Extracto
Objetivo
La capacidad de predecir las respuestas a la quimioterapia para el cáncer de ovario seroso epitelial (EOC) sería interesante ya que los pacientes EOC intrínsecamente chemoresistant (enfermedad persistente o recurrente dentro de los 6 meses) de ganancia poco beneficio de la quimioterapia estándar. El objetivo de este estudio era detectar e identificar biomarcadores distintivos en la ascitis de EOC serosa asociados a la quimio-resistencia intrínseca.
Métodos
Las muestras de proteína a partir de ascitis de 12 sensible a la quimioterapia y 7 pacientes EOC serosas intrínsecamente chemoresistant eran analizaron mediante la diferencia de fluorescencia de dos dimensiones de electroforesis en gel (2-D DIGE) junto con desorción por láser asistida por matriz /ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF /TOF MS). Por otra parte, las proteínas identificadas fueron validados por ELISA en muestras de ascitis de 19 sensible a la quimioterapia y 9 pacientes EOC intrínsecamente chemoresistant.
Resultados
El número de manchas detectadas en todos los geles 2-D DIGE oscilaron entre 1,523 -1711 usando el software de análisis DeCyder. Treinta y cuatro puntos fueron expresados diferencialmente en base a los criterios de una relación media de más de 1,5 y un test t de Student
P
valor & lt; 0,05. Tras el análisis de MALDI-TOF /TOF MS, 11 proteínas expresadas diferencialmente, incluyendo 3 regulados hasta 8 y proteínas reguladas por, en la ascitis de tumores chemoresistant se identificaron con éxito. De las cuatro proteínas seleccionadas (ceruloplasmina, apolipoproteína A-IV, transtiretina y haptoglobina) en la ascitis probados por ELISA, solamente ceruloplasmina era presentes a niveles significativamente diferentes entre el quimioresistente y ascitis muestras sensibles a la quimioterapia con concentraciones promedio de 192,2 g /ml y 157,5 mg /ml, respectivamente (
P
= 0,001).
Conclusión
el nivel significativamente hasta regulada de ceruloplasmina en el líquido ascítico de pacientes chemoresistant intrínseca EOC serosas sugiere su potencial como un biomarcador pronóstico para las respuestas a la quimioterapia. Este hallazgo le pide una mayor investigación con un estudio más amplio con el fin de validar la utilidad clínica de la ceruloplasmina
Visto:. Huang H, Li Y, Liu J, M Zheng, Feng Y, Hu K, et al. (2012) de selección e identificación de biomarcadores en ascitis relacionados con quimiorresistencia intrínseca de los cánceres de ovario seroso epitelial. PLoS ONE 7 (12): e51256. doi: 10.1371 /journal.pone.0051256
Editor: Alexander James Roy Bishop, Universidad de Texas Health Science Center en San Antonio, Estados Unidos de América
Recibido: 15 de Junio, 2012; Aceptado: 30 Octubre 2012; Publicado: December 10, 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, china (Nº 7001535). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
basada en platino quimioterapia de combinación es el tratamiento estándar de primera línea para el carcinoma epitelial de ovario en estadio avanzado (EOC). Los tumores se consideran "sensibles al platino" si el intervalo libre de progresión clínica es más de 6 meses, pero aproximadamente el 20% y el 30% de los pacientes progreso o sus tumores rápidamente se vuelven resistentes a este tratamiento [1]. Estos pacientes con quimio-resistencia intrínseca que experimentan una recurrencia dentro de los 6 meses obtienen pocos beneficios de tratamiento estándar. También hay evidencia que sugiere que el mayor es el intervalo hasta la recurrencia, mejor es la tasa de respuesta a la quimioterapia posterior [2]. Por lo tanto, la quimio-resistencia de los cánceres de ovario puede estar presente desde el comienzo del tratamiento (resistencia intrínseca) o puede desarrollarse durante el tratamiento (resistencia adquirida).
En la actualidad, la quimio-resistencia de EOC sólo se puede determinar de forma retrospectiva los pacientes han experimentado después de la carga y la toxicidad de la terapia ineficaz. Por lo tanto, la identificación de biomarcadores moleculares característicos relacionados con la quimio-resistencia intrínseca en el EOC puede conducir a terapias y mejora de los resultados personalizados de forma individual ya que la quimioterapia estándar les proporciona muy poco beneficio.
Varios estudios recientes han utilizado microarrays de genes para identificar la expresión de genes distintos en pacientes con cáncer de ovario intrínsecas chemoresistant en diferentes plataformas, tales como arrays de cDNA de nylon, chips de Affymetrix y Agilent microarrays de oligonucleótidos [3], [4]. Estos estudios han identificado diversos genes de pronóstico y de predicción que permitan distinguir temprana desde finales de recaída o progresión de la enfermedad. Sin embargo, la transcripción de un gen diana en el tumor puede no ser un buen indicador de la resistencia a fármacos y el pronóstico para el cáncer de ovario. Por ejemplo, la abundancia de ARNm no se puede correlacionar con la expresión de la proteína correspondiente y función. Además, para algunos pacientes con cáncer de ovario primario o recurrente, muestras de tejido no siempre están disponibles para perfiles de genes.
A diferencia de otras metástasis maligna pélvica /abdominal, ascitis masiva son una manifestación clínica distintiva en EOC avanzada, con más de 80% de estos pacientes tienen metástasis generalizada a las superficies serosas y peritoneal asociado y /o derrames pleurales [5]. Los fluidos corporales se han demostrado ser excelente medio para el descubrimiento de biomarcadores en el cáncer, y el fluido ascitis que contiene células epiteliales malignas y células mesoteliales activados, que pueden producir citoquinas, factores de crecimiento y los componentes de invasión de promoción asociados con la invasión y la metástasis [6]. Por tanto, este fluido contiene el secretoma de las células de cáncer de ovario y refleja otros factores microambientales de la malignidad.
Por lo tanto, la aplicación de la técnica de constante avance de la proteómica para el análisis de la ascitis puede facilitar el descubrimiento de nuevos biomarcadores que son más sensibles y específica a los actualmente disponibles. El objetivo de nuestro estudio era detectar e identificar biomarcadores distintivos en la ascitis de cáncer de ovario asociado con la quimio-resistencia intrínseca por diferencia de fluorescencia de dos dimensiones en la electroforesis en gel de la tecnología (2D-DIGE), lo que ayudaría a identificar a estos pacientes con mal pronóstico y mejorar su clínica resultados con terapias alternativas.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Este estudio fue aprobado por el Comité Ético del Centro de cáncer Junta de Revisión Institucional de la Universidad Sun Yat-sen. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente.
Pacientes y preparación de muestras de
En total, se recogieron 19 muestras de ascitis para 2D-DIGE y 28 casos de ascitis para la validación de ELISA durante el período de febrero . 1 de 2009 al 31 de diciembre de 2010 de los pacientes EOC serosas intactas que se sometieron a cirugía citorreductora satisfactoria. Se excluyeron las mujeres con antecedentes de cáncer y aquellos que reciben quimioterapia neoadyuvante. cirugía citorreductora se realizó a través de una incisión en la línea media abdominal. Se obtuvieron muestras de 5 ml de líquido ascítico y se almacenaron a 80 ° C en nitrógeno líquido antes de la histerectomía total, salpingooforectomía bilateral, omentectomía y la resección de todo el tumor y linfadenectomía voluminosos visible y palpable, de acuerdo con las directrices National Comprehensive Cancer Network (NCCN) . Información sobre el tratamiento y la respuesta se obtuvo mediante revisión de la historia del paciente.
Después de citorreducción, los pacientes recibieron seis ciclos de quimioterapia basada en platino combinación. Los medicamentos de quimioterapia incluyen paclitaxel (135-175 mg /m
2), carboplatino (área bajo la curva [AUC] 5-6), doxepaclitaxel (70 mg /m
2) y cisplatino (65-75 mg /m
2). Sobre la base de las guías de la NCCN, intrínsecamente tumores chemoresistant se definieron como aquellos con enfermedad persistente o recurrente dentro de los 6 meses después del inicio de la primera línea basada en platino quimioterapia de combinación. tumores sensible a la quimioterapia se clasificaron como aquellos con una respuesta completa a la quimioterapia y un intervalo libre de platino de & gt;. 6 meses
La ascitis se centrifugaron a 2000 rpm durante 15 min a 4 ° C para separar el fluido de los componentes celulares . La suspensión se sometió a ultrasonidos brevemente y los escombros se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. El sobrenadante se resuspendió y se lavó tres veces en solución de sacarosa tamponada con Tris enfriado con hielo (Tris 10 mM, sacarosa 250 mM, pH 7,0) y luego se raspó y se lisaron en tampón de lisis enfriado con hielo (30 mM Tris-HCl, 7 M urea , 2 M tiourea, 4% w /v CHAPS, pH 8,5).
ascitis muestras se procesaron mediante el ProteoPrep azul albúmina agotamiento Kit (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) que elimina selectivamente la albúmina e IgG de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para purificar la extracción de proteínas y determinar la concentración de proteína final, el 2-D Kit de Limpieza (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) y el kit Quant 2-D (GE Healthcare) se utilizaron secuencialmente.
Diseño del estudio Etiquetado y proteína de la muestra con CyDye
Doce muestras chemosensitve fueron divididos en dos subgrupos con seis muestras de cada uno, y siete muestras de la quimio-resistencia se asignaron asimismo en dos subgrupos con cuatro o tres muestras de cada uno. Cantidades iguales de las muestras de proteínas en el mismo subgrupo se mezclaron y se separaron en cuatro alícuotas iguales (50 g cada uno). Dos de las alícuotas de las muestras de proteínas sensibles a la quimioterapia fueron marcadas con Cy3, y dos de las alícuotas de las muestras chemoresistant fueron etiquetados con Cy5. Las dos muestras restantes chemosensitive fueron etiquetados con Cy5 y las otras dos muestras quimiorresistentes con Cy3. Una muestra que consiste en cantidades iguales de todas las muestras se utilizó como estándar interno combinado (50 g) y se marcó con 200 pmol de Cy2. Por lo tanto, una piscina sensible a la quimioterapia de pacientes (Cy3 o Cy5), una piscina quimioresistente paciente (Cy5 o Cy3) y un patrón interno (Cy2) se llevaron a cabo en cada gel, con cuatro geles en total en base a nuestro diseño. Se adoptó esta estrategia de intercambio de tinte para evitar el sesgo de tinte y permitió la distribución equitativa de los tintes Cy en ambos grupos de pacientes.
etiquetado de proteínas se llevó a cabo con CyDye DIGE Fluors (GE Healthcare) como se describe en el manual del usuario Ettan DIGE. En pocas palabras, después de incubar en hielo durante 30 min en la oscuridad, se añadió 1 ml de lisina 10 mM para detener la reacción. proteínas Para cada gel, marcado con Cy5 Cy2-, Cy3 y (50 g cada uno) se mezclaron y se ajustaron a 450 l con tampón de rehidratación [7 M urea, tiourea 2 M, 4% (p /v) de CHAPS, DTT 40 mM , 1% de tampón IPG (pH 4-7), 0,002% (w /v) de azul de bromofenol].
2D-DIGE
. Después de la rehidratación, la mezcla de proteína marcada para cada gel se aplicó a una Immobiline DryStrip (24 cm, pH 4-7; GE Healthcare). Isoelectroenfoque (IEF) se llevó a cabo con un aparato Ettan IPGphor II (GE Healthcare) de la siguiente manera: 30 V durante 12 horas, 500 V durante 1 hora, 1.000 V durante 1 hora y 10.000 V por hasta un total de 85.000 voltios horas . Después de IEF, las proteínas se redujeron y alquilarse mediante tratamientos sucesivos de 15 min con tampón de equilibrio que contiene 2% (w /v) de DTT, seguido de 2,5% (w /v) de yodoacetamida. Las proteínas fueron resueltas en el 12,5% en geles de SDS-PAGE utilizando un instrumento Ettan DALTsix (GE Healthcare). Con el fin de facilitar el análisis de MS, una muestra no marcado proteínas de la piscina (500 mg) se llevó a cabo en paralelo en un gel preparativa y se tiñó con Deep Purple total de proteínas de manchas (GE Healthcare) según las instrucciones del fabricante.
Imagen Gel adquisición y análisis
Gel imágenes fueron adquiridas en un escáner Typhoon 9400 (Amersham Biosciences) y se analizaron usando software DeCyder (V6.0, GE Healthcare) como se describe anteriormente [7]. Las señales Cy2, Cy3 y Cy5 se obtuvieron imágenes de manera individual con longitudes de onda de excitación /emisión de 488/520, 532/580 y 633/670 nm, respectivamente. geles preparativos (de color morado oscuro de la mancha de proteína total) fueron escaneados con longitudes de onda de excitación /emisión de 532/560 nm de acuerdo con el manual del usuario. Las proteínas en las muestras de ascitis chemosensitive se compararon con los de los quimiorresistentes. Los aumentos o disminuciones de la abundancia de proteínas de más de 1,5 veces (t-test y ANOVA,
P Hotel & lt; 0,01) se consideraron cambios significativos. Las manchas de proteínas correspondientes fueron seleccionados en el gel teñido preparativa para la recolección de punto.
Proteína punto Manipulación
Las manchas de proteínas seleccionadas en los geles preparativos se recogieron y se gestiona de manera automática en una estación de trabajo de manipulación Ettan Spot ( GE Healthcare). Las manchas de proteínas seleccionadas se lavaron con bicarbonato de amonio 15 mM y 50% de metanol y luego se digieren en 0,02 mg /ml de solución de tripsina grado secuenciación (Promega, Madison, WI, EE.UU.) a 37 ° C durante 2 h. Los péptidos trípticos se extrajeron con 50% (v /v) de acetonitrilo (ACN) y 0,5% (v /v) de ácido trifluoroacético (TFA), se disolvió en 5 mg /mL R-ciano-4-hidroxicinámico (Amersham Bioscience) en 50% (v /v) de ACN y 0.1% (v /v) de TFA y luego manchado en la placa de muestra de MS.
láser asistida por matriz de desorción /ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF /TOF MS) Análisis
identificación de proteínas se realizó con el ABI 4800 Proteómica MALDI-TOF /TOF Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en el modo de ion positivo reflector. masas pico monoisotopic fueron adquiridos en una gama de 900-4,000 Da con una relación señal-ruido (S /N) & gt; 200. Tripsina péptidos autolíticos de masas 842,5 y 2.211,1 fueron utilizados como estándares internos. Cinco de las señales de iones más intensos se han seleccionado automáticamente como precursores para la adquisición de MS /MS, con exclusión de los picos de tripsina autolisis y señales de iones matriz. El péptido masa de huellas digitales (PMF) combinado MS /MS espectros se registraron en contra de la base de datos utilizando el software GPS NCBInr Explorador ™ (versión 3.6, Applied Biosystems) y la mascota versión 2.1 (Matrix Science). Los parámetros de búsqueda se establecieron de la siguiente manera:
Homo sapiens
, la escisión de tripsina (uno se perdió la escisión permitidos), carbamidomethylation como fijo modificación, la oxidación de la metionina como variable modificación, la tolerancia de masas péptido fijado en 75 ppm y el fragmento de tolerancia establecidos en 0.2 da. Una Mascota puntuación significativamente alta que resultó en un intervalo de confianza (IC) del 95% mayor que para los PMF o MS /MS datos para un punto se consideró como una proteína identificada con credibilidad. Los otros criterios incluyen un mínimo de cuatro péptidos impacta en la identificación basada en datos de PMF y al menos dos péptidos con secuencias distintas identificadas en el análisis MS /MS.
ELISA Validación
ascitis muestras (5 ml ) se centrifugaron a 2.000 rpm durante 15 min a 4 ° C para separar el fluido de los componentes celulares. La suspensión se sometió a ultrasonidos brevemente y los escombros se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. El sobrenadante se volvió a suspender y se almacenó a -80 ° C.
kits de ensayo ELISA para cada uno de los analitos seleccionados para su posterior análisis se compraron de Abcam. Estos analitos fueron los siguientes: apolipoproteína A-IV (Apo-AIV), ceruloplasmina, transtiretina y haptoglobina. Los ensayos se realizaron siguiendo las instrucciones del kit. En pocas palabras, el cambio de color debido a la reacción enzima-sustrato de cada pocillo en la placa de microtitulación se midió espectrofotométricamente a una longitud de onda de 450 nm. La concentración de cada proteína de prueba en la muestra se determina entonces mediante la comparación de la densidad óptica (OD) a la de la curva estándar.
Se realizó la prueba t de Student para comparar las diferencias entre los valores de proteína de suero. El paquete de software SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó para llevar a cabo los análisis estadísticos, y una de dos colas
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
resultados
Información del paciente clínico
Diecinueve ascitis muestras de pacientes EOC serosas se analizaron mediante 2D-DIGE para detectar biomarcadores potenciales asociados con las diferentes respuestas a la quimioterapia. Las muestras de una cohorte independiente de 28 pacientes con EOC serosa se utilizaron para la validación de los resultados 2D-DIGE por ELISA. Todos los pacientes habían recibido cirugía citorreductora satisfactoria. No hubo diferencias significativas en la edad al momento del diagnóstico, la diferenciación del tumor y la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia (FIGO) puesta en escena entre los pacientes de los grupos sensibles a la quimioterapia y chemoresistant. Características demográficas y clínicas de los casos se muestran en la Tabla 1.
Además, las tasas de supervivencia de los 28 pacientes evaluados por ELISA se compararon en función de sus diferentes respuestas a la quimioterapia. En marzo de 2012, cuatro de los nueve pacientes (44,4%) en el grupo quimioresistente y tres de diecinueve pacientes (15,8%) habían muerto en el grupo de quimiosensibilidad. El tiempo medio de supervivencia de los nueve pacientes con cáncer de ovario chemoresistant en nuestro estudio fue de 18,9 meses. Sin embargo, era necesario un período de seguimiento de tiempo para determinar una mediana de supervivencia de los pacientes precisa chemosensitive, que era más de 18,9 meses. Basado en el período de observación en este estudio, la diferencia en la supervivencia entre los dos grupos, utilizando las estimaciones de Kaplan-Meier observados fue significativa (
P
= 0,007), lo que favorece los que tienen mejores respuestas a la quimioterapia (Fig. 1) .
a diferencia significativa (
P
= 0,007) se observó en la supervivencia, lo que favoreció pacientes con tumores sensibles a la quimioterapia.
2D-DIGE Análisis y MS /MS identificación
de acuerdo con nuestro diseño experimental se describe en Materiales y métodos, cuatro geles 2D-DIGE en total se han creado para el análisis proteómico de quimioresistente frente ascitis de pacientes chemoresistant. Para cada gel una imagen fusionada se genera a partir de tres imágenes de la sensible a la quimioterapia, quimioresistente y muestras patrón interno. Un gel DIGE representativo que muestra la superposición de la Cy2, Cy3 y Cy5 etiquetados imágenes se muestra en la Figura 2.
una imagen 2D-DIGE representante (imagen fusionada) que muestra el perfil de proteínas de la ascitis de cáncer de ovario sensible a la quimioterapia y quimiorresistente pacientes marcadas con Cy5 (manchas rojas) y Cy3 (manchas verdes), respectivamente, con un estándar interno marcado con Cy2. tiras IPG (24 cm, pH 4-7) se utilizaron para la IEF antes de la SDS-PAGE estándar (12,5% de poliacrilamida) para la segunda dimensión. El rango de peso molecular en la dimensión vertical es de aproximadamente de 150 a 10 kD. Las proteínas identificadas como diferencialmente expresados se indican con flechas amarillas con números asignados a partir del análisis DeCyder. Los números de la figura corresponden a las presentadas en la Tabla 2; (Parte inferior) espectro de masas MALDI-TOF-MS de la mancha 1543 identificado como ceruloplasmina acuerdo con los picos coincidentes.
Se detectaron un total de 1.523 a 1.711 puntos en diferentes diferencial en gel Análisis (DIA) espacios de trabajo en todos los geles usando el software DeCyder. En el módulo de Análisis Biológico Variación (BVA), la imagen de Cy3 número cuatro en gel fue elegido como el maestro de gel, ya que tenía el número máximo de puntos. Se encontraron treinta y cuatro puntos que se expresó diferencialmente sobre la base de los criterios de tener una relación media de más de 1,5 o inferior a -1,5 y un estudiante t-test
& lt valor P
; 0,05. Entre ellos, se encontraron 14 puntos para ser las reguladas en la ascitis chemoresistant, y 27 fueron reguladas en comparación con los pacientes sensibles a la quimioterapia.
Algunos de los puntos diferenciales detectados por el software DeCyder no puede ser visualizado en el preparativa en gel teñido con coomassie coloidal probablemente debido a la baja abundancia. Después de la revisión visual, se seleccionaron 20 puntos de proteínas que muestran alta abundancia y la expresión alterada de manera significativa en quimioresistente frente a los pacientes sensibles a la quimioterapia para el análisis MALDI-TOF /TOF MS. Un total de 11 proteínas expresadas diferencialmente, incluyendo 3 hasta reguladas y 8 proteínas reguladas por, en la ascitis de tumores chemoresistant en comparación con los tumores sensibles a la quimioterapia se identificaron con éxito. El recuento de péptidos de las proteínas identificadas varió de 4 a 33. veces los cambios de los niveles de las 11 proteínas identificadas en los dos grupos, junto con los resultados de búsqueda detallados de la mascota se dan en la Tabla 2.
Varias proteínas fueron identificados en varios puntos. Por ejemplo, los puntos 1421, 1593 y 1598 fueron cada uno identificado como la proteína transtiretina, que es un transporte y proteína de fase aguda, o sus variantes. Del mismo modo, los puntos 1614 y 1626 fueron identificadas como haptoglobina, mientras que los puntos 1536 y 1543 se determinó que eran ceruloplasmina y su fragmento proteolítico. Las proteínas identificadas están implicados en cuatro aspectos diferentes de la función de las células y están relacionados con la progresión tumoral y la metástasis (una proteína del citoesqueleto, proteínas del metabolismo /lípido tres de energía, tres proteínas portadoras y cuatro proteínas de fase aguda).
ELISA validación de Apo-AIV, ceruloplasmina, transtiretina y haptoglobina
Para validar los resultados del análisis proteómico, que determina los niveles de cuatro proteínas que incluyen Apo-AIV, ceruloplasmina, transtiretina y haptoglobina en muestras de ascitis del 19 sensible a la quimioterapia y 9 pacientes EOC intrínsecamente chemoresistant por ELISA. Sobre la base de los perfiles proteómicos anteriores y teniendo en cuenta nuestro propósito de la detección de biomarcadores únicos en la ascitis, la proteína del citoesqueleto (ACTB) fue excluido de este análisis.
Los resultados del ELISA confirman nuestros hallazgos MALDI-TOF /TOF MS en que el nivel de ceruloplasmina fue significativamente mayor en quimiorresistente que en ascitis sensible a la quimioterapia. La concentración media de ceruloplasmina era 157,5 g /ml en el grupo sensible a la quimioterapia y 192,2 g /ml en el grupo quimiorresistente (
P
= 0,001), mientras que los niveles de Apo-AIV, transtiretina y haptoglobina no fueron significativamente diferentes entre los dos grupos. Estos resultados se resumen en la Tabla 3.
Discusión
El pronóstico del cáncer de ovario se sabe que está fuertemente asociado con la longitud del intervalo libre de platino de la primera línea primaria tratamiento de quimioterapia de combinación basada en platino hasta la recaída. Cuanto más tiempo dura este intervalo, mejor es la tasa de respuesta a la quimioterapia subsiguiente [8]. Por lo tanto, la quimioterapia estándar es en gran parte no beneficioso para los pacientes con cáncer de ovario intrínsecamente chemoresistant (con enfermedad persistente o recurrente dentro de los 6 meses). La capacidad de predecir la respuesta a la quimioterapia estándar en estos pacientes sería extremadamente valiosa al permitir el uso temprano de la terapéutica individualizada para ayudar a prolongar la supervivencia y evitar efectos secundarios innecesarios de tratamientos ineficaces.
Hemos observado que muchos etapa avanzada pacientes con cáncer de ovario presentan con el rápido crecimiento de los tumores intraperitoneales junto con distensión abdominal como resultado de la acumulación de fluido de ascitis en la cavidad peritoneal. Mecánicamente, la formación de ascitis se produce como células malignas secretan proteínas, factores de crecimiento y citoquinas que causan la neovascularización, la angiogénesis, el aumento de la filtración de líquido y /o obstrucción linfática, lo que resulta en la acumulación de líquido en suero como en el abdomen [9], [10]. El medio rico proporciona soporte para las células malignas que proliferan y producen metástasis aún más a pesar de la falta de sustratos de matriz, permitiendo que estas células para superar la apoptosis asociada a la pérdida de inserción. Esto implica que las células malignas y células mesoteliales en la ascitis hasta de regular las señales de supervivencia con el fin de persistir en el hipóxico pero por lo demás rica medio líquido [11]. Por lo tanto, la ascitis es un excelente depósito para la identificación de biomarcadores de cáncer útiles, especialmente en pacientes EOC [12].
En un estudio por el grupo de Kislinger, ascitis se separaron en fracciones celulares y fluidos, seguido por análisis de espectrometría de masas de cada fracción [13]. Aunque se identificaron más de 2500 proteínas dentro de ascitis, sólo 229 proteínas se encuentran en la fracción fluida. Después de un análisis computacional integrado del proteoma ascitis se combina con los datos proteómicos de plasma humano y conjuntos de datos de microarrays de orina y proteína-proteína interacción I2D base de datos, se seleccionaron 80 candidatos serológicos biomarcadores de cáncer de ovario para su posterior validación. Kuk y colegas también llevaron a cabo análisis proteómico de líquido ascítico basado en múltiples técnicas de separación y fraccionamiento [14]. Un total de 52 proteínas fueron seleccionados de 445 proteínas únicas en el líquido ascítico como buenos candidatos a biomarcadores de cáncer de ovario en las futuras investigaciones. Todos estos autores análisis proteómicos encontrado que es un recurso importante para la investigación del cáncer de ovario y un marco para el descubrimiento de biomarcadores
.
A nuestro entender, los estudios proteómicos de ascitis de cáncer de ovario son limitados, y un estudio comparativo entre quimioresistente intrínseca y sensible a la quimioterapia ascitis de cáncer de ovario por la tecnología DIGE no se ha informado anteriormente. Los resultados de nuestro estudio pueden ayudar en la predicción de la respuesta terapéutica y pronóstico de la enfermedad para pacientes con cáncer de ovario. Nuestro primer objetivo era encontrar biomarcadores únicos sólo en el líquido ascítico y no en la fracción de células como en el estudio de Kislinger [13]. Por lo tanto, separamos la fracción fluida de los componentes celulares de 2D-DIGE por centrifugación. Como biomarcadores pueden estar presentes a bajas concentraciones en los fluidos corporales tales como suero y ascitis, un reto importante para la realización de análisis en profundidad de los proteomas por espectrometría de masas es la presencia de proteínas muy abundantes tales como la albúmina y las inmunoglobulinas, que constituyen 65 a 97% de proteínas de suero [15]. Estas proteínas abundantes limitan la eficacia de ionización durante el análisis de MS, la prevención de la identificación de proteínas de baja abundancia. Por lo tanto, el agotamiento de las proteínas muy abundantes mediante el uso de un 2D-kit de limpieza era necesario antes de nuestro análisis con el fin de detectar los biomarcadores abundantes humildes.
En nuestro estudio, se identificaron un total de 11 proteínas diferencialmente entre la quimioterapia y la quimioresistente ascitis de cáncer de ovario. No fue inesperado que algunas proteínas se identificaron en varios lugares, ya que se sabe que muchas proteínas en la ascitis de existir como isoformas. Por ejemplo, la haptoglobina y transtiretina fueron representados por dos y tres puntos, respectivamente, y en ambos casos, las manchas individuales se de manera similar las reguladas. Además, la misma proteína que está presente en varios puntos diferentes podría haber representado biológicamente relevantes modificaciones o fragmentos proteolíticos (por ejemplo, ceruloplasmina).
El cambio en la concentración sérica de ceruloplasmina, junto con muchas otras proteínas de fase aguda identificó entre los proteínas expresadas diferencialmente, implicados la presencia de respuestas inmunes e inflamatorias causó el tumor. Los resultados no fueron inesperados, ya que los diferentes mediadores de la inflamación, que desempeñan diversas funciones, tales como la inducción de angiogénesis, invasión, los bucles de crecimiento autocrinos y la resistencia a la apoptosis, se encuentra elevado en el carcinoma de ovario [16]. Muchas proteínas de fase aguda como la haptoglobina y transtiretina también se han caracterizado recientemente como biomarcadores de cáncer de ovario para la detección precoz [17]. Por otra parte, en un estudio de genes de perfiles anterior, Bachvarov y colegas encontraron que hacia abajo de los genes regulados en los tumores de EOC serosas chemosensitive incluyen numerosos genes implicados en el metabolismo lipídico y el transporte, la inflamación, así como los genes conocidos para mejorar la progresión del tumor y la invasión [18]. Estos resultados implicaron proteínas de fase aguda como biomarcadores candidatos de interés para la investigación adicional.
La ceruloplasmina, una glicoproteína plasmática que transporta el cobre en todo el cuerpo, era la única proteína confirmada por ELISA en el estudio actual que se expresa de forma diferente en el ascitis entre los pacientes quimiorresistentes y chemosensitive en este estudio. Curiosamente, los niveles séricos elevados de ceruloplasmina se han demostrado en varios tipos de cáncer tales como tiroides, próstata y cáncer de colon [19], y el análisis de microarrays ha vinculado este gen a la invasión tumoral y la metástasis en el cáncer de mama [20]. Alteraciones de los niveles de ceruloplasmina sérica después del tratamiento (quimioterapia o radiación) se han observado en muchos pacientes con enfermedades malignas, como el cáncer de laringe, cuello uterino y de mama. Evidentemente, una disminución más significativa del nivel de ceruloplasmina sérica después del tratamiento está vinculada con una mejor respuesta a la terapia, ya que estas alteraciones pueden influir en el resultado de la enfermedad [21], [22]. Estas observaciones anteriores apoyan nuestra conclusión de que la concentración de ceruloplasmina fue significativamente menor en los fluidos de ascitis de pacientes con cáncer de ovario sensibles a la quimioterapia.
Roles para ceruloplasmina se han sugerido en los procesos relacionados con el cáncer, incluyendo la angiogénesis y la neovascularización. La proteína también sirve como un marcador sustituto para el cobre total del cuerpo. Por lo tanto, el nivel de ceruloplasmina sérica menor en nuestro estudio puede ser secundaria a la deficiencia de cobre corporal total asociada con la supresión de tumores. En un estudio realizado por Cox et al., Tetratiomolibdato (TM), se utilizó un quelante de cobre para reducir las reservas corporales de cobre en un modelo murino de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (SCC) establecidos por medio de la línea celular altamente agresiva SCC VII /SF [23]. Los autores encontraron que a medida que el cobre corporal total se redujo por TM, el nivel de ceruloplasmina sérica se reducirá proporcionalmente, con el nivel basal disminuye desde by28%. Se identificaron los niveles como significativamente contenidos de tanto el crecimiento de SCC y la vascularización tumoral, sus resultados sugieren una eficacia potencial de TM en el tratamiento de cánceres a través de sus efectos sobre la angiogénesis y la neovascularización. Se observaron resultados similares en un ensayo de fase II con pacientes con cáncer avanzado de riñón en el que los efectos antitumorales de TM (disminución de la vascularización y la masa tumoral) se asociaron con una menor cobre sérico y niveles de ceruloplasmina [24].
Así , el cambio en la concentración sérica de ceruloplasmina puede indicar que es una proteína de fase aguda secretada en respuesta al estrés oxidativo en la inflamación asociada con el tumor y /o que es secundaria a la deficiencia de cobre total del cuerpo. Nuestro análisis se basa en los tumores serosos EOC primarias sin histotypes mixtos de los tumores de ovario, o recurrente y tumores metastásicos. Para nuestro conocimiento, este es el primer análisis proteómico informado por análisis 2D-DIGE de ascitis de pacientes con quimiorresistente intrínseca y cáncer de ovario sensible a la quimioterapia. Además, los resultados pueden ayudar a predecir las respuestas terapéuticas y proporcionar pronóstico de la enfermedad, así como nuevas pistas sobre el mecanismo de la quimio-resistencia para el cáncer de ovario. Sin embargo, existen posibles sesgos en nuestro estudio. Como se mencionó antes, la expresión de la ceruloplasmina puede estar asociada con la progresión tumoral. Por lo tanto, el alto nivel de ceruloplasmina en la ascitis en nuestro estudio puede ser causado por la metástasis del tumor relativamente avanzada asociada con un peor pronóstico. Además, los sesgos pueden ser causados por los componentes del suero en el líquido ascítico o incluso de nuestro exclusión de las ascitis muestras mezcladas con sangre debido a una hemorragia tumoral
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En nuestro estudio, el número de pacientes estaba limitada por la longitud de tiempo requerido para la recogida de muestras.