Extracto
subtipos moleculares de cáncer de ovario seroso se han descrito recientemente. Utilizando datos de conjuntos de datos independientes, incluyendo más de 900 muestras de tumores primarios, se muestra que la desregulación de la
let-7
vía se asocia específicamente con el subtipo molecular C5 de cáncer de ovario seroso. el número de copias de ADN y la expresión génica de
HMGA2
, alelos de
Let-7
,
Lin28
,
LIN28B
,
MYC
,
MYCN
,
DICER1
, y
RNASEN
se midieron utilizando microarrays y PCR transcriptasa inversa cuantitativa. La inmunohistoquímica se realizó en 127 muestras utilizando microarrays de tejidos y anticuerpos anti-HMGA2. La fluorescencia de hibridación in situ de cromosomas artificiales bacterianos hibridadas a 239 tumores de ovario se utilizó para medir la translocación en el
LIN28B
locus. ARN de interferencia corta caída en las líneas de células de ovario se utilizó para probar la funcionalidad de las asociaciones observadas. Cuatro subtipos moleculares (C1, C2, C4, C5) de los cánceres de ovario seroso de alto grado estaban representados robustamente en cada conjunto de datos y mostraron patrón similar de supervivencia del paciente. Encontramos la activación altamente específico de una vía que implica
MYCN
,
LIN28B
,
Let-7
y
HMGA2
en el subtipo molecular C5 definido por
MYCN
amplificación y sobreexpresión, la sobre expresión de
MYCN
objetivos, incluyendo el
Let-7
represor
LIN28B
, pérdida de
Vamos -7
expresión y
HMGA2
amplificación y sobreexpresión.
DICER1
, un conocido
Let-7
objetivo, y
RNASEN
estaban sobreexpresados en tumores C5. No vimos ninguna evidencia de translocación en el
LIN28B
locus C5 en los tumores. La interacción entre informado
LIN28B
y
let-7
se ha recapitulado por siRNA desmontables en líneas celulares de cáncer de ovario. Nuestros resultados asociado desregulación de los
MYCN
y aguas abajo objetivos, entre ellos
Let-7
y los genes oncofetales, con cáncer de ovario seroso. Definimos por primera vez cómo los elementos de una vía oncogénica, que implica múltiples genes que contribuyen a frenar la renovación celular, se altera específicamente en un subtipo molecular de cáncer de ovario seroso. Mediante la definición de los conductores de un subtipo molecular de los cánceres de ovario seroso proporcionamos una nueva estrategia para la intervención terapéutica dirigida
Visto:. Helland Å, Anglesio MS, George J, Colin PA, Johnstone CN, Casa CM, et al . (2011) La desregulación de los
MYCN
,
LIN28B
y
let7 Hoteles en un subtipo molecular de estrategias agresivas de alto grado de cánceres de ovario seroso. PLoS ONE 6 (4): e18064. doi: 10.1371 /journal.pone.0018064
Editor: Patrick Tan, Duke-Universidad Nacional de Singapur Escuela de Medicina de Graduados, Singapur
Recibido: 18 Noviembre 2010; Aceptado: February 18, 2011; Publicado: 13 Abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Helland et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. AOCS era la investigación apoyada por el ejército de Estados Unidos médica y de Material Command bajo DAMD17-01-1-0729, The Cancer Council Tasmania, la Fundación de cáncer de Australia occidental y el Consejo Nacional de Salud e Investigación médica de Australia. Esta investigación fue apoyada por una beca de estilo victoriano Ciencias de la Vida Iniciativa de Computación (VLSCI) de su Fondo de pico Computación de la Universidad de Melbourne, una iniciativa del Gobierno de Victoria, y también por becas de la Fundación Radium Hospital y la Fundación Fredriksen para la Investigación del Cáncer de Ovario . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El tratamiento del cáncer de ovario está en transición. Es cada vez más evidente que el cáncer de ovario es una compleja serie de tipos de tumores distintos [1], que requieren terapias que se dirigen a características moleculares comunes a los subtipos de la enfermedad. cánceres ováricos serosos de alto grado (HG-SOC) representan la mayoría de las muertes relacionadas con la enfermedad. Mientras que las tasas de respuesta son elevados a la quimioterapia adyuvante basada en platino-taxanos, ha habido pocas mejoras en la supervivencia del paciente durante la última década o más, a pesar de una amplia investigación clínica [2]. Los inhibidores de PARP que explotan las deficiencias en la reparación de recombinación homóloga [3], [4] han mostrado una promesa considerable, sobre todo en las mujeres con germinal
BRCA1
o
BRCA2
mutaciones. HG-SOC es tratada como una única entidad. Una comprensión más profunda de los conductores moleculares de esta enfermedad es esencial si se van a desarrollar terapias más eficaces [2]. Recientemente, perfiles de expresión génica reveló la diversidad dentro de poco apreciado HG-SOC delineando cuatro subtipos moleculares distintos. Un subgrupo (C1) se define por una firma estroma reactivo, en correlación con amplia desmoplasia en tales muestras. Los tumores con la firma C2 se caracteriza por la infiltración intra-tumoral de las células inmunes, mientras que los tumores C4 tenían una expresión relativamente baja de genes del estroma y altos niveles de CA125 circulante. El subtipo C5 refleja una expresión genética de células mesenquimales, y estos tumores tenían infiltración de células inmunes escasa y se asociaron con niveles bajos de circulación CA125 [5]. Los eventos genéticos que dan lugar a cada subtipo molecular de HG-SOC y controlan su comportamiento clínico son actualmente desconocidos.
Let-7
s son una familia de doce relacionado secuencia de micro-(MI ARN) distribuidos en ocho grupos genómicos que a menudo son regulados hacia abajo en el cáncer [6], [7], [8].
Let-7
ha surgido como parte de una red de regulación complejo e importante en el cáncer, cuya expresión reducida conduce a la re-expresión de una gama de proteínas oncofetales [6], [9]. Al igual que con otros miRNAs,
let-7
moléculas reconocen y se unen a sus secuencias diana, lo que resulta tanto en la represión de traducción y descomposición de ARNm [10], [11], [12]. A nivel celular,
Let-7
ha extendido sus efectos sobre la diferenciación y la auto-renovación [13]. El
HMGA2
gen es un objetivo ampliamente caracterizado de la
let-7
familia de miRNAs [6], [9], [11], [14] y codifica una unión a ADN y la cromatina la modificación de la proteína que regula tanto la diferenciación y el vástago renovación celular [15]. La expresión de alto nivel de HMGA2 también se ha relacionado con un mal resultado en una gama de cánceres sólidos, incluyendo cáncer de ovario [16]. El equilibrio entre la
HMGA2
y
Let-7
expresión se ha relacionado con el mantenimiento de un estado indiferenciado de células de cáncer [9], [14]. Un bucle de retroalimentación negativa que implica la expresión de alto nivel de la
Let-7
represores,
Lin28
y
LIN28B
, se ha asociado con varias neoplasias [14], [17 ], [18]. Los oncogenes c-Myc y N-Myc son reguladores positivos de
Lin28
y
LIN28B
, respectivamente [19], [20]. Por lo tanto, la desregulación de los diferentes aspectos de una vía que implica proteínas MYC,
let-7
represores
Lin28
y
LIN28B
, varios
let-7
alelos y objetivos oncofetales como
HMGA2
se han reportado en una serie de tumores malignos.
Hemos utilizado los conjuntos de datos genómicos de más de 900 HG-SOC para descifrar las vías que controlan esta enfermedad. Se demuestra que el subtipo C5 de HG-SOC está definido por
let7
y
MYCN
la desregulación, la presentación de una nueva oportunidad para la intervención terapéutica prevista en el cáncer de ovario.
métodos
Ética declaración
Este estudio fue aprobado por los Comités de Ética de Investigación Humanos en el Centro Peter MacCallum del cáncer, Instituto Queensland de Investigación médica de la Universidad de Melbourne y todos los hospitales participantes. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes en este estudio.
conjuntos de datos genómicos
gen de microarrays de expresión de datos se obtuvo de cuatro cohortes, conocido como AOCS, TCGA, NCI y Noruega. El conjunto de datos de la AOCS (n = 285) se generó utilizando Affymetrix U133 2,0 arrays y está disponible en la Expresión Génica Omnibus (GEO). El conjunto de datos del Genoma del Cáncer Atlas (TCGA, n = 476) se generaron usando vectores Affymetrix HTHGU133a, y obtenidos a través del portal de datos TCGA. El conjunto de datos del NCI (n = 185) fue generada el Affymetrix U133A y obtuvo de Michael Birrer, Hospital General de Massachusetts. El conjunto de datos de Noruega [21], [22] (n = 64) se generó utilizando cDNA arrays de encargo y obtenido a través del laboratorio de uno de nosotros (A. H.). Los detalles clínicos para cada conjunto de datos se resumen en la Tabla S1.
Pacientes y muestras
Las muestras para los estudios de inmunohistoquímica y validación de ARN se obtuvieron del Estudio de Cáncer de Ovario de Australia (AOCS), una cohorte de base poblacional de las mujeres con cáncer de ovario epitelial reclutados entre 2002-2006 [5]. Todos los pacientes firmaron un documento de información y consentimiento del paciente aprobado institucionalmente. Los detalles de los procesos de acumulación de pacientes, recogida de información de seguimiento clínico, revisión patológica, el aislamiento de los ácidos nucleicos, y la preparación de los microarrays de tejidos se describen anteriormente [5].
análisis bioinformático
Una detallada Descripción de la bioinformática múltiples análisis utilizado en este informe se proporciona en Métodos S1.
reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real (Q-RT-PCR)
la medición de la expresión de genes de codificación se realizado como se describe anteriormente [23], usando TaqMan ensayos de expresión génica (Applied Biosystems) o verde SYBR (Applied Biosystems). La amplificación por PCR se realizó por triplicado para cada muestra. controles endógenos
HPRT1
y
ACTB
fueron incluidos para todos los ensayos y la cuantificación relativa de la expresión del ARNm se calculó utilizando la 2
-ΔΔCt método [24]. La expresión de miRNAs maduros para
let-7
alelos se determinó usando un miARN ensayo TaqMan (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los detalles adicionales, incluyendo cebadores y los tiempos de ciclo, se proporcionan en Métodos S1.
La inmunohistoquímica y la hibridación in situ fluorescente in
HMGA2 expresión de la proteína se midió en muestras de HG-SOC en un microarray de tejido (n = 127) como se describe en Métodos S1. La puntuación fue el siguiente: 0 - no /expresión nuclear débil o moderada, 1 - menos de 10% de células tumorales con una fuerte tinción nuclear, 2 - células tumorales 10-50% con una fuerte tinción nuclear, 3 - células tumorales más de 50% con fuerte tinción nuclear. Hibridación in situ fluorescente (FISH) de sondas de cromosoma artificial bacteriano (BAC) de la metafase núcleos se describió anteriormente [17].
Los ensayos funcionales en líneas celulares
Derribo (KD) de ARNm diana se logró usando Dharmacon On-Target Plus SmartPools (Dharmacon, Thermo-Científico) para todos los genes excepto
MYCN
, que fue dirigido usando Qiagen siRNA Hs_MYCN_3 (Qiagen). Los controles incluyeron Dharmafect1 solo, Dharmacon no silenciando-control de la piscina,
GAPDH
SmartPool, y las Estrellas de control negativo (Qiagen) de
MYCN
ensayos. Los detalles de las condiciones de transfección de cultivos celulares y KD se proporcionan en Métodos S1.
Resultados
subtipos moleculares de HG-SOC
Hemos desarrollado un clasificador basado en los subtipos moleculares (C1, C2, C4, C5) identificados en nuestro estudio anterior de 215 tumores del estudio de cáncer de Ovario de Australia (AOCS) [5]. Utilizando el clasificador y un procedimiento de aprendizaje supervisado, las muestras fueron divididas en uno de los cuatro subtipos moleculares en conjuntos de datos de Genoma del Cáncer Atlas (TCGA) (n = 476), Noruega (n = 64) [21], [22] y la Instituto nacional del cáncer (n = 185) [25] (Figura 1, Tabla S1). No se observaron patrones consistentes de la expresión de genes y el resultado clínico en todos los conjuntos de datos. tumores C5 se asociaron consistentemente con un mal resultado en comparación con el subtipo C2 (Figura 1B-D). Observamos que hubo alguna variación en la frecuencia relativa de los subtipos moleculares en las diferentes bases de datos y esto puede estar asociado con diferencias en los criterios de inclusión utilizados en cada estudio.
(A) Mapa de calor de los datos de expresión génica tomada de AOCS, TCGA, NCI y Noruega conjuntos de datos muestran que los tumores se clasifican en 4 subtipos moleculares. Los genes se agrupan por correlación de Pearson y las muestras están clasificadas por subtipo molecular. Mientras que el original agrupación K-means de Tothill et al. se muestra en la cohorte de AOCS, se utilizó un procedimiento de aprendizaje supervisado para la clasificación de los tumores en otros conjuntos de datos (ver Métodos complementario S1). (B) de Kaplan-Meier de supervivencia de las muestras se representan. La supervivencia global se utiliza como criterio de valoración en los cuatro conjuntos de datos. Cox modelo de riesgo proporcional se utiliza para calcular la significación estadística de la diferencia en la supervivencia entre los cuatro grupos. Log-rank se informó test, p-valor. Se combinaron (C) Las muestras de todos los conjuntos de datos para estimar las características de supervivencia. Los subtipos se compararon con C5 y el registro de prueba de los rangos de p-valor dado en la tabla. curvas (D) de Kaplan-Meier se dibujan para representar la función de supervivencia de las muestras en los cuatro subtipos diferentes después de combinar las muestras.
HMGA2 sobre-expresión y let-7 en la regulación
Para identificar las vías subtipo específico que se centraron en los tumores C5, que se caracterizan por la disminución de la inmunorreactividad CA125 circulante, infiltración de células inmunes limitada, un fenotipo indiferenciado [5], y la mala supervivencia global del paciente (Figura 1B).
HMGA2
es el más fuerte sobreexpresado gen C5-específica (AOCS p & lt; 0,0001; TCGA p & lt; 0,0001; NCI p & lt; 0,0001, bilaterales prueba de Mann-Whitney; Figura 2A, el cuadro S2). Otros marcadores de un fenotipo indiferenciado que son altamente específicos incluyen C5-
DACH1
,
PAX2
,
LAMA1
,
MYCN
,
SOX11
, así como los miembros del grupo de alta movilidad
TOX
y
TCF7L1
.
Let-7
genes diana, incluyendo
HMGA2 ¿Cuáles son desregulados específicamente en el subtipo molecular C5 de los cánceres serosos de alto grado. (A) la expresión de ARNm de
HMGA2
es significativamente mayor en el subtipo molecular C5. (B) El análisis inmunohistoquímico de la expresión de HMGA2 en muestras de cáncer de ovario que muestra coherente sobre-expresión en tumores C5. Ejemplo de fuerte (3+) tinción (arriba) y sin manchas panel (parte inferior). (C) Un conjunto básico de
Let-7
genes regulados objetivo (genes) oncofetal identificados por Boyerinas et al [6] están sobrerrepresentados en C5 firma genética. (D)
let-7
genes diana obtenidos de TargetScan5.0 se enriquecen en tumores C5. La importancia de la superposición entre C5-específica y
let-7
diana conjuntos de genes se determinó mediante la prueba exacta de un solo lado de Fisher. Se muestra diagrama de barras que representa la asociación. (* Indica p & lt; 0,0001) guía empresas
El análisis inmunohistoquímico demostró también que los tumores expresan C5 consistentemente altos niveles de proteína HMGA2 (~ 95% a 3+;. P = 0,02, dos caras prueba exacta de Fisher; figura 2B y en la Tabla S3). A nivel de proteínas, los tumores que expresan fuertemente también estaban presentes en otros subtipos, aunque a una frecuencia más baja. Estos hallazgos sugieren que un mecanismo específico de regular
HMGA2
la expresión del ARNm o la estabilidad opera predominantemente en los tumores de C5, y que los mecanismos post-transcripcionales pueden influir en la expresión de proteínas HMGA2 en otros subtipos.
HMGA2
amplificación fue más frecuente en los tumores C5 (p = 0,005, prueba de Mann-Whitney; Tabla S4). Sin embargo, esto no podría ser responsable de la mayoría de las muestras que muestra C5-específica sobre-expresión, como
HMGA2
es significativamente sobreexpresado en muestras C5 sin amplificación de
HMGA2
locus (Figura S1). Por lo tanto, mientras que
HMGA2
amplificación es más común en los tumores C5, amplificación independiente de mecanismo (s) debe dar cuenta de C5-específica sobre-expresión de ARNm y proteínas.
HMGA2
es el objetivo más altamente predicha de la
let-7
familia de microARN (miARN) en el genoma [6], [9], [11], [14], lo que sugiere redujo
Let -7
expresión como una alternativa para explicar el patrón de
HMGA2
expresión en tumores C5. En consonancia con esto, observamos C5-específica sobre-expresión de otro gen normalmente reprimidos por
Let-7
, incluyendo un conjunto básico de doce genes oncofetales definidos por Boyerinas
et al.
[6 ] (Figura 2C; p = 4,8 × 10
-8, dos caras prueba exacta de Fisher). Un conjunto de genes derivados de forma independiente de los 100 más alto rango
let-7
genes diana predijo a partir de un miARN modelo de predicción de destino [26] también fue significativamente enriquecido en el subtipo C5 (p & lt; 0,0001, de un solo lado exacta de Fisher test) (Figura 2D).
a continuación, se midió directamente la expresión de la
Let-7
familia en muestras AOCS utilizando un ensayo TaqMan y compararon los resultados con los datos de microarrays miARN del conjunto de datos TCGA. Hemos encontrado que
Let-7b
,
-7d
, y
-7i
fueron significativamente más bajo expresado en tumores C5 en comparación con otros subtipos, tanto en la AOCS y cohortes TCGA ( Tabla 1).
let-7c
,
-7E
y
-7f
fueron también significativamente más bajo expresado en C5 en cualquiera de los dos conjuntos de datos TCGA o AOCS. La diferencia entre las dos cohortes con estos alelos pueden estar relacionados con la sensibilidad de la plataforma de ensayo utilizado, microarrays miARN para TCGA y TaqMan ensayos para las muestras de AOCS.
La desregulación de let-7
Hemos explorado las posibles causas del bajo nivel de expresión de
let-7
alelos. deleciones genómicas, ensayadas por matrices SNP basada en el conjunto de datos TCGA, mostraron que la pérdida de la participación de la región cromosómica 22q13.31, que abarca
Let-7b
y
Let-7a3
, era más común en las C5 tumores (p = 0,018) (Tabla S5). Aunque la pérdida de 22q13.31 puede dar cuenta de la reducción de expresión de
Let-7b Hoteles en algunos tumores, no sería explicar los efectos observados con otro
Let-7
alelos, que se distribuyen a través 8 loci y son más propensos a ser no reguladas, en
trans
. Los defectos en la maquinaria de procesamiento de miRNA, incluyendo los niveles reducidos de Dicer (
DICER1
) y Drosha (
RNASEN
), se han relacionado con un peor pronóstico en HG-SOC [27], sin embargo, una mayor expresión de
DICER1
se observó en el subtipo C5 (figura S2).
DICER1
niveles han demostrado ser regulada negativamente por
Let-7b
[28], [29], lo que podría explicar el C5-específica sobre-expresión de
DICER1
.
Lin28 y Lin28B regulan negativamente
Let-7
niveles mediante la unión a los bucles terminales de los precursores de
Let-7 miARN, bloqueando de esta manera el procesamiento
familia en miRNAs maduros [17], [30], [31], [32]. Se encontró que la expresión de
LIN28B
, pero no
Lin28
, fue altamente enriquecido en tumores C5 (AOCS p & lt; 0,0001, TCGA p & lt; 0,0001, bilaterales Mann Whitney; Figura 3A y Figura S2). Translocación entre los
HACE1
y
LIN28B
se ha sugerido para dar lugar a la desregulación de los
LIN28B
y provocar bajadas
7 pisos-
niveles [17 ]. FISH en un TMA de 239 tumores de ovario, incluyendo 73 de subtipo molecular conocido encontró evidencia de reordenamiento entre los
HACE1
y
LIN28B Hoteles en un solo núcleo de un tumor HG-SOC del subtipo molecular desconocida (Tabla S6), lo que sugiere que este mecanismo de
LIN28B
regulación es poco frecuente en el carcinoma de ovario
.
Boxplots (a) representan la expresión diferencial de
LIN28B
y
MYCN
en diferentes subtipos moleculares de seroso de ovario AOCS conjunto de datos. (B) copia niveles numéricos de ADN y los niveles de expresión de
MYCN ¿Cuáles son altamente correlacionados. C5 (muestras codificadas en rojo) se distribuyen predominantemente en la esquina superior derecha de la trama. Se consideró que las muestras con relación de copia segmentado registro número mayor que 0,3 para tener una ganancia de
MYCN Opiniones y muestras con relación log segmentado menos de -0.3 se considera que tiene una pérdida. Se utilizó la prueba exacta de Fisher para calcular la significación estadística de la asociación. (C) Asociación entre
MYCN
objetivos y conjuntos de genes C5.
MYCN
objetivos se extrapolaron a partir de la intersección de las dos listas de genes, (1) genes ligados por N-myc en líneas de células embrionarias de ratón y (2) los genes con aumento de 2 veces en la expresión después de la transfección de N-myc en las células embrionarias de ratón (ver Métodos complementario S1). Utilizando datos de la AOCS o la expresión de genes TCGA establece genes fueron clasificados como de alta o baja en los tumores C5 versus todos los otros tumores (C1-C4) en p & lt; 0,001 por dos caras t-test. La importancia de la superposición entre los conjuntos de genes C5 y
MYCN
conjuntos de genes se determinó mediante la prueba exacta de Fisher unilateral. Se muestra diagrama de barras que representa la asociación.
La desregulación de
MYCN
Recientemente, tanto c-Myc y N-myc han demostrado que regulan positivamente
Lin28
y
LIN28B
expresión [19], [20], sin embargo, no se encontraron diferencias en la expresión de
MYC
entre C5 y tumores no-C5. Curiosamente, la ganancia de
MYC
fue más frecuente en los tumores no-C5 (P & lt; 0,01) (Tabla S4). Por el contrario,
MYCN
fue significativamente sobreexpresado en los tumores de C5 (AOCS p & lt; 0,0001, TCGA p & lt; 0,0001, bilaterales prueba de Mann Whitney; Figura 3A). En el conjunto de datos TCGA donde estaban disponibles tanto en el número de copias y la expresión de datos,
MYCN
ejemplar número ganancia fue altamente enriquecido en el subtipo C5 (p & lt; 0,0001, bilaterales prueba de Mann-Whitney; Figura 3B). Si bien hubo una correlación significativa entre el
MYCN
número de copias y la expresión génica, algunas muestras C5 sobreexpresado
MYCN
sin amplificación de genes, lo que sugiere otros mecanismos de regulación del subtipo específico. Se obtuvo evidencia adicional de la actividad de N-Myc mediante el examen de la expresión de los genes diana conocidos en las cohortes AOCS y TCGA [33]. En ambos conjuntos de datos se observó un enriquecimiento significativo en la expresión de N-Myc genes diana en los tumores C5 (AOCS p & lt; 0,0001, TCGA p & lt; 0,0001, unilateral la prueba exacta de Fisher, Figura 3C), incluyendo trans-activación de
LIN28B
.
MYCN
y
HMGA2
expresión fueron también altamente correlacionado significativamente (Figura S3). Hemos observado la desregulación altamente específica de los miembros individuales de la
MYCN Lin28B-let7
vía en tumores C5, así como un conjunto más amplio de
MYCN Opiniones y
let7
transcripcional objetivos . Para comprender el grado en que el
let7
vía define tumores C5, se utilizó un análisis del impacto de la vía de señalización descrito recientemente (SPIA) [34] para investigar otras dependencias de la vía de señalización. Entre 87 vías de señalización a prueba,
let7
era la vía más regulada de manera significativa en los tumores C5 (Tabla S7). firma genes para todos los subtipos se presentan en la Tabla S8.
Análisis funcional de las asociaciones de la vía
Para explorar el significado funcional de nuestros resultados en tumores primarios, se realizaron búsquedas de datos genómicas de 40 líneas celulares de ovario. A2780 y CH1 aproximadas tumores C5 más de cerca, ya que ambos expresaron bajos niveles de
Let-7
alelos, y altos niveles de
HMGA2
y
LIN28B gratis (Figura S4A, S4B ). Sin embargo, sólo CH1 expresó
MYCN
, ni línea mostraron amplificación de la
MYCN
locus, y ambos fuertemente expresado
Lin28
, el paralogue de
LIN28B
(Figura S4B, S4C). Tras sistemática knock-down de
Lin28
,
LIN28B
y
MYCN
que supervisó la expresión de los
let-7
alelos. En tanto las células A2780 y CH1, combinado siRNA knock-down (KD) de ambos
Lin28
y
LIN28B
dio lugar a la sobre regulación de prácticamente todos los miembros de la familia let-7 (Figura B-S5A ), en consonancia con los informes anteriores [17], [31]. KD de
LIN28B
era generalmente no es tan importante como
Lin28 gratis (máximo alcanzado el 70% KD, en comparación a & gt; 90% KD) y se asoció con un menor impacto en
let-7
expresión. De particular interés,
Let-7
regulación siguiente
Lin28 /LIN28B
KD no fue inmediato; a pesar de
Lin28
y
LIN28B
ARNm se suprime el plazo de 48 horas,
let-7
regulación no era detectable hasta 96 horas. KD de
MYCN
ARN era difícil de obtener (Métodos S1) en la línea celular CH1. En el mejor de se logró una reducción de la expresión del ARNm del 60% (Figura S5B) y poco efecto sobre
LIN28B
o
let-7 se observó
expresión. Ni KD de
Lin28
,
LIN28B
, ni
MYCN
tuvo un efecto significativo sobre la proteína HMGA2 o expresión de ARNm (Figura S5C). Sin embargo, como se observa en algunos tumores C5, células CH1 tienen amplificación de
HMGA2 gratis (Figura S4B), lo que sugiere esta línea celular tiene un mecanismo alternativo de HMGA2 sobre-expresión.
Discusión
una extensa serie de experimentos de ganancia y la pérdida de función en las líneas celulares han demostrado una interacción funcional entre la N-myc y Lin28B [20]; Lin28B y let-7 [17], [30], [31], [32]; y Let-7 y HMGA2 y otras proteínas oncofetales [6]. Aquí hemos demostrado que cada elemento de vía se expresa específicamente en una forma que tener en cuenta la profunda sobre-expresión de HMGA2 y otras proteínas oncofetales en una gran proporción de tumores C5 (Figura 4, Tabla S9). Ganancia o sobre-expresión de
MYCN
no ha sido previamente asociado con el cáncer de ovario seroso. Mientras que un nivel de amplificación no es tan alta como se describe típicamente en neuroblastoma [35], encontramos significativa sobre-expresión de genes diana N-myc en los tumores C5 de apoyo a la vista, es funcionalmente activa. Datos recientes muestran que incluso bajo nivel de ganancia del número de copias de
MYCN
puede influir significativamente en la evolución del paciente en el meduloblastoma [36].
MYCN
sobreexpresión fue altamente C5-específica y mecanismos, además de la amplificación pueden contribuir a esta
Cada evento es considerablemente enriquecido en C5 frente a tumores serosos de alto grado no-C5.:
MYCN amplificación
p & lt; 0,0001;
MYCN
sobreexpresión p & lt; 0,0001; sobre-expresión
MYCN
se dirige a p & lt; 0,0001;
LIN28B
sobreexpresión p & lt; 0,0001; subexpresión
let-7
alelos p & lt; ,01-0,0001;
HMGA2 amplificación
p & lt; 0,001,
HMGA2
sobreexpresión p & lt; 0,0001 (datos del TCGA). la pérdida acumulativa de let-7b, y /o ganancia de HMGA2, y /o ganancia de MYCN se producen en el 77,8% de las muestras de subtipo C5 (p & lt; 0,0001, prueba exacta de dos caras de Fisher; Tabla S4).
es probable que varios mecanismos conducen a
HMGA2
subtipo expresión específica incluyendo
MYCN
amplificación, pérdida de concreto
let-7
alelos incluyendo
Vamos -7b
, y la amplificación de
HMGA2
sí. Por ejemplo, en células CH1
Lin28
y
¿Cuáles son LIN28B tanto sobreexpresado y reprimir
let-7
expresión, sin embargo, estas células también muestran
HMGA2
amplificación. También se encontró una asociación significativa entre el fenotipo molecular C5 y pérdida de
let-7b
. La expresión de
Let-7b
se redujo en ambos AOCS y conjuntos de datos del TCGA, y cabe destacar que entre los
let-7
alelos,
let-7b
ha sido previamente información de que se expresa en virtud de HG-SOC [37]. Aunque los diferentes alelos de
Let-7
aparecerá a secuencias diana muy similares, la presencia de múltiples genes independientes, su expresión diferencial durante el desarrollo [7] y nuestros datos implican que realizan funciones selectivas.
la sobre-expresión de
MYCN
y
let-7
objetivos en los tumores C5 añade peso a la importancia funcional de la amplificación y sobreexpresión de
MYCN y la
reducción significativa de la expresión de
let-7
alelos. Desmontables de
Lin28
y
LIN28B
expresión dio lugar a la re-expresión de
Let-7
proporcionando evidencia adicional de una cadena de interacciones en los tumores de ovario. Sin embargo, otras interacciones establecidas no se observaron en las líneas celulares de cáncer de ovario de prueba aquí. Por ejemplo, aunque
HMGA2
es un objetivo bien definido de
Let-7
[6], tanto en la ganancia y la pérdida de los experimentos de la función, la restauración de
Let-7
expresión no influye notablemente
HMGA2
expresión. Estos resultados pueden explicarse por la supresión experimental limitado de
LIN28B
y
MYCN
, el hecho de que ni las líneas celulares A2780 CH1 ni fielmente phenocopy todos los defectos moleculares observados tumores C5, y la amplificación de
HMGA2 Hoteles en células CH1. Observamos también que
Let-7
expresión fue restaurado sólo después de un período prolongado (96 h) de siRNA desmontables mediada por
Lin28
y
LIN28B
, lo que sugiere que es difícil de reiniciar la vía, una vez que se ha regulado hacia abajo. Una validación adicional de nuestros hallazgos requieren líneas celulares derivadas de tumores C5 que comparten más de cerca las características moleculares de sus homólogos primarios
.
Mientras que los elementos de esta vía se han demostrado previamente que no reguladas en el cáncer de ovario [37 ], [38], nuestro informe es el primero en mostrar la interrupción ruta completa y su asociación con un subtipo específico de HG-SOC. Nuestro análisis indica que el
let-7
vía es única prominente entre los eventos interrumpidos en los tumores C5 señalización, y aparece para esculpir su perfil transcripcional. La identificación de los subtipos moleculares de cáncer de mama [39], [40] y ciertos cánceres hematológicos como el linfoma de células B grandes difuso [41], [42], [43] han proporcionado puntos de partida de gran alcance para descubrir los conductores de los subtipos específicos de enfermedad. Concomitante regulación a la baja de
Let-7
y aumentada
HMGA2 expresión
resultados en los tumores menos diferenciados con características similares a las células madre [6], [9], [13], [14], [15]. Estas observaciones son consistentes con la baja expresión de marcadores de diferenciación en los tumores C5 [5], incluyendo
MUC16
, el objetivo del anticuerpo CA125 utilizado clínicamente para el diagnóstico de cáncer de ovario y el pronóstico. Nuestro trabajo por primera vez define una vía en HG-SOC que se asocia con y parece conducir el comportamiento biológico y clínico de un subtipo molecular distinto de cáncer de ovario, lo que sugiere un enfoque terapéutico dirigido en este grupo de pacientes.
Apoyo a la Información
Figura S1.
gen HMGA2 es significativamente hasta reguladas en los tumores de C5 TCGA. (A) la expresión del ARNm de
HMGA2
basado en todas las muestras de TCGA HMGA2 (B) es sobreexpresado en muestras sin amplificación del locus HMGA2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018064.s001
(TIF)
figura S2.
expresión de un número de genes específicos C5 medidos usando QRT-PCR. Esto se hace para validar los datos de microarrays de expresión de la cohorte de AOCS. Diagramas de cajas que representan la relación entre los niveles de expresión de estos genes y subtipo molecular (C5-C5 o no) se muestran, los valores de p se calcularon utilizando Wilcox en la prueba de suma de rangos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0018064.s002
(TIF)
Figura S3.
niveles de expresión de HMGA2 y MYCN. niveles (A) y HMGA2 expresión MYCN se correlacionan en muestras TCGA.