Extracto
Las mutaciones en el
MCPH1 gratis (Microcefalina) y
ASPM
genes (de tipo huso anormal microcefalia asociados) causan microcefalia primaria. Ambos son proteínas centrosomales asociados involucrados en la mitosis. Microcefalina juega un papel importante en la respuesta al daño del ADN y ASPM se requiere para la división correcta de las células neuroepiteliales proliferativos del cerebro en desarrollo. Reducción de
MCPH1
la expresión de ARNm y
ASPM
sobreexpresión de mRNA han sido implicados en el desarrollo de carcinomas humanos. cáncer de ovario epitelial (EOC) se caracteriza por tumores altamente aneuploides. Anteriormente hemos informado bajo Microcefalina y los niveles de proteína ASPM altas y las asociaciones con los parámetros clínico-patológicos en las células malignas de los fluidos de ascitis. Para confirmar estos hallazgos anteriores sobre una escala mayor y microcephalin ASPM niveles de expresión y localizaciones se evaluaron por inmunohistoquímica en dos cohortes; un conjunto de entrenamiento de 25 muestras y un conjunto de validación de 322 muestras de tejido de EOC. Los resultados se correlacionaron con los datos histopatológicos asociados. En los tejidos ováricos normales, el patrón de tinción nuclear Microcefalina era fuerte y consistente. En los tejidos de cáncer, identificamos baja expresión Microcefalina nuclear en alto grado y tumores en estadios avanzados (
p Hotel & lt; 0,0001 yp = 0,0438, respectivamente). ASPM tenía moderada a alta nuclear y baja a moderada expresión citoplásmica en el tejido normal. expresión citoplasmática ASPM disminuyó con el grado del tumor y el estadio en el subtipo seroso de EOC (p = 0,023 y p = 0,011 respectivamente). Citoplasmática ASPM aumenta con el estadio del tumor en el subtipo endometrioide (p = 0,023). El aumento de la invasividad tumoral (T3) y la implicación de los ganglios linfáticos (N1) también se correlacionó con una disminución en citoplasmática ASPM en EOC (p = 0,02 y p = 0,04, respectivamente). Hemos validado los hallazgos previos de la expresión desregulada de Microcefalina y ASPM en EOC mediante la confirmación de las asociaciones de bajos niveles nucleares Microcefalina y altos niveles citoplasmáticos ASPM en un estudio de tejido tumoral mayor escala. Microcefalina y ASPM biomarcadores pueden resultar útiles en EOC
Visto:. Alsiary R, Brüning-Richardson A, J Bond, Morrison EE, N Wilkinson, Bell SM (2014) La desregulación de Microcefalina y Expresión ASPM se correlacionan con epitelial ovárica progresión del cáncer. PLoS ONE 9 (5): e97059. doi: 10.1371 /journal.pone.0097059
Editor: Xifeng Wu, MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Febrero, 2013; Aceptado: 14 de abril de 2014; Publicado: 15 de mayo de 2014
Derechos de Autor © 2014 Alsiary et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo y el Dr. Bruening-Richardson fueron financiados por el Cancer Research Yorkshire [L328] a los Dres Morrison, Bond y Bell. La Universidad de Leeds es compatible con el Dr. Bell, Dr. Bond y el Dr. Morrison. El Dr. Alsiary por una beca de la Arabia Ministerio de Educación Superior, Dr. Wilkinson por Arabia Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. El Dr. Wilkinson tiene fondos de Bienestar de la Mujer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Aproximadamente 225.000 nuevos casos de cáncer de ovario se diagnosticaron en 2008 en todo el mundo, que comprende 4% de todos los cánceres femeninos [1], [2]. La mayoría de los cánceres de ovario epitelial son, con frecuencia presentes en los estadios avanzados y están asociados con altas tasas de mortalidad [3]. Por lo tanto, la investigación de la función y expresión de proteínas potenciales de pronóstico es esencial para el avance de nuestra comprensión de la patogénesis molecular del cáncer de ovario epitelial (EOC). Esto es especialmente deseable en lo que respecta a la identificación de biomarcadores de diagnóstico para el manejo del paciente [4].
El
MCPH1
y
MCPH5
genes codifican Microcefalina y lo anormal de tipo huso proteína microcefalia-asociado (ASPM), respectivamente [5], [6].
MCPH1
y
MCPH5 ¿Cuáles son dos de los diez genes identificados microcefalia, que están implicados en la microcefalia autosómica recesiva primaria (MCPH) [7] - [13]. La microcefalia se caracteriza por la reducción del crecimiento del cerebro del feto como resultado de defectos de la mitosis durante el desarrollo embrionario del cerebro [14]. Microcefalina es una proteína nuclear y citoplasmática que consiste en 835 aminoácidos. La proteína contiene tres dominios BRCA1 C-terminal (BRCT), un
N
ha -terminally ubicado y dos en el
C-terminal
[5]. Microcefalina está implicado en la respuesta al daño de ADN con un papel más como un regulador de la condensación de cromosomas evitando que las células entren en mitosis antes de la replicación del ADN se completa [15] - [17]. Microcefalina también se conoce como BRIT1 (
BRCT
-Repita inhibidor de la expresión de hTERT), que se identificó inicialmente como un represor de la transcripción de la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), la subunidad catalítica de la telomerasa humana [18]. La proteína ASPM consta de 3477 aminoácidos [6] organizados en un putativo
N
dominio de unión a microtúbulos-terminal [19], [20], dos motivos de repetición homología calponin, más de 80 repeticiones isoleucina-glutamina (IQ) [6], [21], que normalmente se unen calmodulina y un
C-terminal
que consiste en una sola secuencia y Armadillo como una región implicada en la citocinesis [8], [22]. ASPM juega un papel en el control de la función del huso mitótico [6], [22]. ASPM se encuentra en los polos del huso en la metafase y en el núcleo y el centrosoma durante la interfase [6], [22] - [27]. Además, ASPM se localiza en la mitad del cuerpo durante la citocinesis, lo que sugiere que juega un papel en la abscisión [22], [27].
Varias líneas de evidencia indican que Microcefalina y ASPM juegan un papel en la carcinogénesis. A nivel del ADN, Rai
et al.
Informó de que
MCPH1
número de copias se redujo en un 40% (35/87) de EOC avanzada y en el 72% (39/54) de la mama los casos de cáncer [16]. Del mismo modo, en el ARNm
MCPH1
ARNm se redujo en 63% (19/30) de los EOC [16]. Hemos mostrado una reducción de los niveles de proteína Microcefalina en el 29% (93/319) de los carcinomas ductales de mama invasivo, con la expresión Microcefalina disminuyendo a medida que aumenta el grado del cáncer de mama. Es importante destacar que, Microcefalina fue un predictor independiente de la supervivencia específica del cáncer de mama en general [28]. Recientemente, dos pequeños estudios adicionales de cáncer de mama han confirmado la asociación de la expresión reducida Microcefalina con la progresión tumoral y el pronóstico [29], [30]. Microcefalina expresión disminuido También se informó en un pequeño estudio de cáncer de próstata [16], lo que sugiere que existe una correlación negativa entre los niveles Microcefalina, la estabilidad genómica y la aberración cromosómica. Recientemente se identificó la inactivación de
MCPH1 fotos: por eliminación, la metilación del promotor y la mutación en un estudio de cáncer oral de células escamosas [31]. Este estudio también mostró que Microcefalina sobre la proliferación de expresión inhibida, la invasión y el crecimiento del tumor y el crecimiento independiente del anclaje en ratones desnudos que apoyan la función supresora de tumores de Microcefalina [31].
Por el contrario,
ASPM
ARNm niveles se aumentaron en el tumor y las células humanas transformadas [26], [32]. El aumento de
ASPM
los niveles de ARNm y proteínas se identificaron también en el glioblastoma multiforme (GBM), en los que se asociaron con el aumento de grado tumoral [32], [33]. Además,
ASPM
upregulation ARNm se identificó en 66% (162/247) de los carcinomas hepatocelulares, una observación asociado con aumento de la invasión, la etapa alta y la recurrencia tumoral temprano [34]. Recientemente la regulación positiva de ASPM correlacionado con una menor supervivencia del paciente también ha sido identificado en el cáncer de páncreas [35].
Nuestro estudio reciente del COE determinado una correlación entre los niveles Microcefalina y ASPM con el grado del tumor y la supervivencia en líneas celulares y en cultivos primarios de células malignas derivadas de muestras de ascitis de ovario [36]. En este trabajo se han validado nuestros hallazgos originales en un estudio a gran escala utilizando muestras de tejidos de EOC y hemos investigado el papel de los Microcefalina y ASPM en la progresión del COE. Nuestros resultados sugieren que Microcefalina y ASPM pueden ser biomarcadores útiles en el manejo de EOC.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
aprobación ética apropiada, se obtuvo del Comité Ético de Investigación del local el Leeds Teaching Hospitals NHS Trust, Leeds, Reino Unido, (referencia REC 09 /H1306 /96). Todos los participantes por escrito el consentimiento informado y se analizaron todos los datos de forma anónima.
muestras de pacientes
Una cohorte de 25 archivos de tumores, fijado en formol (FFPE) bloquea incluidos en parafina se obtuvieron de la histopatología departamento del hospital St. Universidad James, Leeds y se utiliza para crear el conjunto de entrenamiento. El conjunto de muestras en esta cohorte representa cuatro grandes (más frecuentemente encontrado) subtipos EOC (seroso, endometrioide, mucinosos y carcinosarcoma) y eran predominantemente tumores de grado 3. Todos los bloques en esta cohorte se combinaron en un microarray de tejido de la casa (TMA). Una cohorte normal, consistió en 16 muestras de tejido ovárico o bien tomados de ovario normal o de tejido normal adyacente al tumor más 4 trompa de Falopio normal y 4 muestras de endometrio normal eran también disponible.
se obtuvo Otra cohorte independiente de 322 muestras de EOC de array Networks tejidos y fue designado el conjunto de validación. El conjunto de validación consistió en 294 muestras diferentes de los cinco subtipos principales de EOC (seroso, endometrioide, el adenocarcinoma de células claras y mucinoso), más 8 tejidos ováricos normales tomadas de ovario normal y 20 a partir de tejido normal adyacente al tumor. Los 322 casos fueron representados en 616 núcleos, con los corazones dobles para casos de cáncer y de un solo núcleo de tejido normal. núcleos de tejido fueron de 0,6 mm de diámetro con un espesor de 5 micras. Los datos clínicos (grado, el diagnóstico de patología, de la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO) de parada y de estadificación TNM [37]) estaban disponibles para esta cohorte. La edad media de los 294 pacientes fue de 48 años (rango: 19 a 76 años). Se obtuvieron los resultados de asociación con la edad después de los datos se dichotomized en dos grupos (& gt; 50 y ≤50). características de los pacientes detalladas del conjunto de validación se resumen en la Tabla 1.
Tissue Microarray construcción
Un internamente TMA se construye a partir de 25 muestras de EOC en el Instituto de Cáncer de Leeds y Patología instalación siguiendo un protocolo descrito por Ellis
et al
[38]. Se utilizaron punzones arrayer tejido manuales con un diámetro de 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) para crear los núcleos. núcleos de tejido fueron seleccionados de la zona del tumor más representativo en cada bloque del tumor después de la revisión de la hematoxilina y eosina asociada muestras teñidas por el anatomopatólogo ginecológica especialista (NW).
Detección inmunohistoquímica de Microcefalina y ASPM
Para optimizar el protocolo de tinción Microcefalina y ASPM, la casa en secciones EOC TMA fueron teñidas utilizando una serie de diluciones de anticuerpos y los métodos de recuperación de antígeno. Microcefalina y ASPM se tiñeron por separado en las mismas condiciones excepto para la recuperación de anticuerpos y la dilución. Las láminas fueron deparaffinised y rehidrata utilizando series xileno y etanol. Para bloquear la actividad de peroxidasa de hidrógeno, los portaobjetos se sumergen en un 3% H
2O
2 en metanol. La recuperación del antígeno se llevó a cabo utilizando el vector de la recuperación de antígeno tampón (Vector Laboratories Ltd) en una olla a presión durante 4 minutos para Microcefalina y 2 minutos para ASPM. Las secciones se bloquearon con solución de caseína 01:10 vector (Vector Laboratories) para reducir la tinción no específica. En las secciones TMA se utilizó el anticuerpo anti-ab2612 Microcefalina conejo (Abcam) a 1/300 y el conejo anti-
N-terminal
ASPM anticuerpo 216.1 [36] utiliza a 1/400. Los portaobjetos se incubaron a 4 ° C durante la noche en una cámara humidificada. Después de tres lavados con TBS Tween (0,1%) se incubaron los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente con el polímero de conejo /ratón secundario conjugado con peroxidasa de EnVision (DAKO). Después de lavados adicionales la reacción se visualizó mediante la adición de 2% diaminobenzine + cromógeno en tampón sustrato DAP durante 10 minutos (DAKO). Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina de Mayer (VWR International Ltd). Los controles negativos sin anticuerpo primario, y los controles positivos de tejido ovárico normal se incluyeron en cada lote de inmunohistoquímica.
Microcefalina y ASPM Anticuerpo Validación
Con el fin de determinar la especificidad de la tinción del anticuerpo en Microcefalina muestras FFPE, un inmunizantes péptido bloquea experimento se realizó en secciones de tejido de EOC y en el 25 núcleo de la casa TMA. El anticuerpo se neutralizó mediante pre-absorción con el péptido ab13737 BRIT1 (Abcam). El anticuerpo se diluyó a su concentración de trabajo predeterminada (descrito anteriormente) y se incubó con un exceso de diez veces de péptido durante la noche a 4 ° C antes de la aplicación al tejido. Las secciones de tejido con anticuerpo neutralizado se compararon con las correspondientes secciones de tejido teñidas con anticuerpo solo.
Ya se había determinado la especificidad del anticuerpo del anticuerpo 216.1 ASPM en trabajos anteriores mediante el bloqueo de péptidos inmunofluorescencia experimentos [36]. Además, confirmó el patrón de tinción del anticuerpo observada en la tinción IHC por el mismo en la empresa EOC TMA con otro anticuerpo (279,3) generado en contra de la
C-terminal de
ASPM. resultados de tinción similares se obtuvieron con ambos anticuerpos con solamente ligeras diferencias entre los niveles de tinción citoplásmica.
Para una validación adicional de la especificidad y sensibilidad de los anticuerpos y para controlar los efectos de la fijación con formalina y la recuperación de antígenos,
MCPH1
y
ASPM
se daban de baja en la línea celular U-2 OS (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) de siRNA como se describe anteriormente [17], [36], [22]. Después se recogieron las células 72 hrs, se sedimentaron, se fija con formalina y se suspendió en 1% de agar a continuación, se incluyeron en parafina y se utilizan como controles para la validación de anticuerpos.
Evaluación inmunohistoquímica
Todos los TMA secciones fueron escaneados utilizando el aperio Scan escáner de diapositivas Alcance (Aperio Technologies) en 40 aumentos, utilizando herramientas de software de morfometría en Imagescope (aperio). Para Microcefalina y ASPM los núcleos replicados para cada muestra se anotó para intensidad de la tinción de la tinción nuclear y citoplásmica (puntuación de intensidad, 0 = sin manchas, 1 = débil tinción, 2 = tinción moderada y 3 tinción = fuerte), así como la proporción de las células de la energía nuclear positiva o tinción citoplasmática dentro de los núcleos (puntuación de porcentaje). Para analizar la Microcefalina la tinción se utilizó el sistema de Allred (rápido) 8-unidad semi-cuantitativa [39]. La proporción de células teñidas nucleares o citoplasmáticas positivos dentro de cada núcleo se definió como 0 = sin manchas, 1 = & lt; 1% de tinción, 2 = 1-10% de tinción, 3 = 11 a 33% de tinción, 4 = 34 a 66% tinción, 5 = 67 a 100% de tinción. La puntuación final se obtiene sumando las puntuaciones de intensidad a las puntuaciones proporción, logrando una puntuación mínima de 0 y una puntuación máxima de 8. Casos con una puntuación de 4 o menor fueron llamados baja, mientras que los casos con una puntuación de 5 o 6 eran etiquetado como moderado y muestras con una puntuación de 7 o 8 fueron considerados como la expresión de altos niveles de Microcefalina. Para el análisis de datos de expresión ASPM se utilizó un sistema de análisis de datos ligeramente más sensibles, en el que la intensidad de la tinción se multiplicó por el porcentaje de células con tinción nuclear o citoplásmica [40]. Así, la puntuación más baja fue 0 y los más altos 300. Las muestras con una puntuación de 0 se llama negativo, las muestras con una puntuación de 1-100 bajas, las muestras con una puntuación de 101-200 moderado y muestras con una puntuación de 201-300 eran anotó como altos niveles de expresión. Para el análisis de datos discontinua todas las muestras negativas y bajas fueron designados bajo y todas las muestras medias y altas se designaron los altos niveles de ASPM.
Análisis estadístico
El no paramétrico de Kruskall-Wallis (KW) y Wilcoxon prueba -mann-Whitney (MMM) se utiliza para identificar la asociación entre Microcefalina y ASPM con variables clínicas (estadio de la enfermedad, grado, tipo histológico, metástasis, afectación ganglionar y la edad de los pacientes). Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras, y un
P ≤ 0,05
valores se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
Microcefalina y ASPM Anticuerpo Caracterización
La anticuerpos Microcefalina y ASPM se optimizaron inicialmente para su uso en TMA secciones incluidas en parafina. La inmunohistoquímica con estos anticuerpos demostró que Microcefalina y ASPM se localizaron en el núcleo y en el citoplasma, tanto de la normal (Figura 1) y muestras de tejidos de EOC (Figura 2). El patrón de tinción nuclear Microcefalina fue abolida cuando el anticuerpo se preincubó en presencia del péptido. Sin embargo, algunos uniformes de bajo nivel de fondo de tinción citoplásmica todavía estaba presente en todos los núcleos (Figura S1). Por lo tanto, no hemos incluido la tinción citoplasmática Microcefalina en cualquier análisis adicional
epitelio ovárico normal que demuestra una fuerte expresión Microcefalina tanto en el citoplasma y núcleos (A & amp; D). Y la nuclear fuerte y la expresión citoplasmática moderada ASPM (G & amp; J). trompa de Falopio normales demostrando moderada nuclear heterogénea y débil tinción citoplásmica Microcefalina (B & amp; E) y tinción ASPM demostrando nuclear fuerte y moderada expresión citoplasmática (H & amp; K). Endometrio normal que muestra fuerte tinción heterogénea nuclear y citoplásmica Microcefalina (C & amp; F) y nuclear fuerte y débil tinción citoplásmica ASPM (I & amp; L). Todas las imágenes son de ampliación x15.
adenocarcinoma seroso TMA núcleos que muestra Microcefalina nuclear y citoplasmática (A y B) y la expresión ASPM (C y D), respectivamente. flecha blanca muestra la tinción nuclear y negro flecha muestra la tinción citoplasmática. A y B son 20x, C y D son un aumento de 40x.
El patrón de tinción para ASPM anticuerpo 279.3 realizado en paralelo a la tinción con el anticuerpo 216.1 reveló que la tinción citoplásmica fue similar para ambos anticuerpos. Sin embargo, 216,1 mostraron un patrón de tinción nuclear más pronunciada que 279,3 y en consecuencia este anticuerpo se utilizó para teñir el conjunto de validación EOC. Resultados para patrones de tinción de núcleos representativos y un resumen de los resultados de la tinción se muestran en la Figura S2 y S1 Tabla
A fin de confirmar la validez de los anticuerpos para teñir tejidos incluidos en parafina., Los anticuerpos fueron probados en parafina -embedded células u-2 OS con y sin siRNA desmontables para Microcefalina o ASPM. desmontables células para ambos genes mostraron tinción muy débil en relación con el control de siRNA (Figura S3).
Expresión Microcefalina en muestras de tejido normal y EOC
Normal ovario, endometrio y muestras de tejido de tubo de Falopio toda reveló Microcefalina fuerte tinción nuclear. La mayoría (90%) de células epiteliales de ovario normales demostró tinción Microcefalina positivo, mientras que esto era ligeramente más baja (70-80%) en el endometrio y las muestras del tubo de Falopio (Figura 1A-F). Inicialmente, la expresión de Microcefalina se evaluó en el conjunto de entrenamiento en casa TMA. El análisis dicotómico en el conjunto de entrenamiento demostró pérdida de expresión Microcefalina en 16/22 (73%) de los casos (Tabla 2). En el conjunto de validación EOC, baja expresión Microcefalina se identificó en el 30% (89/294) de las muestras de EOC (Tabla 3). Ya que estábamos particularmente interesados en los niveles de expresión Microcefalina y su asociación con la génesis tumoral, examinamos nuestros datos IHC para identificar las posibles correlaciones con los datos clínicos asociados. Curiosamente, el análisis dicotómico en el conjunto de entrenamiento demostró pérdida de expresión Microcefalina en tumores de grado 3 EOC (Tabla 2). Este hallazgo fue confirmado en el conjunto de validación con baja tinción nuclear se encuentra principalmente en los tumores de grado 3 (48%; 53/110 p & lt; 0,0001). En los tumores de bajo grado, se observó tinción nuclear moderada o alta (
p Hotel & lt; 0,0001) (Figura 3). Microcefalina expresión nuclear también disminuyó con el aumento de la etapa del tumor (
p = 0,0438
) (Figura 4). Los pacientes mayores de 50 años de edad mostraron niveles más bajos Microcefalina nuclear (Tabla 3), pero la diferencia no fue estadísticamente significativa (
p = 0,0581
). No hubo cambios significativos en la expresión Microcefalina fueron identificados entre los diferentes subtipos patológicos (
p = 0,486
) (Tabla 3). Sin embargo, la mayoría (8/10, 80%) de los carcinomas de células claras representada moderada o fuerte inmunotinción Microcefalina. Esto puede reflejar el hecho de que 6/8 de estos casos fueron en estadio I y ni que los diferentes subtipos de EOC seguir diferentes vías moleculares. Hemos observado también altas tasas de pérdida de Microcefalina en adenocarcinoma seroso y mucinoso (68/207, 33% y 15/44, 34%, respectivamente, Tabla 3). Figura 5A-D demuestra la expresión de Microcefalina en los diferentes subtipos de cáncer de ovario epitelial.
Ai. tejido epitelial de ovario normal con una expresión de alto Microcefalina. Aii-IV. Adenocarcinoma TMA núcleos que muestra una fuerte expresión Microcefalina en un tumor de bajo grado (AII), moderada Microcefalina en grado 2 (AIII) y bajos niveles de expresión Microcefalina nuclear en un tumor de alto grado (Aiv). Todas las imágenes son un aumento de 40x. B. La correlación entre la expresión Microcefalina nuclear disminuye al aumentar el grado del tumor (
p Hotel & lt; 0,0001 usando una prueba ANOVA) guía empresas
Ai.. Normal de tejido epitelial de ovario demostrado un alto nivel de expresión Microcefalina. Aii-4iv Adenocarcinoma TMA núcleos mostrando un fuerte Microcefalina (aii), Microcefalina moderada (AIII) y bajos niveles de expresión Microcefalina nuclear (Aiv) en la etapa 1, 2 y 3 tumores, respectivamente. Todas las imágenes son un aumento de 40x. B. La debilidad de los niveles Microcefalina en el núcleo se asocian con estadio tumoral avanzado (
p = 0,0438
usando una prueba ANOVA).
A. carcinoma de células claras y B. endometrioideo adenocarcinoma tanto que muestra una fuerte expresión Microcefalina. adenocarcinoma mucinoso C y D. adenocarcinoma seroso tanto la presentación de la expresión Microcefalina débil. Todas las imágenes son de ampliación x40.
Expresión ASPM en muestras de tejido normal y EOC
El epitelio ovárico normal, endometrio y las trompas de Falopio mostró expresión ASPM variable, moderada a alta expresión nuclear y citoplasmática bajo a moderado tinción ASPM (Figura 1G-L). El patrón de expresión ASPM en EOC se determinó por inmunohistoquímica usando el conjunto de entrenamiento de 25 secciones incluidas en parafina. El patrón de tinción en estas muestras tumorales fue nuclear y citoplásmica. En el conjunto de entrenamiento, se observó una elevada tinción nuclear (medio combinado y fuerte patrón de tinción) en los tumores de alto grado (9/14, 64,3%), mientras que frente al citoplasma de alta ASPM estaba presente en todos los núcleos independientemente del grado. Sin embargo, la subdivisión de tinción en débil, media y fuerte reveló un aumento en los niveles altos ASPM nucleares en los tumores de grado 3. En general, la proporción de tinción nuclear positiva se clasifican en fuerte (21%, 4/19), medio (31,6%, 6/19) y débil (47,4%, 9/19) (Tabla 4). El análisis mostró que el 10,5% (2/19) de las muestras tenía una fuerte tinción citoplasmática y el 89,5% (17/19) tenían moderada tinción citoplasmática. no se observó tinción citoplásmica baja. Un análisis más detallado reveló una tendencia de aumento citoplasmática y la tinción nuclear ASPM con el grado (Tabla 4).
En la validación se observó también establecer tinción nuclear y citoplasmática. Los patrones de tinción diferían entre las muestras tumorales y ejemplos de expresión de bajo y alto ASPM se muestran en la Figura 6A-D. Estadísticamente no se identificaron asociaciones significativas entre la expresión nuclear ASPM y los datos clínicos. Aunque, curiosamente 52/294 (18%) de los casos mostró que la expresión nuclear de alta ASPM, que aumentó con el grado. El análisis del conjunto de validación utilizando el análisis continuo de datos reveló niveles bajos de citoplasmática ASPM se correlacionaron significativamente con tumores de alto grado en el subtipo seroso (p & lt; 0,001) (Figura 7A). El análisis discontinua reveló que había una correlación significativa entre el grado bajo y alto citoplasmática ASPM del tumor (p = 0,0138) y también FIGO etapa tumoral (p = 0,032) (tabla 5). El análisis adicional de los datos discontinuos por subdivisión en subtipos de cáncer reveló que, además de la correlación de baja ASPM citoplasmática con alto grado de tumor, también había una asociación de la disminución de ASPM niveles citoplasmáticos con el aumento de grado en el subtipo seroso (p & lt; 0,0001) ( la figura 7B) y un aumento de los niveles de expresión ASPM con el aumento de la etapa del tumor en el subtipo endometrioide (p = 0,0229) (Figura 7C). Una asociación significativa entre la disminución de la tinción citoplasmática ASPM y la etapa en el subtipo seroso también fue identificado (p = 0,0017) (Figura 7D). Existe una asociación significativa entre los niveles citoplasmáticos ASPM y la edad del paciente no se observó (Tabla 5).
A y B. núcleo TMA con baja expresión nuclear y citoplasmática ASPM. núcleo C y D. TMA con alta expresión nuclear y citoplasmática ASPM. La flecha blanca indica tinción nuclear, negro flecha indica tinción citoplasmática. A y C son 6,2x y B, D son, respectivamente, un aumento de 20x.
A. niveles citoplasmáticos ASPM disminuyen con el grado en serosa EOC (datos continuos, p & lt; 0,0001). niveles B. citoplasmática ASPM disminuyen con el grado del tumor en el subtipo seroso (datos discontinuos, p = 0,0239). C. niveles citoplasmática ASPM aumentan con la etapa de la enfermedad en endometrioide EOC (datos discontinuos, p = 0,0229). D. Los niveles citoplasmática ASPM disminuyen con el estadio de la enfermedad en el subtipo seroso (datos discontinuos, p = 0,0017). los niveles de E. citoplasmática ASPM disminuyen con la invasión tumoral (datos discontinuos, p = 0,02). Los altos niveles citoplasmáticos ASPM F. correlacionan sin afectación ganglionar (p = 0,04). Todos los datos se analizaron mediante un ANOVA.
Relación entre la estadificación histopatológico expresión (FIGO y la estadificación TNM) y Microcefalina y ASPM
se encontró el conjunto de validación para disminuir Microcefalina con el aumento de la etapa del tumor cuando se utiliza el sistema de estadificación de la FIGO (
p = 0,0438
) (Tabla 3). Del mismo modo ASPM tinción citoplasmática disminuyó con el aumento de la etapa del tumor cuando se utiliza el sistema de estadificación de la FIGO (
p = 0,0032
) (Tabla 5). los niveles de expresión y microcephalin ASPM se evaluaron adicionalmente en el contexto de la gravedad de la enfermedad tal como se determina por el nivel de la invasividad tumoral (T1, T2 y T3). Nuclear Microcefalina disminuyeron los niveles de expresión, incluso si el tumor se limita a los ovarios (T1; p = 0,0021). Al comparar la expresión Microcefalina en T2 con el grupo de control, el resultado se volvió más significativa (p = 0,0009). Sin embargo, no hubo diferencia significativa en la expresión Microcefalina cuando las muestras en los grupos de T1, T2 y T3 se compararon entre sí. Además, la expresión Microcefalina no se correlacionó significativamente con la participación de los ganglios linfáticos regionales (p = 0,1162) o metástasis a distancia (p = 0,5251) (Tabla 3).
Para ASPM, una asociación entre los niveles de tinción citoplásmica y la invasividad del tumor fue de identificado. Los niveles altos de ASPM citoplasmáticas se encontraron en T1, que disminuyó significativamente con T2 y T3 (p = 0,0198) (Figura 7E). ASPM alta citoplasmática también se correlacionó con ningún compromiso de los ganglios linfáticos (N0) y disminuyó con el compromiso de los ganglios linfáticos (N1) (p = 0,04) (Figura 7F) (Tabla 5).
Discusión
EOC es frecuentemente diagnosticada por primera vez en una fase avanzada, debido a la falta de síntomas y métodos fiables de detección temprana. En consecuencia, la identificación de biomarcadores de diagnóstico y pronóstico para EOC es de gran importancia clínica. En este estudio se investigó la expresión de dos proteínas MCPH, Microcefalina y ASPM, en muestras de tejido tumoral de EOC. EOC muestra un alto grado de aneuploidía. proteínas de respuesta al daño de ADN son una defensa fundamental contra la inestabilidad genómica y los defectos en estas proteínas puede conducir al cáncer. Microcefalina tiene un papel conocido en la reparación del ADN y ASPM para la función del huso durante la mitosis. El propósito de este estudio fue determinar si Microcefalina y expresión ASPM se asocian con parámetros clínico en pacientes con EOC. Ambas proteínas se había demostrado ser desregulado en otros tipos de cáncer, de manera que se asoció con la progresión del tumor [16], [28] -. [30], [36]
Recientemente hemos informado de una asociación de Microcefalina y ASPM en los niveles de células malignas derivadas de fluidos de ascitis de pacientes con EOC diferentes parámetros clínico-patológica [36]. En el presente estudio a mayor escala, la tinción Microcefalina nuclear y /o citoplasmática fue identificado en las células tumorales. Nuestros resultados en el conjunto de entrenamiento revelaron una reducción en la expresión Microcefalina nuclear en el 73% (16/22) de los tumores EOC; este porcentaje se reduce al 30% (89/294) en el conjunto de validación. Esta diferencia entre las dos cohortes potencialmente refleja el mayor número de casos de grado 3 en el conjunto de entrenamiento (73%; 16/22) en comparación con el conjunto de validación (37%; 110/294). En este estudio la expresión bajo Microcefalina fue identificado en alto grado y tumores en estadios avanzados (
p Hotel & lt; 0,0001 yp = 0,0438, respectivamente). Estos resultados coinciden con nuestro estudio anterior en muestras de ascitis de ovario que indicaban que la expresión Microcefalina se redujo en cultivos celulares derivados de ascitis de pacientes con tumores avanzados EOC [36]. Nuestros resultados son compatibles con los estudios que información reducidas
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número de copias de ADN en el 72% (39/54) de los cánceres de mama [16] y nuestros propios resultados de la reducción de expresión Microcefalina en 93/319 (29%) de muestras de cáncer de mama, particularmente en los tumores de grado superior [28].
Anteriormente, hemos identificado una correlación entre la localización anormal de Microcefalina con el grado del tumor en cultivos primarios de células malignas derivadas de los fluidos ascíticos de pacientes con EOC . En estas células, citoplásmica Microcefalina aumentó con el grado del tumor. Hemos sugerido que podría ser causa de
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mutaciones de deleción en los dominios BRCT C-terminal que han sido previamente demostrado para dar lugar a Microcefalina pasar de una nuclear de localización citoplasmática similar a
BRCA1
[41 ], [42], [43]. Un estudio reciente caracterización de diferentes
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variantes de empalme informó mutación o supresión de señales de localización nuclear dentro de la
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gen resultó en un cambio de localización de la nuclear para citoplasmática [43]. En este estudio débil a moderada Microcefalina tinción citoplasmática se observó en todos los grados 2 y 3 muestras y el aumento de la expresión citoplasmática Microcefalina se asoció con mayor grado tumoral (
p = 0,0051
).