Extracto
Antecedentes
El beneficio clínico de las pruebas de sangre oculta en las heces guayaco (FOBT) está ahora bien establecido para la detección del cáncer colorrectal. La creciente evidencia ha demostrado que las modificaciones epigenéticas y cambios en la microbiota fecal, también conocida como disbiosis, están asociados con el CRC patogénesis y pueden ser utilizados como marcadores indirectos de la CRC.
Pacientes y métodos
Realizamos un estudio transversal que incluyó a todos los sujetos consecutivos que fueron remitidos (de 2003 a 2007) para un examen colonoscopias. Con anterioridad a la colonoscopia, se cosecharon los efluentes (heces frescas, sueros-S y la orina-U) y FOBTs realizan. los niveles de metilación se midieron en las heces, S y T para 3 genes (WIF1, ALX-4, y vimentina) seleccionados de un panel de 63 genes; Se cuantificaron las mutaciones KRAS y siete poblaciones de bacterias dominantes y subdominantes en las heces. La calibración se evaluó con el Hosmer-Lemeshow chi-cuadrado, y la discriminación se determina calculando el estadístico C (área bajo la curva) y el índice de reclasificación mejora neta.
Resultados
Hubo 247 individuos (edad media de 60,8 ± 12,4 años y el 52% de los varones) en el grupo de estudio, y 90 (36%) de estos individuos eran pacientes con pólipos avanzados o adenocarcinomas invasivos. Un modelo multivariado ajustado por edad y FOBT llevó a un estadístico C de 0,83 [,77-0,88]. Después secuencial complementaria (uno por uno) de ajuste, WIF-1 metilación (S o T) y disbiosis microbiota fecal llevaron a aumentos de la C-estadística a 0,90 [0,84-0,94] (p = 0,02) y 0,81 [0.74- 0,86] (p = 0,49), respectivamente. Cuando se ajustó de manera conjunta para FOBT y WIF-1 metilación o disbiosis microbiota fecal, el aumento de la C-estadística fue aún más significativo (0,91 y 0,85, p & lt; 0,001 yp = 0,10, respectivamente)
Conclusión
La detección de metilado WIF-1 en S o T tiene una precisión mayor rendimiento en comparación con FOBT guayaco para el cribado de la neoplasia colorrectal avanzado. Por el contrario, la detección de la microbiota fecal disbiosis no fue más preciso. La sangre y análisis de orina podrían utilizarse en aquellos individuos reacios a someterse a pruebas de heces
Visto:. Un Amiot, Mansour H, I Baumgaertner, Delchier J-C, C Tournigand, Furet J-P, et al. (2014) La detección de la metilado WIF-1 gen es más preciso que un análisis de sangre oculta en heces para la detección del cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (7): e99233. doi: 10.1371 /journal.pone.0099233
Editor: Anthony W. I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 3 Febrero 2014; Aceptado: 13-may de 2014; Publicado: July 15, 2014
Derechos de Autor © 2014 Amiot et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Cancéropole Ile de France, proyecto cómica 2007-2010, (Charles Debray asociación ACD); LNCC (Liga Nacional Francesa contra el Cáncer), CCR Promoción del INSERM (2004-2006). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos, análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: Conflicto de intereses I. existen para Sobhani y el marcador de prueba WIF1 (patente registrada), y para JP Carrau para la prueba FOB (jefe de laboratorio).
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es una significativa causa de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. La incidencia de CCR ha crecido un 3 a 4% por año desde la década de 1970 [1], [2]. En la mayoría de los casos, la historia natural de CRC incluye una evolución de los pólipos de CCR avanzado que permite la detección precoz en pacientes asintomáticos. La colonoscopia, el "método estándar de oro", sigmoidoscopia flexible, y colonografía por tomografía computarizada se han demostrado ser eficaces para la detección de CRC mediante la demostración de una reducción en la incidencia de CCR y la mortalidad [3], [4], [5], [ ,,,0],6]. Sin embargo, en la mayoría de los países, ninguno de estos métodos se recomienda actualmente para el cribado masivo CRC debido a las limitaciones inherentes, que incluyen la preparación del intestino, el alto costo, bajas tasas de adherencia, y los eventos adversos ocasionales. En las últimas décadas, se han hecho intentos para establecer pruebas mínimamente invasivos para la detección de CCR. El examen de sangre oculta guayaco (FOBT) se ha demostrado que reduce la mortalidad relacionada con el CRC en tres ensayos controlados aleatorios y un estudio basado en la población [7], [8], [9], [10]. Sin embargo, FOBT tiene una baja sensibilidad y un impacto muy limitado en la transición adenoma-carcinoma, muy probablemente debido a las lesiones precancerosas tempranas sólo producen bajas concentraciones de sangre en las heces [11], [12]. La inmunoquímica FOBT cuantitativo ha demostrado recientemente una mayor sensibilidad en la detección de neoplasias avanzadas [13]. Sin embargo, todavía hay una necesidad de una prueba más precisa para mejorar el cribado de rendimiento.
En la mayoría de casos, los factores genéticos heredados hacen una contribución menor a la susceptibilidad para desarrollar CRC, mientras que los principales contribuyentes son factores ambientales [14]. De hecho, estudios previos han demostrado que el desarrollo de CRC se asocia con el envejecimiento sino también con los estilos de vida occidentales modernos y componentes de la dieta [1], [15].
La metilación aberrante de secuencias ricas en CpG (islas CpG) es una cambio epigenético que induce el silenciamiento transcripcional de genes supresores de tumores [16]. Estas alteraciones genéticas pueden ser inducidos por factores químicos y /o del medio ambiente [1]. La hipermetilación de islas CpG en genes supresores de tumores ha sido reportado en el tejido neoplásico de pacientes con CRC, así como en lesiones premalignas [17]. Se sabe que existe la metilación aberrante en el ADN, tal como la que se encuentra en las heces, suero, orina y otros fluidos corporales que circulan, y podría ser utilizado como un biomarcador para el cribado del cáncer [18], [19].
Más recientemente, los microbios que colonizan el tracto gastrointestinal, que son los principales actores en entornos biológicos, han sido sospechosos de jugar un papel en la aparición de CCR [20]. De hecho, los cambios en el luminal o microbiota intestinal adherente, llamados disbiosis, se ha demostrado en pacientes con CRC [21], [22]. En modelos animales, la contribución de las bacterias a la etiología de la CRC se ha estudiado, y se ha sugerido que podrían actuar a través de las vías inflamatorias, aunque un efecto genotóxico directo de bacterias también podría sospecharse [23]. Recientemente, hemos demostrado que el trasplante de heces de pacientes humanos con CCR a los ratones libres de gérmenes podría inducir aumentos eventos precancerosas intestinal a través de la alteración del gen huésped, la proliferación celular y el metabolismo en la mucosa [24]. Por lo tanto, los cambios en la microbiota fecal podrían ser utilizados como biomarcadores para la detección de CCR.
En el presente estudio, investigamos la exactitud realización de nuevas pruebas de cribado de CCR dirigidos a los niveles de metilación de un panel de 63 genes en las heces , la sangre y la orina, y la composición de la microbiota fecal fue evaluada por qPCR. Las últimas pruebas se compararon con FOBT guayaco en una población de base hospitalaria de los sujetos pertenecientes a grupos de riesgo medio o alto de CCR.
Pacientes y métodos
Estudio de la población
de 2003 a 2007, 247 pacientes ambulatorios consecutivos (edad media de 60,8 ± 12,4, 129 varones) con un riesgo medio o alto de CRC (antecedentes de cáncer en familiares, antecedentes personales de pólipos, cualquier síntoma abdominal o relacionados intestinales, o anemia que la colonoscopia es necesario), se incluyeron en un estudio de la colección banco de muestras. Para ser elegible para la inclusión, los pacientes tenían que tener ninguna historia previa de los siguientes: cirugía colorrectal, enfermedades como lesiones inflamatorias o infecciosas del intestino, o la necesidad de una colonoscopia de emergencia. El estudio se llevó a cabo en dos departamentos (Gastroenterología y Oncología) de un hospital universitario en el área de París de Francia.
Dos semanas antes de la colonoscopia y después de dar un consentimiento informado por escrito, los pacientes fueron incluidos en el estudio y se le preguntó a dar heces frescas, orina y muestras de sangre dentro de 2 semanas, pero hasta tres días antes de la colonoscopia. En todos los casos, se recogieron muestras de heces antes de limpieza intestinal para la colonoscopia. Se registraron ninguna dieta en particular (diabéticos, vegetarianos) y medicamentos (fármacos antidiabéticos, hypocholesterolemics y laxantes) durante este período. El estudio fue aprobado por el comité de ética de la zona de Val de Marne Paris-Est que autorizó la inscripción de pacientes en todos los centros asociados (número 2004-4 CCPPRB). Todos los pacientes recibieron información sobre el estudio, sus objetivos, y las muestras darían. Toda la información fue dada por una carta escrita a máquina por escrito en francés, y se obtuvo el consentimiento formal por escrito en un formulario copia por triplicado; una copia del formulario fue retenida por el paciente, mantuvimos una copia en el departamento de investigación clínica (CIC) y la última copia fue retenido por el promotor (Instituto Nacional de la investigación científica en medicina-INSERM). Por lo tanto, un consentimiento formal estaba disponible para cada paciente. Se llevaron a cabo entrevistas detalladas para la historia clínica y examen físico.
guayaco examen de sangre oculta
Se realizó la prueba de guayaco Hemoccult (realizado en un laboratorio certificado por las autoridades francesas en París) en todos los sujetos acuerdo a participar en el estudio. Para la FOBT, se requiere 1 muestra por las heces de 3 deposiciones consecutivas. De acuerdo con el programa en curso, se recomienda una dieta específica (sin carne durante 3 días). Los sujetos recogieron las 3 muestras de sí mismos en casa (utilizando la tarjeta kit para Hemoccult), registran la fecha de cada movimiento intestinal involucrados, y se envían las pruebas por correo. La lectura se realizó a ciegas Hemoccult por técnicos certificados sin rehidratación, de acuerdo con los protocolos establecidos por el programa nacional de cribado organizado. El cribado se considera positiva si la prueba de sangre oculta fue positivo (al menos 1 de los 6 ranuras fue positiva).
Colonoscopía
Todos los individuos fueron sometidos a un examen de colonoscopia con anestesia. sitios de colon derecho e izquierdo, así como el recto, se examinaron plenamente en todos los pacientes. Los resultados de la colonoscopia se registraron siguiendo el proceso habitual para un programa de cribado organizado en Francia. Los pólipos se eliminaron por completo durante el examen endoscopia usando mucosectomía, si es necesario. La colonoscopia se considera que es el método estándar de oro. Los resultados de la colonoscopia fueron clasificados de acuerdo a la lesión patológica más avanzada que se encuentran. neoplasias avanzadas incluyen adenomas avanzados (adenomas de medición & gt; 10 mm o adenomas con displasia de alto grado o carcinoma in situ) y el CRC invasiva (invasión de las células malignas más allá de la muscular de la mucosa). pólipos hiperplásicos no se incluyeron como neoplasias.
La cuantificación de la metilación mediante PCR cuantitativa
ADN total fue aislado de las muestras de orina, suero y heces utilizando el kit DNA Mini Qiamp (Qiagen) y luego se convierte con bisulfito de sodio y se amplifica usando cebadores de PCR específicos de locus que flanquean una sonda MGB. Se determinó el nivel de metilación para cada paciente como se describe por Eads et al [25]. Las condiciones de PCR fueron 94 ° C durante 10 minutos para la activación de la enzima, 45 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos y 60 ° C durante 60 segundos para la hibridación y alargamiento PCR. Se confirmó los resultados de metilación mediante secuenciación genómica de bisulfito directa en el 5% de los pacientes afectados investigados por sus tejidos para excluir un artefacto técnico. Se evaluó la primera Un panel de 63 genes (datos no mostrados) extraído de la literatura, y luego 3 genes de interés (WIF-1, ALX-4 y vimentina) se selecciona en base a sus valores discriminativos que se determinaron por comparaciones entre tumor y tejidos intestinales homólogos normales [26]. La eficiencia de los cebadores de los genes diana (WIF1, ALX4 y vimentina) y la limpieza de genes (albúmina BSP) para la entrada de ADN modificado se evaluó usando diluciones en serie de controles de ADN modificados metilados como se muestra en la Figura S1). Después de un estudio de viabilidad conjunto de experimentos realizados en muestras de heces, orina y suero de 48 pacientes, decidimos medir sólo WIF-1 en los niveles de metilación en el conjunto de validación de acuerdo con las más altas tasas de sensibilidad y especificidad del gen WIF-1 en comparación con ALX- 4 y vimentina. Las secuencias de cebadores y sondas para la metilación de los genes diana se enumeran en la Tabla S1.
análisis bacteriológico de muestras fecales utilizando PCR cuantitativa
enteros heces frescas se recogieron en cajas estériles, y, dentro de las 4 horas , 10 g se congelaron a -80 ° C para el análisis. El ADN bacteriano se extrajo a partir de alícuotas de heces, y después de la precipitación final, el ADN se resuspendió en 150 l de tampón TE y se almacenó a -80 ° C para su posterior análisis, tal como se describe anteriormente [26]. Se utilizó una técnica de qPCR en tiempo real para investigar la diferencia de densidades bacterianas dentro de la microbiota entre neoplasia normal y avanzada y heces pacientes con cáncer. Los cebadores y sondas utilizados en este estudio se han descrito en otra parte [26] y se presentan en la Tabla S2. QPCR en tiempo real se realizó utilizando un sistema de detección de secuencias ABI 7000 con la versión de software 1.2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), y el número total de bacterias se infiere de las curvas de calibración promedian y se expresan como valores log10, como se describe anteriormente [26]. qPCR valores fueron obtenidos por paciente y para cada componente de la microbiota intestinal. Para compensar el hecho de que las muestras de heces pueden contener más o menos de agua, los datos para cada muestra fecal se normalizaron como se describe anteriormente [26]. El nivel encontrado para cada población bacteriana dominante y subdominante particular, se restó de los todo bacterias de contenido, y los resultados se expresan como el logaritmo del número de bacterias por gramo de heces. Estos ensayos se utilizaron para comparar la composición de la microbiota intestinal de todos los temas, y los resultados se expresan como media ± desviación estándar.
KRAS análisis de mutaciones
ADN se amplificó por PCR en duplicados con una conjunto de cebadores alelo-específicas que abarca los exones 12 y 13 del gen Kras [27]. Las condiciones de PCR fueron 94 ° C durante 10 minutos, 45 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos y 60 ° C durante 60 segundos para la hibridación y alargamiento PCR. Se utilizaron dos conjuntos de cebadores y sondas de PCR: un conjunto era específica para el ADN alelo salvaje y el segundo conjunto representado el alelo mutación. Las secuencias de cebadores y sondas se enumeran en la Tabla S3.
El análisis estadístico
Las características de cada paciente se describen como un número (%) para los datos cualitativos y como mediana (rango intercuartil, IQR) o media (± 1 desviación estándar, SD) para los datos cuantitativos en función de su distribución. Se compararon las características basales de los pacientes de ambos grupos (grupos de control y de neoplasia avanzada) utilizando la prueba de chi-cuadrado de Pearson o la prueba exacta de Fisher para las variables cualitativas y la no paramétrica de Wilcoxon o pruebas de Kruskal-Wallis para las variables cuantitativas. Se utilizó la prueba de dos colas de Spearman para evaluar las correlaciones.
El odds ratio (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) de cada parámetro se estimaron usando análisis de regresión logística separada. Se dieron los resultados microbiota fecal disbiosis de 1 desviación estándar de los niveles de transformación logarítmica calculada para cada grupo de control. El análisis fue sistemáticamente ajustadas por edad para estimar de forma independiente la exactitud desempeño de cada uno pruebas de detección. La edad se maneja en continuo después de la verificación de hipótesis de normalidad. La calibración de cada modelo se estimó mediante la estadística de Hosmer-Lemeshow en el que un
valor de p
superior a 0,20 indica en forma adecuada. La discriminación de nuestro modelo se evaluó mediante el estadístico C (área bajo la curva ROC), que se calcula a partir del modelo de regresión logística multivariante. Los C-estadísticas de los modelos con y sin neoplasia avanzada se compararon mediante una prueba no paramétrica desarrollada por Delong et al y apropiado para los datos no independientes [28]. Se realizó un análisis de arranque nuevo muestreo con 1000 repeticiones de conjunto de datos de línea de base para estimar IC del 95% de C-statitistics de los modelos multivariados. La discriminación también se cuantificó mediante el cálculo del índice de reclasificación mejora neta (NRI) [29]
.
Todas las comparaciones fueron de 2 caras y un
p
valor inferior a 0,05 indica una diferencia estadísticamente significativa . Los análisis se realizaron utilizando el software STATA versión 12.0 (Stata- Corp, College Station, TX, EE.UU.).
Resultados
Estudio de la población
Se incluyeron dos cientos cuarenta y siete pacientes en el estudio. Las características de la población de estudio se enumeran en la Tabla 1. Todos los individuos fueron sometidos a una colonoscopia con el examen completo de la derecha y la izquierda del colon y el recto. Los pacientes se clasificaron de la siguiente manera: los individuos normales que se presentaron con cualquiera colonoscopia normal (n = 123) o adenomas pequeños de menos de 1 cm de diámetro (n = 34) fueron en el presente documento considera que los controles y los pacientes con neoplasia que se presentaron con CRC ( n = 66) o grandes (& gt; 1 cm de diámetro) adenomas (n = 24) fueron considerados en este documento para ser casos. El caso promedio fue de más de 10 años mayor que el paciente promedio de control. Los pacientes del grupo control con menos frecuencia informaron de una historia personal previa de pólipos y cáncer colorrectal en su familia en comparación con los casos. Los dos grupos eran igualmente equilibrada para el IMC, las comorbilidades, la absorción de la medicina, y el régimen de alimentos (Tabla 1).
Análisis de oculta en heces Prueba de sangre oculta Sangre
La prueba de sangre oculta basada en guayaco no era interpretable en 2 casos. En general, la sangre oculta en heces fue positivo en 46 pacientes de los cuales 36 (78%) tuvieron neoplasia avanzada, incluyendo 33 (72%) CRC. Entre los 199 pacientes con FOBTs negativos, 146 (73%) pacientes tenían colonoscopias normales o adenomas pequeños, mientras que 53 (27%) tenían una neoplasia avanzada, incluyendo 33 (17%) con el CRC. Por lo tanto, la sensibilidad y la especificidad de la sangre oculta en heces para las neoplasias avanzadas fueron 40,4% y 93,6%, respectivamente.
metilado WIF-1, ALX-4, y vimentina en el suero, la orina y las heces
los niveles de metilación del WIF-1, ALX-4 y los genes Vimentina fueron evaluados por primera vez en muestras fecales. En la población general, se observó la hipermetilación de genes Vimentina WIF-1, ALX-4 y en el 7,3%, 4,5% y 0,8%, respectivamente (Tabla 2). Para cada gen (WIF-1, ALX-4 y vimentina), la metilación aberrante fue significativamente más frecuente en los pacientes de casos en comparación con los pacientes control (19,3%
vs.
0,6%, 10,6%
vs
1,3% y el 32,6%
vs
. 0.0%, respectivamente) (Tabla 2). Para cada gen, la especificidad fue superior al 98% pero con una baja sensibilidad por debajo del 25%. Para el WIF-1 y ALX-4 genes, pero no el gen vimentina, el nivel de metilación fue significativamente más elevada en el caso de pacientes en comparación con los individuos de control (Figura 1).
La metilación niveles de WIF-1, ALX-4, y vimentina se evaluaron luego en muestras de orina y suero. WIF-1 parece ser el marcador más sensible de neoplasia avanzada en muestras de orina o de suero (52% y 29%) en comparación con ALX-4 y vimentina (23% y 15% vs. 4% y 8%, respectivamente). La especificidad fue superior a 93% en todos los casos. La combinación de orina y suero WIF-1 nivel de metilación dio lugar a una tasa más alta sensibilidad de 60,4% [30].
El nivel de metilación de WIF-1 se evaluó a continuación, ya sea en muestras de orina o suero para toda la validación cohorte, que incluyó a 247 pacientes. se observó hipermetilación de WIF-1 en las muestras de orina y suero en 26,7% y 32,6% de los casos y en 1,3% y 1,3% de los individuos de control, respectivamente (p & lt; 0,001 y p & lt; 0,001). La combinación de suero y orina aumentó la tasa de detección de neoplasia a 47,8% en los casos, en comparación con 2,5% en los controles (Tabla 2). El nivel de metilación fue significativamente más elevada en los casos en comparación con los controles en suero o muestras de orina (Figura 1). No se encontraron diferencias para las diferentes etapas del cáncer colorrectal de acuerdo con la American Joint Committee on clasificación cáncer
fecal disbiosis microbiota en los adenomas avanzados (& gt; 10 mm). y el cáncer colorrectal
La microbiota fecal composición estaba disponible para todos los sujetos y se presenta en la Tabla 3. en los casos de pacientes, disbiosis fecal microbiota se caracterizó por una mayor densidad de especies pertenecientes a los
Bacteroides /Prevotella
grupo frente a los controles. Teniendo en cuenta todas las personas juntas, el
Bacteroides /Prevotella
grupo no fue asociada a la edad (r = 0,09; p = 0,62) o el índice de masa corporal (r = 0,20 yp = 0,24) guía empresas
análisis de la mutación de Kras en muestras de heces
No se encontraron mutaciones en Kras (exón 12 y 13) en las muestras de heces en 16 (18%) de los pacientes con neoplasia avanzada en comparación con 16 (10%) de los individuos del grupo de control. La sensibilidad y especificidad fueron del 17,8% y del 89,8% para B mutaciones de KRAS, respectivamente. No se encontró correlación entre las mutaciones de KRAS y cambios en la microbiota o WIF-1 metilación siempre que se consideraba en las heces, sangre u orina.
La precisión de las pruebas de detección para identificar neoplasia avanzada
Los OR multivariados para cada parámetro para determinar la presencia de neoplasia avanzada se muestran en la Tabla 4. en un modelo multivariado ajustado por edad, sexo masculino [OR = 2,02; IC95% (1,07-3,82), p = 0,03], la historia de pólipos [OR = 0,24; IC95% (0,11 a 0,55), p = 0,001] y la historia familiar de CRC [OR = 0,50; IC95% (0,27 hasta 0,95), p = 0,03) se asociaron de forma independiente con la presencia de neoplasia avanzada.
Cuando la edad y los resultados de la prueba FOBT se consideraron en el mismo modelo (modelo 1) , un test positivos se asoció independientemente con neoplasias avanzadas. En un modelo similar con los resultados de la orina o suero WIF-1 prueba de metilación (modelo 2), una prueba positiva de metilación WIF-1 está fuertemente asociada a neoplasia avanzada (límite inferior del IC del 95%: 18,7). Ajuste con ESOH y la orina o suero problema metilación WIF-1 (modelo 3) mostró que la orina o suero problema metilación WIF-1 se mantuvieron fuertemente asociados con neoplasia avanzada (límite inferior del IC del 95%: 14,41), mientras que el FOBT ya no era significativo.
Cuando se consideraron la edad y disbiosis microbiota fecal, sólo el
Bacteroides /Prevotella
grupo se asoció con neoplasia avanzada (modelo 4). Cuando la disbiosis microbiota fecal y los resultados de la prueba FOBT se consideraron en el mismo modelo (modelo 5), sólo el FOBT se asoció con neoplasia avanzada.
Contribución de cada modelo para la predicción de la neoplasia avanzada
la bondad de ajuste del modelo de predicción que sólo incluyó la edad y FOBT era adecuado (
p
valor del estadístico de Hosmer Lemeshow = 0,58). Como se muestra en la Tabla 4, la exactitud (evaluada por C-estadística) de ese modelo fue significativamente menor que la orina y /o suero WIF-1 prueba de metilación (modelo 2 aumento de la C-estadística de 8,6%). Esta mejora (evaluado por C-estadística y el Índice de Mejoramiento de reclasificación neta) fue significativamente mayor en el modelo que combina la orina y /o suero de ensayo metilación WIF-1 y la sangre oculta en heces (modelo 3 aumentó la C-estadística del 9,8% y el NRI de 22,8%). Las pruebas para la disbiosis microbiota fecal (modelo 4) tuvo una precisión similar a la sangre oculta en heces. La combinación de sangre oculta en heces y pruebas de disbiosis microbiota fecal no aumentó el último precisión del modelo (modelo 5 no aumentó el C-estadística y el NRI).
Discusión
CRC es una de las principales causas de la mortalidad y una carga económica en los países desarrollados. El intento de reducir la mortalidad de la enfermedad ha llevado a los sistemas de salud pública para dar prioridad a los exámenes en masa utilizando FOBT en individuos asintomáticos. De hecho, se ha demostrado que reduce la mortalidad asociada FOBTs-CRC [7], [8], [9], [10]. Aunque la medición inmunoquímica de la hemoglobina se ha demostrado ser más sensible que la FOBT con especificidad similar, el gran número de individuos que son reacios a realizar la prueba fecal pueden limitar su uso. La eficacia de estas estrategias depende principalmente de la aceptación y el coste-efectividad del método de selección. En esta configuración, la sangre y análisis de orina podrían utilizarse en individuos potencialmente reacios a someterse a las pruebas de heces.
En este estudio, se comparó el rendimiento diagnóstico de la metilado WIF-1, un antagonista secretada de la vía de señalización Wnt , como un biomarcador de la neoplasia colorrectal avanzado en muestras de heces, suero y orina. También se incluyeron las características clínicas en el proceso de selección y se realizó FOBTs prospectivos como estándar de oro. Hemos encontrado que metilado WIF-1 tuvo el mayor rendimiento diagnóstico para predecir la neoplasia avanzada en comparación con las características clínicas, las FOBT y cambios en la microbiota, solos o en combinación. Este hallazgo es de gran interés debido a que un número significativo de pacientes negarse a realizar la prueba FOBT [31].
Por lo tanto, para el desempeño FOBT en el presente estudio, se utilizó WIF-1 a superar las limitaciones de sangre oculta en heces, porque de su rendimiento diagnóstico similar, con una sensibilidad del 47,8% y el 97,5% de especificidad. células neoplásicas de cáncer colorrectal han demostrado ser una gran paradigma debido a la heterogeneidad de las vías moleculares implicados en su desarrollo [32], [33], [34], [35]. En la mayoría de los casos, la alteración genómica inicial de la
APC /Wnt
vía de señalización es seguido por la acumulación de mutaciones conductor adicionales [36]. Esta relación ha llevado a los investigadores a creer que un único marcador de ADN puede no ser un marcador útil para la detección de CCR. En nuestro estudio, la detección de mutaciones de KRAS en muestras de heces ha confirmado este dogma mostrando resultados muy específicos pero muy poco sensible. El uso de un panel de ADN fecal de 21 mutaciones de genes mostró una sensibilidad más alta que la FOBT pero tiene una limitación coste importante [12]. La detección de metilación aberrante ha sido recientemente demostrado ser más sensible que la detección de la mutación de genes [37]. Además, metilaciones aberrantes también podrían ser detectados en la circulación de ADN, tal como la que se encuentra en las heces, suero, orina y otros fluidos corporales [39]. En este estudio, mostramos que la prueba de metilación WIF-1 es un marcador preciso de la neoplasia colorrectal avanzado en un conjunto inicial de las evaluaciones. Además, también demuestran que, o bien de orina o muestras de sangre se podrían utilizar para determinar el nivel de metilación. En particular, este marcador se puede usar en individuos que son reacios a realizar pruebas de heces. Cabe destacar que el rendimiento de sangre oculta en heces reveló una sensibilidad inferior a la reportada previamente. Esta diferencia podría explicarse por la elección de un resultado primario que se han incluido pacientes con neoplasia avanzada que es mucho más relevante en la práctica clínica y por la población de estudio que se han incluido pacientes con un promedio o alto riesgo de CCR. Esta diferencia se podría explicar por la extensión de los resultados de pacientes con neoplasia avanzada que es mucho más fiable en la práctica clínica y por la población de estudio incluyendo pacientes con un promedio de alto riesgo de CRC. Sin embargo, extendiéndose dicha prueba a los programas de cribado poblacional requiere una validación adicional en individuos asintomáticos, así como los análisis de coste-efectividad en un modelo de simulación como se informó anteriormente [38].
Además, para mejorar la precisión de las pruebas biológicas para la predicción de las neoplasias durante colonoscopias, que investigó los marcadores en la microbiota, que se está convirtiendo en un nuevo campo para estudios de enfermedades humanas. La contribución de la microbiota intestinal para CRC tumorigénesis está ahora plenamente aceptado [39]. técnicas de secuenciación de alto rendimiento para el microbioma humano se han utilizado para investigar los cambios en el núcleo filogenética bacteriana en individuos normales y en pacientes con CRC, ya sea en las heces o la mucosa microbiota asociada [21], [22]. Varios grupos de bacterias, es decir,
Bacteroides /Prevotella
[21],
Fusobacterium
,
Faecalibacterium
y en particular
Coriobacteridae
y
especies Roseburia
[22], se han demostrado estar relacionada con el CCR, y los modelos experimentales han apoyado esta causalidad hipótesis [24].
Fusobacterium nucleatum
cepas se han demostrado para promover la carcinogénesis colorrectal de la invasión de las células epiteliales mediante la producción de daños en el ADN directa relacionada genotoxina-o mediante la inducción de la inflamación [23], [40], [41]. En el presente estudio, hemos confirmado una disbiosis específico asociado con neoplasia colorrectal avanzado que se caracteriza por una mayor densidad de especies pertenecientes a los
Bacteroides /Prevotella
grupo. Sin embargo, este resultado no mejoró el rendimiento de detección de la FOBT o la prueba WIF-1. Los estudios futuros utilizando métodos de secuenciación más profundas y /o enfoques metagenomic están garantizados para permitir que una herramienta de detección basado en la microbiota fecal.
Conclusión
En este estudio, la detección de metilado WIF-1 en las heces, orina o muestras de suero tiene una mayor precisión de diagnóstico para detectar neoplasia avanzada en comparación con FOBT (0,90 [0,84 a 0,94] frente a 0,83 [0,77-0,88], p = 0.02). Se necesitan más estudios para investigar si los cambios en la microbiota podrían ser biomarcadores de neoplasia colorrectal avanzado, especialmente el uso de bacterias candidatos y los estudios de metagenómica. Suero y orina WIF-1 pruebas de metilación podría ser utilizado en individuos reacios a someterse a pruebas de heces y deben ser evaluados en la actualidad en el contexto de la detección.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Eficiencia de cebadores de genes diana (WIF1, ALX-4 y vimentina) y limpieza de genes (albúmina BSP) utiliza para la cuantificación de metilación utilizando diluciones seriadas de control de ADN modificado metilado. Para cada punto de datos se realizaron tres análisis independientes. La ecuación de la curva de regresión lineal, así como el factor de correlación se indican en cada gráfico
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s001 gratis (DOC)
Tabla S1. .
Metilado cebadores y sondas de genes orientados
doi: 10.1371 /journal.pone.0099233.s002 gratis (DOCX)
Tabla S2.
Group y cebadores y sondas específicas para cada especie 16S rRNA genes orientados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s003 gratis (DOCX) sobre Table S3.
Kras cebadores y sondas de mutación
doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s004 gratis (DOC)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a M. Goossens , K. Leroy, R. Inchitti, B. Coste, B. Ghaleh-Marzban, O. Montagne, ML. Auriault, MT. Chaumette, S. Vialette, F. Bouabbas, J. Francese, R. Jian, T. Aparicio, D. Abdelrahman, H. Hagège, A. Courillon Mallet, JL. Dupas, R. Benamouzig, M. CAVICCHl, Cl. Altman, E. Zrhien, G. Tordjman, F. Venezia, F. Uzzan, D. Gilot, P. De Fleury, M. Algard, M. Prieto, M. Petit, J. Samama, D. Lucienne, JC. Delchier, M. Levy, y A. Charachon por su valiosa contribución al presente estudio.