Extracto
La importancia de la neovascularización para el crecimiento del tumor primario y metastásico fomentó numerosos ensayos clínicos de inhibidores de la angiogénesis, ya sea solos o en combinación con terapias antineoplásicas convencionales. Uno de los retos con el uso de agentes dirigidos molecularmente ha sido la desconexión entre la reducción de tamaño y el comportamiento biológico del tumor, ya sea cuando el fármaco es eficaz o cuando surge la resistencia del tumor. Aquí, se presenta la síntesis y caracterización de
64Cu-nota-bevacizumab como agente de formación de imágenes PET para obtener imágenes de contenido de VEGF intratumoral in vivo.
64Cu-nota-bevacizumab con avidez acumula en 786-S xenoinjertos de carcinoma renal con niveles más bajos en órganos de acogida. RAD001 (everolimus) marcadamente atenuada
acumulación 64Cu-nota-bevacizumab en xenoinjertos-O 786 de carcinoma renal. El tejido tumoral y el análisis molecular celular validados imágenes de PET, lo que demuestra una disminución en el contenido total y secretada VEGF y VEGFR2 de activación. En particular,
imágenes de PET 64Cu-nota-bevacizumab fue concordante con la detención del crecimiento de los tumores RAD001. Estos datos sugieren que immunoPET focalización de los factores angiogénicos como el VEGF podría ser una nueva clase de marcadores que complementan los criterios RECIST en pacientes que reciben terapias molecularmente dirigidas
Visto:. Chang AJ, Sohn R, Lu ZH, Arbeit JM , Lapi SE (2013) Detección de la respuesta terapéutica mediada-rapálogo en xenoinjertos de cáncer renal Usando ImmunoPET
64Cu-bevacizumab. PLoS ONE 8 (3): e58949. doi: 10.1371 /journal.pone.0058949
Editor: J. Alexander Annala, City of Hope, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Julio, 2012; Aceptado 11 de febrero de 2013; Publicado: 14 de marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el NCI R01CA159959, el Fondo de Investigación de Urología Roe Beatriz, y el Departamento de Radiología Mallinckrodt. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la angiogénesis, el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos, es una característica del cáncer promover el crecimiento tumoral, invasión y metástasis [1]. tumores incipientes son compatibles con el oxígeno y los nutrientes de los vasos sanguíneos cercanos, sin embargo, que el tumor crece, el suministro de sangre se vuelve insuficiente y varias vías de señalización estimulan la expansión de la neovascularización [2]. Neovasos también pueden actuar como conductos de tumores metastásicos [2]. La importancia aparente de la neovascularización para el crecimiento del tumor primario y metastásico fomentó numerosos ensayos clínicos de inhibidores de la angiogénesis, ya sea solo o en combinación con terapias antineoplásicas convencionales [3], [4]. Estos agentes de retraso del crecimiento tumoral con mejoras iniciales en la eficacia terapéutica asociada con la normalización de la red vascular [4]. Sin embargo, no todos los pacientes responden a la terapia anti-angiogénico, y resistencia casi siempre se desarrolla a pesar de la mejoría inicial. Los estudios preclínicos han sugerido que los inhibidores de la angiogénesis aumentar la invasividad tumoral y la metástasis [5], aunque esta mejora agresividad clínica todavía tiene que ser claramente observado en los pacientes. Como tal, es necesaria una mejor comprensión de las limitaciones y de la resistencia adquirida a los inhibidores de la angiogénesis. la reducción de la secreción de factor angiogénico inducido por la terapia de pruebas ofrece la promesa de la identificación temprana de pacientes que responden, y la detección más rápida de la emergencia de la resistencia específica del agente.
vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF) juega un papel central en la angiogénesis y tiene surgido como una diana terapéutica importante. la expresión del VEGF se induce en tumores malignos por varios mecanismos. En el nivel de la transcripción, el VEGF es un importante objetivo de los factores inducibles por hipoxia heterodiméricos (HIF) [6]. HIF se componen de, alfa inestable (HIF-1α, HIF-2α, HIF-3α) y beta expresado constitutivamente (HIF-1β) subunidades [6]. En normoxia, prolil hidroxilasas y asparaginilo crean sitios de unión para la enfermedad de von Hippel Lindau (VHL) proteína ubiquitina ligasa E3 e inhiben HIF actividad transcripcional, respectivamente. Durante la hipoxia, las hidroxilasas dependientes de oxígeno se inhiben, los factores de HIF1 /2 de transcripción se estabilizan, y angiogénico, metabólicas, y se derivan los genes diana de células se inducen. Además de VEGF, HIF factores de transcripción regulan al alza múltiples factores angiogénicos [7]. Sin embargo, datos recientes en un modelo no patológicos de HIF-1 ganancia de función demuestra que el VEGF es el más importante para la inducción neovascular [8]. Como la pérdida de la función de células claras BVS subyace el desarrollo de carcinoma renal [9], estos tumores son particularmente hipervascularizada debido a la inducción mediada por HIFa de múltiples factores angiogénicos, incluyendo VEGF [6].
Además de factor de transcripción sobreexpresión, la vía phosphoinositide 3-quinasa (PI3K) es un módulo de regulación de HIF-paralelo y de células tumorales producción del factor angiogénico VEGF dependiente de [10]. La vía PI3K se hyperactivated en la mayoría de los cánceres humanos debido a múltiples mecanismos de [11]. mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) es una serina-treonina quinasa aguas abajo de PI3K. mTOR reside dentro de dos complejos localizados en compartimentos intracelulares distintas y cada una con funciones específicas [12], [13]. mTORC1 regula la síntesis de proteínas en múltiples niveles, incluyendo iniciación de la traducción y de la biogénesis de ribosomas [14]. Las subunidades HIFa y VEGF son mTORC1 objetivos de la traducción, y son funcionales en las células malignas de normoxia con la activación de PI3K [15]. mTORC2 modula múltiples funciones microambientales celular y secundaria, incluyendo la supervivencia celular, la motilidad, la proliferación y la angiogénesis a través de su AKT objetivos, SGK, y PKC, y HIF-2α. Como PI3K y mTOR son también aguas abajo de VEGFR2, el director la señalización del receptor de VEGF en las células endoteliales [16], mTOR tiene un potencial de doble función neovascularización en ambos tumor y las células endoteliales.
Debido a su alrededor upregulation ubicua, hay ha habido un interés clínico intensa en vía mTOR focalización en tumores malignos sólidos. La rapamicina y sus análogos, everolimus, temserolimus, y deforlimus, (rapálogos), se unen a la ciclofilina, FKBP-12, formando un complejo mTORC1 inhibición [17]. actividad mTORC2 se inhibe con la exposición prolongada rapálogo en algunas líneas celulares [18], probablemente debido a la retención de mTOR recién sintetizado en complejos rapálogo inactivos. En estudios preclínicos tempranos, la rapamicina ha demostrado disminuir tanto el crecimiento del tumor y la neovascularización [19]. En otros estudios preclínicos, everolimus inhibe el crecimiento tumoral y la expresión de VEGF [17]. Debido a los datos de eficacia de Fase III prometedores, rapálogos han sido aprobados para el tratamiento de pacientes con cáncer metastásico de células renales (CCR) [20]. Sin embargo, la resistencia terapéutica o bien está presente en el inicio o también se desarrolla durante rapálogo tratamiento [21]. Varias publicaciones recientes y pasados han puesto de relieve, ya sea de señalización de bypass, o la ganancia genética de la función de los objetivos de abajo mTOR [22] - [24]
A medida que el VEGF es un marcador de la activación de mTOR aguas abajo y un importante impulsor de la angiogénesis, su. nivel de expresión podría calificar como un marcador de la sensibilidad rapálogo. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a todas las isoformas de VEGF [25]. Estudios anteriores han sugerido que el bevacizumab radiomarcado no invasiva de imágenes y se puede cuantificar la expresión de VEGF [26] - [28]. Aunque
64Cu-DOTA (ácido 1,4,7,10 tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético) -bevacizumab mostró resultados prometedores para formación de imágenes preclínica VEGF xenoinjerto [28], la acumulación hepática mejorada asociada con el conocido en vivo la inestabilidad de cobre-DOTA, nos ha motivado a investigar un quelato de cobre más estable. Un trabajo reciente de Zhang
et al
usando NOTA (1,4,7,10 tetraazacyclonoane-N, N ', N ", - triacético). como un quelato de
64Cu-bevacizumab ilustra la superioridad de este complejo para PET de imágenes [29]. Aquí hemos utilizado y evaluamos el trazador PET específica de VEGF
64Cu-nota-bevacizumab para controlar los cambios de administración rapálogo. Primero a prueba la eficacia de formación de imágenes
64Cu-nota-bevacizumab en xenoinjertos de carcinoma renal, un tumor con sobreexpresión de VEGF marcado. A continuación, probamos
64Cu-nota-bevacizumab como un indicador de la respuesta del tumor la inhibición de mTOR. Nuestro estudio demuestra que este trazador PET anticuerpo conjugado última instancia, puede ser útil tanto para seleccionar y continuar pacientes en terapias moleculares dirigidas a los factores de crecimiento angiogénicos secretados.
Materiales y Métodos
Síntesis de
64Cu -NOTA-bevacizumab
64Cu se produce a través de la
64Ni (p, n)
64Cu reacción nuclear mediante el CS-15 ciclotrón (ciclotrón Corporation, Berkeley, CA) y se separó a través de de intercambio iónico como se describe anteriormente [30]. Bevacizumab (Avastin ™, Genentech /Roche, South San Francisco, CA) se incubó en una relación molar 1:05 con 2- (pisothiocyanatobenzyl) de ácido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (SCN- Bz-NOTA) (macrocíclicos, Dallas, TX) en 0,1 M NaHCO
3 tampón de pH 9,0 durante 30 min. El producto resultante, Nota-bevacizumab, se purificó a través de Zeba columnas giratorias desalación (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
64Cu fue complejado con NOTA-bevacizumab en una proporción de 666 MBq /mg (18 mCi /mg) de anticuerpo en 0,1 M NH
4OAc tampón de pH 5,5 a 37 ° C durante 1 h con agitación constante.
64Cu-nota-bevacizumab se purificó usando columnas Zeba vuelta desalación (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y la pureza radioquímica se determinó mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica (Superose 12 10/300 GL, GE Healthcare, Piscataway, NJ) con HEPES 20 mM y NaCl 150 mM (pH 7,3) eluyeron a un caudal de 0,75 ml /min. software Millenium 32 (Waters, Milford, MA) se utilizó para cuantificar los cromatogramas por integración.
64Cu-nota-bevacizumab se incubó a 37 ° C con suero humano durante 48 horas y se evaluó la estabilidad de la cromatografía de exclusión por tamaño.
radiotrazadores Encuadernación Cinética
VEGF
165 (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) se diluyeron en serie en las concentraciones de 0,5-veces que variaban de 10 mg /ml a 0,4 mg /ml en tampón de revestimiento de bicarbonato (mM Na 5
2CO
3, mM NaHCO 35
3, pH 9,6). 50 l de solución de VEGF en cada concentración se pipetearon por triplicado a los pocillos de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 4 ° C. La placa se lavó 3 veces con 200 l de PBS, seguido de la adición de 100 l de 1% de BSA (Sigma, St. Louis, MO) en PBS para bloquear los sitios de unión a proteínas restantes en cada pocillo. Después de la incubación durante la noche a 4 ° C, se lavó cada pocillo 4 veces con 200 l de PBS. 74 kBq /0,1 g (2 Ci) de
64Cu-NOTA-bevacizumab en 100 l de PBS se añadió a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Sin consolidar
64Cu-NOTA-bevacizumab se retiró cuidadosamente, cada pocillo se lavó 3 veces con 200 l de PBS + 0,1% Tween 80 (Sigma, St. Louis, MO), a continuación se añadieron 200 l de una solución de NaOH 0,2 N a cada pocillo y se incubaron durante 15 minutos. Se recogió la radiactividad de cada pocillo y se contó en un contador gamma.
Tumor el modelo de xenoinjerto
786-O (CRL-1932, ATCC, Manassas, VA) células de carcinoma de células renales se cultivaron en RPMI medios suplementados con suero bovino fetal 10%, y 1% de penicilina /estreptomicina. Log se recogieron las células de fase, se resuspendieron en medio a 1 x 10
5 /l, y 1 × 10
6 fueron inyectados por vía subcutánea células en los oídos de los ratones atímicos NCR-nu /nu 6-8 semanas de edad (NCI , Frederick, MD). Los tumores se obtuvieron imágenes de 3 semanas después de la inyección en un tamaño de tumor de 94,9 mm
3 (n = 4 ratones por grupo). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de investigación y con la aprobación del Comité de Estudios de Animales de la Universidad de Washington.
radiotrazadores biodistribución Estudios
In vivo
se realizaron estudios de biodistribución con los ratones desnudos atímicos (n = 4 ratones) para determinar la absorción de
64Cu-NOTA-bevacizumab en xenoinjertos de cáncer de O 786 de células renales en relación con órganos normales. i.v.
64Cu-bevacizumab, 0.555 MBq /0,83 g, 15 Ci, se inyectaron, ratones sacrificados 24 horas más tarde, y la absorción específica de tumores y seleccione órganos se midió utilizando un contador gamma con el fondo y la corrección de la descomposición. absorción específica se expresó como% de dosis inyectada por gramo de tejido (% ID /g) tal como se calcula por la normalización de la actividad total inyectada, usando una cantidad conocida de actividad inyectada como un estándar.
Small Animal estudios de PET
Pequeños animales PET /CT experimentos se realizaron con el escáner Inveon MicroPET /CT (Siemens, Knoxville, TN).
64Cu-bevacizumab se inyectaron por vía intravenosa (2.96-3.7 MBq /4.4 a 5.5 g (80-100 Ci) en 100 l 0,9% de solución salina estéril) Veinticuatro horas más tarde, los ratones fueron anestesiados con 2% de isoflurano y de imágenes. Se recogieron imágenes estáticas de veinte minutos (n = 4 ratones para cada grupo de tratamiento) y co-registradas con el software de visualización de imágenes (Inveon Investigación del lugar de trabajo, Siemens, Knoxville, TN). Regiones de interés, incluyendo el tumor y el músculo fueron contorneada, y los valores de captación estándar (SUV) para los tumores se determinaron mediante la fórmula: SUV = [(MBq /ml) x (. En peso de los animales (g)) /dosis inyectada (MBq) ].
Tratamiento RAD001
RAD001 (everolimus) emulsión (Novartis, San Diego, CA) se administra por sonda diariamente a 10 mg /kg de peso corporal. Los animales de control recibieron una emulsión de placebo (Novartis formulación patentada). Después de los experimentos iniciales de formación de imágenes descritos anteriormente, los ratones se les administró RAD001 o vehículo durante 7 días consecutivos y posteriormente volver a la imagen formada con
64Cu-NOTA-bevacizumab (2,96 a 3,7 MBq /4.4 a 5.5 g) como se describió anteriormente (RAD001, n = 4, vehículo, n = 4 ratones). Se realizaron estudios de biodistribución (como se describe anteriormente) después de la finalización de la formación de imágenes PET animal pequeño en el día 7. Para experimentos de crecimiento de tumor, una cohorte independiente de ratones de 8 a 12 la semana con tumores del oído bilaterales fueron tratados con vehículo (n = 7 ratones, 14 tumores analizados) o RAD001 (n = 9 ratones, 18 tumores). el crecimiento del tumor del oído se determinó por medición de los tres grandes dimensiones perpendiculares y el volumen del tumor en mm
3 se analizó para cada tumor en los días 7 y 14 del tratamiento.
Immunoblotting
RAD001 (n = 3 ratones) y el control del vehículo (n = 3 ratones) se recogieron tumores del oído 786-O, se homogeneizaron en tampón RIPA (Tris 50 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de glicol nonilfenil-polietileno ( Nonidet P-40 sustituto), 0,1% de SDS, 1% desoxicolato de sodio, 1% de Triton X-100) suplementado con inhibidor de la proteasa Cocktail y fosfatasa inhibidor de Cócteles 1 y 2 (todas las 01:50; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ). lisados tumorales aclarados se cuantificaron para la concentración de proteína usando el kit de ensayo BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) y se almacenaron a -80 ° C. La proteína total (120 g) se separó en geles de poliacrilamida SDS, se transfirieron a membranas de PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA), se bloquearon con leche seca no grasa 10% en solución salina tamponada con Tris (pH 7,6) que contiene 0,5% de Tween 20 (TBST ), y probaron con anticuerpos de conejo para S6K
T389, S6K, AKT
S473, AKT, pVEGFR2
Y1175, VEGFR2 (todo 1:1,000, Señalización celular Tecnología), anticuerpo policlonal de pollo VEGF (1:2,500 Ab14078, Abcam) y policlonal de conejo para la β-tubulina (1:35,000, Abcam). Después de la incubación durante la noche a 4 ° C, las membranas se lavaron tres veces en TBST, se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en rábano picante anticuerpos secundarios peroxidasa ligada (1:5,000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y se visualizaron bandas de proteínas con reactivo ECL plus (GE Healthcare, Piscataway, NJ). La carga de proteína se normalizó a ß-tubulina.
VEGF ELISA
786 células-O fueron sembradas en placas de 6 pocillos a una densidad celular de 3 x 10
5 células por pocillo y se cultivada en medio completo durante la noche. Fase logarítmica células fueron cultivadas en medio libre de suero RPMI 1640 suplementado con vehículo (DMSO) o 100 nM o 1000 nM de rapamicina durante 6 horas, el medio se reemplazó por 2 ml de fresco vehículo que contiene medio libre de suero o el mismo diferente rapamicina concentraciones, y el sobrenadante de cultivo celular se cosechó 18 horas más tarde. Secretada proteína VEGF en medio condicionado se cuantificaron por ELISA en cuatro cultivos independientes por grupo mediante el VEGF humano Quantikine ELISA Kit (R & amp; D, Minneapolis, MN). Y se normalizaron al contenido total de ADN celular
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± desviación estándar. de Student de dos colas
t-test
, la prueba de Mann-Whitney, de uno y de dos vías ANOVA y análisis de regresión lineal (GraphPad Prism 6.0b, La Jolla, CA) se utiliza para las pruebas de significación . Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Síntesis y Determinación in vitro de
64Cu-nota-VEGF bevacizumab afinidad de unión
A medida anterior. estudios que utilizan conjugados
64Cu-DOTA se detectó la acumulación hepática alta radiactividad que indica el potencial transmetalación a otras proteínas in vivo [28], [31], se optó por utilizar NOTA que forma un complejo de cobre más estable [32]. El bevacizumab se conjugó con Nota-Bz-NCS y radiomarcados con
64Cu. eficiencia radiomarcado fue 92,1% ± 4,7%, pureza radioquímica fue 98,1 ± 1,7%, y la actividad específica fue de aproximadamente 644 MBq /mg (17,4 mCi /mg) (n = 5 experimentos independientes).
64Cu-nota-bevacizumab fue estable hasta 48 horas en el suero a 37 ° C sin productos de degradación visibles en el análisis de HPLC de exclusión por tamaño.
Para probar
especificidad VEGF 64Cu-nota-bevacizumab se llevaron a cabo ensayos de inmunorreactividad. VEGF
165 se sembró por triplicado en concentraciones incrementales que van desde 0,4 hasta 10 mg /ml. La cantidad de límite
64Cu-NOTA-bevacizumab como un porcentaje de la actividad total añadido fue elevado con el aumento de concentración de 13,3 ± 0,72% a 0,4 mg /ml VEGF
165 a 34,4 ± 3,89% con 10 mg /ml VEGF (Figura 1). Co-incubación con 20 mg exceso bevacizumab no marcado disminuyó notablemente
64Cu-nota-VEGF bevacizumab
165 unirse a 2,04 ± 0,35% lo que demuestra la especificidad de la inmunorreactividad del anticuerpo radiomarcado (Figura 1)
.
El aumento de la unión de
64Cu-nota-bevacizumab se observó con el aumento de concentración de VEGF. El bloqueo de unión inhibirse usando 20 g bevacizumab no marcado destaca la especificidad trazador. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Bares mostrados son +/- desviación estándar.
64Cu-nota-Bevacizumab biodistribución y de imagen indica un mejoramiento de tumor renal localización
Para probar
64Cu-nota-bevacizumab avidez en un tumor con expresión de VEGF marcado, se realizaron estudios de biodistribución en ratones desnudos atímicos cojinete 786-O tumores del oído heterotópico Figura 2A y B). El nivel circulante de
64Cu-bevacizumab en la sangre fue de 9,3 ± 3,8% de la dosis inyectada por gramo (ID /g). la captación del tumor fue de 22,0 ± 5,3% ID /g mientras que la captación muscular era sólo el 1,1 ± 0,4% ID /g. Bazo, pulmón, el hígado y la absorción renal también fueron bajos en el 5,8 ± 2,5%, 4,8 ± 1,7%, 5,6 ± 1,4%, y 2,6 ± 0,6%, respectivamente. Así, aunque los ratones dio dos tumores, uno en cada oído, la captación en el tumor solo oído muestreada fue significativamente robusta en comparación con el anfitrión de órganos. La adición de una dosis de bloqueo 100 mg de bevacizumab no marcado inhibió significativamente el tumor
64Cu-nota-bevacizumab demuestra la especificidad captación del radiotrazador en vivo (Figura 2A). Pequeño imágenes de PET en animales demostraron una elevada absorción de tumor de
64Cu-nota-bevacizumab (SUV 10,6) (Figura 2B). Como otra prueba de la especificidad, se administró una dosis iv de bloqueo exceso de 10 veces de bevacizumab en combinación con el trazador PET
64Cu-nota-bevacizumab. La captación tisular disminuida tumor dosis de bloqueo no marcado tres veces (Figura 2B). Sorprendentemente, la dosis de bloqueo abrogada detección de imágenes del tumor (6,3 ± 2,1%), con la señal residual que emana de la piscina trazador en la sangre (Figura 2B).
(A) Los ratones con tumores de carcinoma de oído O 786 de células renales eran iv inyectados con 100 Ci de
64Cu-nota-bevacizumab (n = 4 ratones). 24 horas después de la inyección se recogieron seleccione órganos y tumores, se pesaron y la cantidad de actividad en cada tejido se evaluó en un contador gamma. La dosis inyectada descomposición corregida% (ID) /g de tejido se calculó para cada órgano. Una dosis de 100 mg de bloqueo bevacizumab no marcado notablemente reducido y en concreto la captación del marcador tumoral sin efecto detectable sobre la acumulación del trazador de órganos anfitrión. (B) Los ratones con tumores del oído carcinoma de células renales 786-S se administraron 100 Ci de la administración i.v.
64Cu-nota-bevacizumab en ausencia (panel izquierdo) o presencia (panel derecho), de 100 mg de anticuerpo no marcado. exploraciones estáticas veinte minutos fueron adquiridos 24 horas después de la inyección.
RAD001 Disminuye tumor renal Objetivo La fosforilación y VEGF contenido
Antes de probar
64Cu-bevacizumab Nota-PET respuesta terapéutica de formación de imágenes, una cohorte de ratones se trata diariamente con RAD001, 10 mg /kg, o vehículo, para determinar el efecto de la rapálogo en la señalización mTOR tumor y el contenido de VEGF. Catorce días de RAD001 producen fosforilación indetectable de la mTOR específica treonina 389 sitio de la proteína ribosomal S6 quinasa (Figura 3). En contraste con el trabajo previo con líneas celulares humanas que demuestra rapálogo retroalimentación negativa PI3K-mTORC2 inducción [33], hubo una fosforilación de AKT reducción del 15% en la serina 473 (pAKT
S473), un objetivo mTORC2, en consonancia con el secuestro rapálogo-mTOR [34]. tratamiento RAD001 disminución de la expresión de proteína VEGF tumoral en un 60% con una concomitante reducción del 60% de la fosforilación de VEGFR2, el principio de células endoteliales receptor de señalización tal como se determina por la normalización a los respectivos controles de carga de tubulina (figura 3A) VEGF. Para probar los efectos de células autónomas de rapálogos en 786-O secreción de VEGF, medio condicionado de rapamicina y culturas tratados con vehículo se analizaron para el contenido de VEGF. La rapamicina provocó una caída del 20% en VEGF secretada en comparación con el control (Figura 3B). Esta respuesta parcial de células 786-O podría ser debido a la incapacidad de la rapamicina para inhibir objetivos mTORC1 clave que regulan la traducción de mRNAs "débiles", como 4E-BP1 [13] (Figura 3). Hay varias explicaciones para el descenso más pronunciado en los niveles de VEGF en las inmunotransferencias en comparación con el análisis ELISA. Como ELISA mide VEGF secretado es posible que VEGF se secretó y antes de la iniciación del tratamiento rapamicina, por lo tanto, el medicamento sólo inhibe la traducción y secreción de factor de crecimiento recién sintetizado en las células cultivadas. Además, la rapamicina puede efectuar la vía de secreción de VEGF celular en un mecanismo distinto en comparación con el VEGF mRNA regulación de traducción. Lo más probable era la diferencia pronunciada entre cultivo celular en el que el suministro de nutrientes es uniforme, a pesar de la privación de suero, en comparación con el microambiente tumoral en ratones intactos potencialmente poseer desajustes de perfusión o la derivación arteriovenosa.
(A) RAD001 abrogada ribosomal mTORC1 mediada proteína S6 quinasa fosforilación en lisados tumorales sin afectar la fosforilación de 4E-BP1 mTORC1 mediada. contenido VEGF tumoral se redujo en un 60% y acompañada por una disminución similar en la fosforilación acorde VEGFR2. Los datos de inmunotransferencia se normalizaron a la proteína total no fosforilada para cada objetivo y de beta-tubulina. Cada carril es lisado de un tumor en un ratón. (B) Análisis ELISA de medio acondicionado a partir de células tratadas RAD001 786-O cultivadas, n = cuatro cultivos independientes por grupo de tratamiento, demostró una caída de 20% en el nivel de proteína VEGF secretada. Los datos de ELISA se normalizaron a un total de ADN celular para corregir disminuye RAD001 mediada en la proteína celular total. * P & lt;.
0,0001
64Cu-nota-Bevacizumab biodistribución Las alteraciones en respuesta a RAD001
A continuación, se investigó si las imágenes de PET
64Cu-nota-bevacizumab podría detectar RAD001 mediada por VEGF contenido tumoral disminuye en un modelo de ratón de la RCC. Se realizaron estudios de biodistribución en 7 en lugar de 14 días de la administración RAD001 para probar si la absorción de VEGF se disoció de la alteración significativa del crecimiento tumoral (Figura 4A). RAD001 disminuyó significativamente la captación tumoral
64Cu-nota-bevacizumab dos veces, los tumores tratados con vehículo, el 30,3 ± 8,3%, RAD001 13.8 ± 2.6% ID /g, respectivamente,
p Hotel & lt; 0,001. estudios de imagen MicroPET /TC realizada en una cohorte paralelo de ratones portadores de tumores (Figura 4B y C) revelaron una disminución de tres veces de tumoral intensidad de la señal
64Cu-NOTA-bevacizumab, SUV 4,0, ratones tratados con vehículo en comparación, SUV 12,2 . análisis de la respuesta de crecimiento del tumor en otra cohorte paralelo de RAD001 y de los ratones tratados con vehículo (ver Materiales y Métodos) reveló que RAD001 impidió la expansión del tamaño del tumor durante los 14 días de tratamiento, determinado por análisis de regresión lineal en el que la pendiente del incremento de crecimiento grupo de vehículo fue 14,98 (p = 0,0001), mientras que la pendiente de la grupo RAD001 tratado fue de 0,20 (p = 0,92). De dos vías ANOVA análisis también reveló una diferencia significativa en el tamaño del tumor de acuerdo a los días de medición y el vehículo frente al tratamiento farmacológico. Por desgracia, diferencial, RAD001 disminución del volumen del tumor ya había alcanzado significación estadística en el día 7, según lo determinado por un modelo lineal, p = 0,003 para el día 0 día 7 de intervalo o tiempo de análisis único punto del día 7 el tamaño del tumor entre el vehículo y grupos RAD001, Mann-Whitney U-test, p = 0,013, lo que impide la determinación del valor predictivo de las imágenes PET-VEGF en este punto del tiempo (Figura 5).
(a) la biodistribución de
64Cu- NOTA-bevacizumab en ratones (n = 4 ratones por grupo) que llevan tumores 786-o de carcinoma de células renales después del tratamiento con RAD001 o vehículo. (B) Los ratones portadores de tumores del oído carcinoma de células renales 786-S fueron escaneados al inicio del estudio después de la administración i.v. inyección de 100 Ci
64Cu-nota-bevacizumab (n = 4). RAD001 A continuación se administró durante 7 días y las exploraciones repite. Se observó una marcada disminución en la señal
64Cu-nota-bevacizumab en el RAD001 en comparación con el ratón tratado de control del vehículo. (C) Disminución del valor de captación estándar (SUV) en el RAD001 comparación con los ratones tratados con vehículo.
determinación crecimiento del tumor oído Tridimensional revela que RAD001 (▪) impide esencialmente el crecimiento de tumores del oído (n = 9 ratones portadores de tumores bilaterales 18) en comparación con el crecimiento lineal en los controles del vehículo (•) (n = 7 ratones portadores de tumores bilaterales 14).
Discusión
en este estudio, hemos éxito sintetizado y evaluado
64Cu-nota-bevacizumab para obtener imágenes de los niveles de VEGF en los xenoinjertos de tumores RCC. Este compuesto era estable, acumula específicamente en los tumores, y podría ser bloqueado por la adición de bevacizumab no marcado. Además, una disminución RAD001 mediada por la expresión de VEGF se visualiza claramente la PET utilizando
64Cu-nota-bevacizumab. disminución captación del marcador fue concomitante con efecto estático de RAD001 en el crecimiento del tumor. Por lo tanto,
64Cu-nota-bevacizumab puede ser un biomarcador sustituto novedoso para la estabilización de la enfermedad mediada por la quinasa mTOR rapálogo o tratamientos inhibidores.
respuesta terapéutica de tumores sólidos Tradicionalmente se obtuvo sobre la base de la reducción de dimensiones del tumor, ya sea medido físicamente , radiográficamente, o mediante TAC y RMN. Los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) y su versión más reciente RECIST1.1 proporciona una metodología estandarizada para las comparaciones de eficacia entre los fármacos y estudios. Sin embargo, la aparición de terapias dirigidas molecularmente desafía RECIST como un punto de referencia de eficacia [35]. Cuando las terapias dirigidas molecularmente son eficaces, producen principalmente enfermedad estable (SD) o respuesta parcial (PR) con cambios mínimos en el tamaño del tumor. Limitaciones de RECIST para la determinación de la eficacia terapia molecular motiva el desarrollo de la TC, la RM y algoritmos y técnicas de imagen por ultrasonido diseñados especialmente para fármacos que se dirigen vascular del tumor. Estos algoritmos están diseñados para detectar cambios en la densidad vascular en general tumor, factor de fuga vascular mediada angiogénico, y tumor de flujo vascular [36].
Otro enfoque para evaluar la eficacia terapia es PET. Los tumores se caracterizan por un aumento de la glucosa y la absorción de timidina en respuesta a la desregulación del metabolismo de la genética y la proliferación [37]. Los radiotrazadores
18 F-FDG (FDG) y
18 F-fluorotimidina (FLT) [38] - [40], la imagen captación de glucosa y la síntesis de ADN tumoral detección del tumor primario y la metástasis y la monitorización de la respuesta terapéutica. Tanto FDG PET y FLT pueden revelar la eficacia terapéutica antes de los cambios de volumen del tumor. Estos dos trazadores de PET son desafiados por el hecho de que algunos tipos de cáncer como el RCC (y de próstata) son predominantemente FDG insensible [41], y FLT subestima la proliferación de tumores con activado pirimidina-síntesis de novo o salvamento vía de la regulación positiva [42]. Sin embargo, en la minoría de los CRC FDG positivos, PET detecta la respuesta del tumor antes de la reducción de tamaño y predice mejor supervivencia libre de progresión (SLP) [14]
.
A pesar de las limitaciones en cánceres como el RCC, una nueva dimensión en PET se ha hecho patente en los últimos años. trazadores "ImmunoPET" son conjugados de anticuerpo-radionucleido de unión a proteínas ya sea unidas a la superficie celular, o secretadas en el microentorno del tumor [43]. El uso de quelantes bifuncionales tales como el NCS (isotiocianato) o NHS (N-hidroxisuccinimida) formas de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) o 1,4,7-triazaciclononano N, N'N "triacético (NOTA), iones de metales radionúclidos se pueden complejar en los núcleos quelantes mientras que los enlaces covalentes se forman con los grupos de lisina libres en los anticuerpos o péptidos [44]. El poder de este enfoque es que DOTA /Nota quelado trazadores de PET se pueden conjugar con anticuerpos específicos para un repertorio de factores angiogénicos. Como VEGF es el factor angiogénico director producido por RCC (y la mayoría de otros tipos de cáncer también), este factor angiogénico se ha explorado como un objetivo de formación de imágenes. Estudios anteriores han evaluado el uso de bevacizumab radiomarcados para obtener imágenes de PET de la expresión del VEGF. Por ejemplo, bevacizumab ha sido radiomarcado con 89Zr [26] y
86Y
[27] para formación de imágenes preclínica de modelos de xenoinjerto de ovario. A pesar de la capacidad de estos agentes para imagen VEGF, la alta energía y la abundancia de la decadencia gamma a partir de estos radionucleidos son una preocupación la exposición en comparación con
64Cu que tiene una abundancia decaimiento gamma de alta energía mucho menor. Paudyal
et al.
Evaluó
64Cu-DOTA bevacizumab para obtener imágenes de la expresión del VEGF preclínica en xenoinjertos de colon [28]. captación hepática fue relativamente alta, 17,2% ID /g, en contraste con nuestra trazador
64Cu-NOTA-bevacizumab donde era 4,8% ID /g. Una explicación para la captación hepática diferencial podría ser el mayor
64Cu afinidad de unión de NOTA comparación con DOTA. Nagengast
et al
.