Extracto
El cáncer colorrectal (CCR) es una causa principal de muerte relacionada con el cáncer en Europa y los EE.UU.. No hay ninguna prueba de cribado no invasivo eficaz universalmente aceptado para la CRC. las pruebas de sangre oculta en heces basada guayaco (gFOB) ha sido prácticamente sustituida por inmunoquímica fecal prueba (FIT), pero la sensibilidad sigue siendo pobre. La captación de base poblacional prueba FOBT en el Reino Unido también es baja en torno al 50%. La detección de la firma compuestos orgánicos (VOC) volátil (s) por muchos subtipos de cáncer está recibiendo un interés creciente el uso de una variedad de instrumentos de análisis de fase gas. Un ejemplo de ello es FAIMS (campo asimétrico Espectrómetro de movilidad de iones). FAIMS es capaz de identificar la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) pacientes mediante el análisis de los cambios en los patrones de COVs en la orina y las heces. Este estudio amplía este concepto para determinar si los pacientes de CRC pueden ser identificados a través de análisis no invasivo de la orina, usando FAIMS. 133 pacientes fueron reclutados; 83 pacientes con CCR y 50 controles sanos. Se recogió la orina en el momento del diagnóstico CRC y el análisis de espacio de cabeza realizado utilizando un instrumento FAIMS (Owlstone, Lonestar, UK). Los datos se procesaron mediante análisis discriminante Fisher (FDA) después de la extracción de características de los datos en bruto. Los análisis de FAIMS demostró que los perfiles de COV de los pacientes con CCR eran cercanos entre sí y podían distinguirse de los controles sanos. La sensibilidad y especificidad para la detección de CRC con FAIMS eran 88% y 60%, respectivamente. Este estudio sugiere que las firmas de VOC emanan de la orina pueden ser detectados en pacientes con CCR mediante la tecnología de espectroscopia de movilidad de iones (FAIMS) con potencial como una nueva herramienta de cribado
Visto:. Arasaradnam RP, McFarlane MJ, Ryan Fisher-C , Westenbrink E, Hodges P, Thomas MG, et al. (2014) La detección de cáncer colorrectal (CCR) mediante análisis de compuesto orgánico volátil urinaria. PLoS ONE 9 (9): e108750. doi: 10.1371 /journal.pone.0108750
Editor: Keping Xie, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Junio, 2014; Aceptado: August 25, 2014; Publicado: 30 de septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Arasaradnam et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se incluyen dentro del papel
Financiación: El trabajo fue apoyado por Bardhan Investigación y Educación Caridad (BRET) la caridad, la caridad Warwickshire Hospital Privado, Eveson confianza - financiado materiales.. BRET fue establecida por el profesor Bardhan pero no tenía entrada en la decisión de financiación hecha por el comité de adjudicación de subvención. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en Europa y los EE.UU. [1], [2]. En la actualidad existe una falta de pruebas eficaces de detección no invasivos para CRC. Los métodos actuales utilizan pruebas de sangre oculta en heces guayaco base (gFOB), sin embargo, esto ha ahora en gran parte sido sustituido por fecal inmunoquímica Testing (FIT). Si bien esto es una mejora, FIT sigue mostrando sensibilidad relativamente baja para el CDN, 66-88%, dependiendo de los valores de corte para la hemoglobina (50-200 ng /ml), con una especificidad del 87-96% [3] - [ ,,,0],5]. La sensibilidad para adenoma avanzado es aún más baja en 27 a 41%, con una especificidad del 91 a 97% [5]. La captación en el control utilizando muestras fecales también es un problema, con aproximadamente el 50% de los participantes invitados no aceptar FOBT cribado basado en la población en nuestra localidad.
prueba no invasiva de los cánceres, el uso de compuestos orgánicos volátiles (COV) y los gases que emanan de la orina, aliento, heces y sangre, ha recibido creciente interés y ha sido un área de investigación en expansión en los últimos años. Este trabajo comenzó inicialmente por el uso de perros para detectar cánceres, que mostró una marcada capacidad para discriminar pacientes con cáncer de individuos sanos [6], [7], [8]. Sin embargo, más recientemente, un número de grupos han indicado que es posible utilizar instrumentos de análisis de fase gas, cromatografía específicamente gas y espectrometría de masas (GC-MS), selectivo de iones de un espectrómetro de masas de flujo (SIFT) y la nariz electrónica (e-nariz ), para detectar de pulmón, mama, vejiga y próstata [9], [10], [11], [12]. Para una revisión detallada sobre biomarcadores en fase gaseosa en Gastroenterología, consulte Arasaradnam et al [13].
En relación directa con el cáncer colorrectal (CCR), trabajos recientes han demostrado que es posible discriminar el cáncer de la no pacientes de cáncer, pero también se pueden usar para la discriminación de pulmón, mama, próstata y colorrectal unos de otros mediante el análisis de muestras de aliento [14]. Esto se ve apoyado por el trabajo reciente que también se ha demostrado que el CRC se puede distinguir de los controles con más del 75% de precisión mediante GC-MS, de nuevo empleando el análisis del aliento [15]. COV presentes en la orina también se han demostrado para distinguir pacientes con CRC de los grupos de control y otros tipos de cáncer (leucemia y linfoma), con GC-MS [16]. La nariz electrónica (Cyrano 320, Sensigent, EE.UU.) también se ha demostrado para discriminar entre CRC y controles sanos cuando el perfil de VOCs en las heces se analizan (sensibilidad 85% y 87% de especificidad). Además, el e-nariz era capaz de discriminar entre adenomas avanzados y controles sanos con una sensibilidad del 62% y 86% de especificidad [5]. Estos estudios apoyan la existencia de supuestos de fase gaseosa bio-marcadores dentro de los medios de comunicación los resultados biológicos para la detección de CRC y por lo tanto podría ser la base de una herramienta de detección rápida
.
COV pueden existir en la fase gaseosa y están presentes en el aire exhalado , el sudor, la orina y las heces [17], [18]. El mecanismo para la generación de compuestos orgánicos volátiles es el sujeto de la investigación actual pero están perturbado en muchos estados fisiológicos y patológicos - afectada por la dieta y estados de enfermedad. Se cree que la generación de compuestos orgánicos volátiles en el intestino son el resultado de las bacterias del colon se someten a fermentación de polisacáridos no amiláceos - fibra consumida por el anfitrión. Como tales, representan la compleja interacción de las células del colon, la microflora intestinal humano y los patógenos invasores [19], [20]. El estudio de los productos resultantes de la fermentación que hemos dado en llamar "la fermentome '[17], [18], [21], [22] se puede medir en la orina. Este último se presume posible debido a la permeabilidad intestinal alterada proporcionada en ciertas enfermedades intestinales [23]. Creemos que los COV representan un bio-firma que representa la suma de las influencias multifactoriales (factores genéticos, ambientales, incluyendo la dieta y las enfermedades que afectan a los estados) un individuo. El objetivo de este estudio fue probar el potencial de FAIMS -. Una nueva tecnología de alta sensibilidad para diferenciar entre el CRC y controles sanos utilizando sólo las muestras de orina
Materiales y Métodos
2.1 Los sujetos
ciento treinta y tres individuos fueron reclutados para este estudio prospectivo. Ochenta y tres de estos pacientes habían confirmado histológicamente cáncer colorrectal y cincuenta eran individuos sanos que tenían una colonoscopia normales reciente. La edad media de los pacientes con CCR fue de 60 años (DE 17 años), 53 (64%) eran varones. Los datos demográficos de los sujetos se muestran en la Tabla 1.
2.2 Diseño del estudio
Este fue un estudio de control de casos donde los pacientes fueron reclutados de clínicas de consulta externa del Hospital Universitario de Coventry & amp; Warwickshire, Reino Unido. Después se recogió la orina en recipientes universales estándar Sterilin espécimen (Newport, Reino Unido) y se congeló inmediatamente a -80 ° C, para su análisis posterior por lotes.
2.3 Análisis
Las muestras se descongelaron a temperatura ambiente durante la noche , alícuotas en frascos de muestras adecuadas y se analizaron usando los métodos experimentales FAIMS describen a continuación.
2.3.1 FAIMS.
Para el análisis FAIMS, se utilizó un instrumento comercial (Lonestar, Owlstone, Reino Unido, empleando un sistema de muestreo ATLAS y el cuadro de flujo dividido). Este sistema consigue la separación de componentes químicos sobre la base de diferencias en la dependencia del campo eléctrico de movilidades químicas ionizadas. FAIMS permite que las moléculas de gas para ser separados y analizados a presión atmosférica y temperatura ambiente, a diferencia de las técnicas analíticas tradicionales similares. Después se ioniza una muestra, que se compone de iones de diferentes tamaños y tipos. Estos se introducen entre dos placas de metal y una forma de onda de alta tensión asimétrica es aplicada a estas placas, sometiendo las moléculas ionizadas a campos eléctricos elevados. La diferencia en el movimiento de estas moléculas dentro de este campo eléctrico elevado se puede medir, lo que resulta en una separación de la mezcla compleja.
Una muestra de 5 ml de orina se dividió en alícuotas en un vial de vidrio de 20 ml y se coloca en el interior de el muestreador ATLAS. El muestreador se calienta la muestra a (en nuestro caso) 40 ± 0,1 ° C, cuando la muestra alcanza la temperatura correcta (típicamente 10 min), aire sintético limpio se hace pasar sobre la muestra y en el instrumento Lonestar FAIMS. La velocidad de flujo sobre la muestra es de 500 ml /min y aumentó a 2 L /min por aire limpio adicional antes de ser pasado en el instrumento. El Lonestar está configurado para escanear entre el campo de dispersión 0 y 90% (el campo de dispersión representa la magnitud del campo eléctrico) en 51 pasos y una tensión de compensación de entre -6 y V 6 V en 512 pasos. La tensión de compensación se utiliza para eliminar el efecto de la deriva producida por el campo eléctrico elevado, por tanto, sólo las moléculas que tienen una salida de la movilidad específica de las placas en ese punto. La figura 1 muestra una típica FAIMS 'plume' producido a partir de la muestra de orina de un paciente CRC representa en una escala logarítmica.
La intensidad es en unidades arbitrarias de recuento de iones.
2,3.2 GC -MS.
para el análisis GC-MS, alícuotas separadas de 5 ml se toman de cada muestra para funcionar a través de un instrumento Bruker Scion SQ GC-MS. Cada alícuota se agitó y se calentó a 60 ° C durante 5 minutos, antes de que los contenidos de su espacio de cabeza se extraen mediante un sistema automatizado de pre-concentrador Combi-PAL ITEX. Las sustancias volátiles contenidas en el ITEX fueron luego liberados por calentamiento a 250 ° C, y se inyectaron en el instrumento en una relación de división de 1:20 con gas portador de helio. La columna Restek Rxi-624Sil (20 m de longitud, 0,18 mm ID, 1,0 um df) montado en el GC se mantuvo a una constante de 50 ° C durante 1 minuto antes de ser aumentado hasta 280 ° C a una velocidad de 20 ° C /min, separación de los compuestos orgánicos volátiles constituyentes en términos de peso molecular y polaridad. Después de una primera comprobación para producir un cromatograma, las moléculas de COV están fragmentadas por el espectrómetro de masas y se detectan a producir un espectro de masa correspondiente. Estos están correlacionados con los picos del cromatograma GC y se compruebe un Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de la biblioteca (NIST 2013) de los compuestos químicos. Esto fue perfrimed el fin de obtener información adicional sobre los grupos químicos específicos que componen el espacio de cabeza volátiles de las muestras de orina en los pacientes con CCR.
2.4 Métodos Estadísticos
Análisis de los datos de los resultados es FAIMS realizado mediante análisis discriminante de Fisher. Esto permite por la simple interpretación de datos complejos para determinar si se pueden detectar diferencias en los grupos. Los datos se procesaron en Matlab (Mathworks Inc., EE.UU., R2013b). Para el análisis, tanto de las matrices de recuento de iones positivos y negativos de cada muestra se concatenan en un único vector de 52.224 elemento (o matriz 1D). Estos fueron transformada wavelet utilizando un wavelet Daubechies D4, una técnica usada comúnmente en la compresión de datos y tiene la capacidad de separar señales sutiles dentro de un conjunto de datos. Los puntos de datos dentro de los 52.224 elementos adecuados para la discriminación son identificadas. Esto se logra mediante el cálculo del plazo de dispersión de la clase (Σσ
i) y el entre de dispersión de clase [(σ
μ)
2 /(Σσ
i)
2] para cada punto dentro el vector (por lo tanto los mismos puntos de datos (o variable) de todos los conjuntos de datos de la muestra se examinó y el plazo de clase, así como entre la dispersión clase calculado a través de todas las muestras), para generar dos matrices 1D además, de nuevo formados de 52.224 puntos de datos. Diferentes umbrales se establecen a continuación, pues dentro de la clase y de dispersión entre clase y las variables que se encuentran dentro de estos umbrales se utilizan luego para el procesamiento de datos mediante análisis discriminante Fisher (FDA, una técnica lineal pre-clasificada). Para probar la validez de la FDA, cinco muestras de cada grupo (CRC y controles) fueron retirados antes de que se realizó la FDA. Luego, basándose en los resultados de la FDA del remanente, se hace una predicción sobre el grupo de las muestras desconocidas. Esta predicción se basa en un método (vecino k-más cercano) KNN. Este proceso se repite diez veces para cada par de valores de umbral hasta umbrales óptimos, y por lo tanto conjunto de variables, se identifican. Este grupo variable se utiliza para el resto del proceso de análisis para calcular la sensibilidad y la especificidad. Para más detalles sobre los análisis descritos en detalle, por favor ver Covington et al [23]
2.5 Ética
Ciencia y la aprobación ética se obtuvo de Research & amp local.; Departamento de Desarrollo y la Comisión de Ética Warwickshire 09 /H1211 /38. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes que participaron en el estudio.
Resultados
Los datos demográficos del cáncer y el cáncer de grupo no se describen en la Tabla 1. No se diferencia estadísticamente significativa entre el grupos se observó sin embargo, como era de esperar hubo predominio de sexo masculino. Los detalles de la puesta en escena del tumor de los 83 pacientes con CRC se muestran en la Tabla 2.
El análisis de los datos FAIMS para los pacientes y los controles de CRC se llevó a cabo mediante análisis discriminante Fisher, como se ha descrito anteriormente, y el los resultados de las variables identificadas se muestran en la Figura 2. la reclasificación de CCR fue correcta en el 74% de los casos (p & lt; 0,001). La sensibilidad y especificidad del análisis para detectar FAIMS CRC fueron del 88% y 60%, respectivamente.
Los orina de pacientes de CRC también fue analizado por GC-MS, los resultados se pueden encontrar en la tabla 3, junto con una lista de los productos químicos correspondientes del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de base de datos (NIST). Sin química única fue identificado en los pacientes con CCR en comparación con los controles.
Discusión
Este estudio es el primero en nuestro conocimiento para informar de la utilidad de los análisis para la detección FAIMS CRC en la orina y soportes el trabajo previo de otras personas que utilizan nariz electrónica [5] y GC-MS [16]. Esto se ha logrado mediante la investigación de cómo los gases y vapores (COV) que emanan de las muestras de orina son dispares en aquellos con CRC en comparación con los controles. Nuestros resultados también apoyan el trabajo previo donde se observaron diferencias COV firma en pacientes con CRC dentro de los diferentes materiales biológicos (heces, aliento y la orina) [5], [15], [16]. Nuestra cohorte CRC tuvo un predominio del sexo masculino, como era de esperar para una población de pacientes con CRC, mientras que nuestro grupo de control tuvo un ligero predominio del sexo femenino. Esto podría plantear la posibilidad de sesgo de sexo dentro de la cohorte, sin embargo, mientras que el patrón de compuestos orgánicos volátiles y, por asociación, el fermentome, en teoría, podría verse afectada por el sexo y la edad, los datos de nuestros estudios previamente publicados sobre la EII, la malabsorción de ácidos biliares, cáncer pélvico y la enfermedad celíaca no han mostrado ninguna propensión a la edad y el sexo que afectan a las señales de COV [23], [24], [25], [26], [27].
de Meij et al mostraron que el correo -nose podría discriminar CRC de los controles sanos con sensibilidad 85% y 87% de especificidad, y también podría distinguir adenomas avanzados de los controles sanos con una sensibilidad del 62% y 86% de especificidad [5]. Nuestro estudio ha demostrado el uso de muestras de orina en lugar de heces - con FAIMS demostrando una sensibilidad del 88% y una especificidad del 60%. Esto tiene una importancia especial en nuestra población local en la captación de la revisión es pobre debido a la necesidad de producir muestras fecales
movilidad de iones tiene una serie de ventajas con respecto a los dos GC-MS y la nariz electrónica:., Por ejemplo, se está llevando a cabo una medición física de moléculas en lugar de una interacción química (como lo haría un e-nariz tradicional) y en segundo lugar, la sensibilidad es mucho mayor partes por mil millones es decir a partes por trillón. Esto hace que sea una plataforma ideal para un futuro instrumento de cribado sobre todo porque la sensibilidad es alta. Nuestros resultados se expanden en la investigación anterior describe cómo ambos e-nariz y tecnologías FAIMS se pueden utilizar para distinguir los efectos de la radiación en el cáncer de la pelvis [25] y las condiciones inflamatorias, por ejemplo, entre la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa [26], además de bilis malabsorción de ácidos y la enfermedad celíaca [23], [27].
marcadores de heces genéticos han recibido el interés como un objetivo de cribado no invasivo potencial de CRC. Lidgard et al [28] realizaron un estudio de análisis de ADN en heces automatizado para β-actina, mutantes
KRAS
, aberrantemente metilados
BMP3
y
NDRG4
, y la hemoglobina fecal. Esto mostró una sensibilidad de 98% y 90% de especificidad para la CRC y la sensibilidad 57-83% para adenomas avanzados dependiendo del tamaño. Nuestro estudio muestra los resultados de una sensibilidad comparable, pero a un costo mucho más bajo proceso, y con la orina en lugar de toma de muestras fecales.
La huella digital única química o 'huella digital bio-odorante' producido por los diferentes estados de la enfermedad, los individuos sanos y , muestra el potencial de esta tecnología para detectar y ayudar en el diagnóstico de CCR. También tiene el potencial para ayudar en la investigación adicional de los individuos con otras enfermedades gastrointestinales. Se cree que los gases y vapores a ser producido por el proceso de fermentación en el colon que implica una interacción compleja entre las células colonocyte, flora fecales humanos, la integridad de la mucosa y patógenos invasores [17], [18]. COV emitidos a partir de fluidos corporales por lo tanto tienen un gran potencial como biomarcadores putativos para uso en la evaluación de enfermedades gastrointestinales. Se cree que las alteraciones en el patrón de los COV para reflejar los cambios en el entorno gastrointestinal. Esto sugiere un posible papel de disbiosis microflora intestinal en la fisiopatología de CRC [29].
Conclusiones
Este estudio ha demostrado que la firma de COV presente en la orina de pacientes con CCR, puede ser distinguirse de los controles sanos utilizando FAIMS. La sensibilidad y especificidad de FAIMS es 88% y 60%, respectivamente, para CRC. Si bien esto es más bajo que el estándar de oro de la colonoscopia es comparable con las pruebas de heces fecales al día incluyendo el guayaco y métodos inmunohistoquímicos. La captación del Reino Unido para el cribado es baja; 62%, 57% y la absorción del 59% en la primera, segunda y tercera rondas del programa nacional de detección [30], y alrededor de 50% en la actualidad la población local. Una de las razones de esto es la naturaleza de la muestra biológica requerida. Ofreciendo una alternativa y una opción menos intrusiva, como la orina en lugar de las heces, es probable que sea mucho más aceptable para los pacientes, y se pueden incorporar en vías de cribado para el futuro.
Reconocimientos
quisiera agradecer WPH, BRET y la Eveson Fiduciario que proporcionó los fondos para esta investigación.