestras de tejido gástrico
Reducción de
PHB
expresión se asoció con la invasión más baja (
P = 0,002
, Tabla 1). y la ausencia de metástasis en los ganglios linfáticos (
P = 0,040
, Tabla 1). Además, a principios de GC presentaron reducción de
PHB
expresión en comparación con GC avanzada (
P = 0,002
, Tabla 1). Además, sólo temprano GC presentó una reducción significativa de
PHB
los niveles de mRNA en comparación con las muestras no neoplásicas (0,044 ± 0,027
VS
0,239 ± 0,303,
P
& lt; 0,001, ANOVA seguido de la prueba post-hoc de Games-Howell).
PHB inmunoreactividad en tumores gástricos
inmunotinción de la proteína se observó en todas las muestras tumorales evaluadas por IHC (Tabla 2). En todos los casos, se detectó inmunorreactividad de PHB en las células neoplásicas y no neoplásicas, incluyendo metaplásico intestinal y células inflamatorias (Figura 2A-H). PHB se expresa principalmente en el citoplasma. La intensidad de la tinción y el porcentaje de células inmunorreactivas variaron entre los casos estudiados (Tabla 2). Las muestras que presenten & lt; 80% de las células tumorales con inmunorreactividad PHB demostraron una reducción de la expresión de ARNm (
P = 0,036
, Tabla 1)
A) PHB manchas en la mucosa gástrica normal (400x).; B) inmunoreactividad PHB en la mucosa gástrica normal y células inflamatorias (400x); C) una fuerte tinción de PHB en células de metaplasia intestinal (400x); D) una fuerte tinción PHB en un tumor de tipo intestinal; E) de moderada a intensa inmunorreactividad PHB en un tumor pobremente diferenciado; F) de moderada a intensa inmunorreactividad PHB en un tumor moderadamente diferenciado; G) débil tinción de PHB en un tumor moderadamente diferenciado (400x); D) débil tinción de PHB en un tumor de tipo difuso (400x).
PHB
número de copias en tumores gástricos
PHB
se amplificó en 13 de 38 tumores (34,2%), incluyendo 2 muestras con 4 copias. No se presentó un tumor
PHB
eliminación. Curiosamente, 3 muestras que presentaron valores atípicos para
PHB
la expresión de ARNm también presentaron amplificación de genes. Por lo tanto, cuando los valores atípicos se incluyeron en el análisis,
PHB
expresión fue mayor en las muestras con amplificación del gen que en aquellos sin amplificación de genes (mediana ± rango intercuartílico: 0,344 ± 0,335
vs 0,047 ±
0,07;
P = 0,003
, no paramétrico de Mann-Whitney; Figura 3).
PHB
ganancia se asoció con la aparición tardía en comparación con GC GC de aparición temprana (
P = 0,022
; Tabla 2). No se encontró asociación entre el
PHB
número de copias y la proteína inmunoreactividad o cualesquiera otras características clinicopatológicas se encontró (Tabla 3).
Las líneas muestran la mediana y rango intercuartil de
PHB
expresión. * Expresados diferencialmente entre los grupos mediante la prueba de Mann-Whitney,
P
. & Lt; 0,05
PHB
Expresión del alelo-específica
también investigamos si la presencia del alelo menor en rs6917 se asoció con la desregulación de la expresión génica en pacientes GC. En nuestra muestra, 11 de 48 pacientes (22,9%) eran heterocigotos y 2 pacientes (4,17%) eran homocigotos para el alelo menor en el polimorfismo rs6917. Todas las muestras con el alelo T presentó 2 copias de la
PHB
gen. La presencia del alelo T en el polimorfismo rs6917 se asoció con una reducción
PHB
expresión en GC (
P
& lt; 0,001; Tabla 1; Figura 1B) y en muestras no neoplásicas (media ± SD:. 0,302 ± 0,325
vs
0,045 ± 0,043;
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1B)
Un par de muestras heterocigóticas (tumoral y no tumoral) no se utilizó para el análisis de la expresión específica de alelo. Se detectó una correlación entre la relación alélica del polimorfismo rs6917 determinado mediante secuenciación y el ensayo TaqMan (
P
= 0,003; r = 0,627). Por secuenciación, aproximadamente el 50% de los casos presenta diferencial de expresión alélica (Figura 1C). Sin embargo, el ensayo TaqMan mostró que los alelos T y C presentan la expresión alélica diferencial en la mayoría de los pacientes (Figura 1D). El grado de diferencia en la expresión entre los dos alelos variaron entre los individuos. El T a C ratio de expresión alélica fue similar en la mayoría de los pares de muestras tumorales y no tumorales. Sólo un paciente presentó una mayor proporción C /T, tanto en muestras tumorales y no neoplásicas en ambos ensayos. En la mayoría de los casos, se detectó una relación C /T inferior independientemente de la metodología aplicada (Figuras 1C y 1D). No se detectó ninguna asociación entre la expresión alélica diferencial y la edad de inicio o cualquier otra variable clínico-patológica.
Discusión
PHB parece ser esencial en la homeostasis celular. Estudios recientes han sugerido que PHB puede actuar como un factor pro-tumorigénicos y anti-tumorigénico en varios tipos de células (véase la revisión [10]). En el presente estudio, la proteína y ARNm de perfiles de expresión de PHB presentaron un patrón heterogéneo entre las muestras tumorales. Aunque no hemos encontrado una diferencia significativa entre las muestras de GC y no neoplásicas emparejados, se observó que el nivel de mRNA se redujo de 1,5 veces en el 45,5% de las muestras de GC y aumentó en un 20,5% de los tumores. La expresión del ARNm de la reducción se debió en parte a una frecuencia reducida de las células tumorales que presentan inmunorreactividad PHB, que pone de manifiesto la heterogeneidad entre los clones de células tumorales.
Liu et al. [21] se describe la expresión de ARNm reducida en cuatro tumores gástricos en comparación con sus correspondientes tejidos normales, lo que corrobora en parte, nuestros resultados. Apoyando un papel anti-tumorigénico, PHB bloquea la entrada en fase S [27]. Además, los de tipo salvaje rs6917
PHB
solo 3'UTR es capaz de inhibir la progresión del ciclo celular [11], [28] y el crecimiento del tumor [12], así como reducir la movilidad celular [29]. Además, PHB juega un papel en el mantenimiento de la función mitocondrial y morfología normal [30]. Se ha sugerido que la pérdida de expresión PHB mitocondrial (localización citoplasmática, como se observa en nuestras muestras) podría dar lugar a la proteolisis acelerada de proteínas de la membrana y la función de la cadena respiratoria mitocondrial [10] deteriorar. Nuestro estudio proteómico anterior mostró que varias proteínas implicadas en las rutas del metabolismo energético (disfunción mitocondrial, el metabolismo de piruvato, la fosforilación oxidativa, círculo citrato, la glucólisis /gluconeogénesis) fueron desregulados [31] y sugirió que las funciones mitocondriales prominentes pueden ser alterados, cambiando la producción de energía en GC células y sugiere que el efecto Warburg [32].
a nuestro entender, pocos estudios han evaluado la posible asociación entre el
PHB
niveles de mRNA y el polimorfismo rs6917. En un estudio, Tang et al. no observaron una asociación significativa entre el polimorfismo rs6917 y la expresión de ARNm en líneas celulares linfoblásticas incluidos en la base de datos HapMap [33]. Sin embargo, estos autores informaron que el alelo T se asoció con un mayor riesgo de cáncer de mama. En el presente estudio, hemos demostrado que la presencia del alelo T en el polimorfismo rs6917 se asoció con una reducción
PHB
expresión en células gástricas no neoplásicas y neoplásicas. El polimorfismo rs6917 se encuentra en el 3'UTR y está presente sólo en la isoforma 1 de PHB, que fue detectado en el presente estudio mediante secuenciación de ADNc y un ensayo de TaqMan. El 3'UTR contiene múltiples
cis CD - y
trans
-elementos, y estas estructuras tienen una amplia influencia sobre la traducción de ARNm, la estabilidad y la localización subcelular [34] [35], [36, ]. La variante T crea un potencial sitio de unión para los microARN miR-tiene-1292 y tiene 886-5p-(http://snpinfo.niehs.nih.gov/cgi-bin/snpinfo/mirna.cgi?2_rs6917), lo que puede alterar la expresión génica por cualquiera de mRNA decaimiento o la traducción. Otros microRNAs se asociaron previamente con la regulación de los
PHB
expresión en GC. Liu et al. [21] han informado de que
PHB
está regulada por el miR-27a, que es comúnmente hasta reguladas en GC. Los autores sugieren que la baja regulación de
PHB fotos: por este microARN puede explicar por qué la supresión de miR-27a puede inhibir el crecimiento de células GC. Además, la 3'UTR de
PHB
codifica un ARN antisentido (gen ENSG00000250186; HABANA http://www.sanger.ac.uk/). La presencia del alelo raro en el ARN antisentido puede modificar la estructura secundaria y reducir el kcal /mol en comparación con la secuencia de tipo amplio uso de software 4.0 CLC RNA Workbench (datos no mostrados). Por lo tanto, el polimorfismo rs6917 puede conducir a
PHB
baja regulación mediante la creación de nuevos sitios diana microARN o a través de su regulación por parte del ARN antisentido en las células gástricas, lo que contribuye a la carcinogénesis gástrica.
En nuestro muestras, la mayoría de los pacientes heterocigotos presentó un aumento de la expresión del alelo T en comparación con el alelo C. La diferencia en los niveles de ARNm relativos de los dos alelos podría ser el resultado de diferencias en la transcripción o la estabilidad del ARNm, y muestran que este polimorfismo presenta un
cis
efecto en las células gástricas. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para evaluar el diferencial
PHB
expresión específica de alelos en muestras de tumores. Estudios anteriores han demostrado que un
variante PHB
con el alelo T en la posición 1630 en el 3'UTR carece de capacidades de supresión de crecimiento anti-proliferativas y tumorales in vitro y en modelos animales [29]. Por lo tanto, la presencia del alelo T, en particular cuando se presenta una expresión elevada en relación con el alelo C, puede inducir un "efecto de esponja" para los reguladores post-transcripcionales, como miRNAs y contribuir a la proliferación de células gástrico, lo que predispone los individuos heterocigotos a GC.
el posible efecto de
PHB
baja regulación - debido al polimorfismo rs6917, por ejemplo - el riesgo de CG está de acuerdo con las asociaciones entre la reducción de
PHB
ARNm y menor invasión, la falta de metástasis en los ganglios linfáticos y GC en etapa temprana. Hasta donde sabemos, ningún estudio previo en la literatura ha evaluado la posible asociación entre el
PHB
de expresión y GC factores pronósticos. Estos hallazgos sugieren que
PHB
baja regulación puede ser necesario para la iniciación del tumor.
Sin embargo, los estudios proteómicos anteriores han informado de PHB regulación al alza en los tumores gástricos [15], [16], [17] . Además, Kang et al. [18] han informado de la sobreexpresión de la proteína y el ARNm de PHB en GC (en comparación con los tejidos normales adyacentes gástricas) en individuos asiáticos. En nuestra muestra, el 20,5% de los tumores también se presentó un aumento
PHB
expresión. PHB parece jugar un papel en la proliferación celular, la adhesión y la migración y, por lo tanto, en la progresión de la transformación maligna a través de RAS-RAF señalización [37]. Nuestra hipótesis es que un aumento de
PHB
nivel de ARNm se requiere para la progresión de la GC. La evaluación de muestras humanas sólo permite la investigación de un solo punto de tiempo (en el momento de la reparación quirúrgica); por lo tanto, no somos capaces de evaluar la regulación dinámica de la expresión génica. Sin embargo,
PHB
expresión es más probable en relación con el contexto celular y molecular de fondo de las células gástricas.
Kang et al. [18] han informado de que la proteína de PHB y la expresión del ARNm difieren entre GC diferenciada moderadamente y mal y que solamente los tumores pobremente diferenciados presente sobreexpresión de PHB en comparación con las muestras no neoplásicas. En nuestra muestra, pocos tumores se clasificaron de acuerdo con el grado de diferenciación. Sin embargo, se observó que tanto los tumores poco diferenciados y moderadamente presentaron reducción de
PHB
expresión en comparación con las muestras no neoplásicas y que los
PHB
niveles de mRNA fueron menores en los tumores pobremente diferenciados. Por lo tanto, en nuestras muestras,
PHB
expresión parecía disminuir con la desdiferenciación del tumor. Investigaciones adicionales son necesarias para una mejor comprensión del papel de PHB en el proceso de diferenciación de las células gástricas normales y neoplásicas.
En este estudio, se observó que el 34,2% de los tumores de copias de
PHB
adquirida. Las alteraciones en el cromosoma 17 se han asociado con la progresión del tumor y el potencial maligno en GC primario [38], [39]. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que utiliza una técnica precisa y robusta para evaluar la
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número de copias en las muestras de GC. Se observó una asociación entre
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número de copias y los niveles de ARNm, que revela un efecto cis-dosis de CNV en los niveles de expresión génica. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que CNV es un elemento importante en la conducción de aguas abajo
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transcripción en algunos tumores gástricos. Este mecanismo genético, observada principalmente en GC de inicio tardío, puede contribuir para el
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papel como oncogén. Este hallazgo también resaltar que varios mecanismos pueden conducir a
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desregulación en las células de GC.
El aumento de los
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número de copias se asoció con GC de inicio tardío. Se han descrito diferencias entre clinicopatológicas de inicio temprano y GC de inicio tardío [40], [41], [42], pero se sabe poco sobre los cambios genéticos asociados con la edad de inicio de GC [2]. Buffart et al. [43] demostraron previamente que los pacientes jóvenes y ancianos pertenecen a grupos con diferentes perfiles genómicos. La amplificación de la
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destaca la heterogeneidad de GC.
La principal limitación de este estudio es su relativamente pequeño tamaño de la muestra. Por lo tanto, algunos análisis estadísticos presentados reduce la potencia para detectar diferencias significativas entre los grupos, probablemente debido a la gran heterogeneidad entre las muestras. Por lo tanto, los resultados falsos negativos pueden haber ocurrido. Las evaluaciones adicionales son todavía necesarios para evaluar el papel de los
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en la carcinogénesis gástrica y su regulación transcripcional.
En conclusión, tanto la baja regulación y la regulación de
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se puede observar en GC. La reducción de
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expresión parece estar implicado en el proceso de desdiferenciación tumor y el inicio del cáncer. El alelo T en el
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rs6917 polimorfismo puede contribuir a la reducción observada en
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los niveles de ARNm y por lo tanto contribuir al riesgo de GC. Sin embargo,
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regulación parece estar regulada por número de copias del gen. Expresión diferencial del polimorfismo rs6917 en las muestras gástricas se informó por primera vez, y esta variación puede desempeñar un papel en la regulación de los
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expresión.