Extracto
Introducción
La dexametasona (DEX) co-tratamiento ha demostrado ser beneficioso en pacientes con CPNM, la mejora de los síntomas clínicos de la reducción de los efectos secundarios después de la quimioterapia. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la DEX podría hacer que las células cancerosas más insensibles a la terapia citotóxica de drogas, pero no se sabe si DEX co-tratamiento podría influir en la senescencia inducida por el tratamiento (TIS), y se desconoce si está en un dependiente de p53 o independiente de p53 manera.
Métodos
Hemos examinado en diferentes líneas celulares de cáncer humano y se detectó la senescencia celular después del tratamiento con cisplatino (DDP) en presencia o ausencia de DEX. El
in vivo
efecto de la combinación de DEX y DDP se evaluó mediante experimentos de crecimiento de tumores utilizando líneas celulares de cáncer de pulmón humano en crecimiento como los xenoinjertos de tumores en ratones desnudos.
Resultados
Co-tratamiento con DEX durante la quimioterapia en NSCLC produjo un aumento de la viabilidad de las células tumorales y la inhibición de TIS en comparación con el grupo tratado DDP. DEX células co-tratamiento mostraron la disminución de las proteínas vía de señalización de daño en el ADN, la menor expresión de p53 y p21
CIP1, el programa de secreción celular más baja y baja regulación de NF-kB y su cascada de señalización. DEX también redujo significativamente la sensibilidad DDP
in vivo
.
Conclusiones
Nuestros resultados ponen de relieve que la DEX reduce la sensibilidad de la quimioterapia inducida por la terapia embotamiento senescencia celular después de la quimioterapia en NSCLC, que puede, al menos en parte, de una manera dependiente de p53. Por tanto, estos datos plantean preocupaciones sobre el uso generalizado combinado de gluocorticoids (GCS) con fármacos antineoplásicos en el manejo clínico de los pacientes con cáncer
Visto:. Ge H, Ni S, Wang X, Xu N, Liu Y, Wang X, et al. (2012) La dexametasona reduce la sensibilidad al cisplatino embotando dependiente de p53 senescencia celular en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (12): e51821. doi: 10.1371 /journal.pone.0051821
Editor: Maurizio D'Incalci, Istituto di Investigación Farmacológica Mario Negri, Italia |
Recibido: 19 Julio, 2012; Aceptado: 6 de Noviembre de 2012; Publicado: 18 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Ge et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la tercera programa del Proyecto Nacional "973" (para Chunxue Bai), 3er programa del Proyecto Nacional "985" (para Chunxue Bai), Key Nacional Natural Science Foundation de China (30930090) (a Chunxue Bai), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30971306 /H0107) (a Songshi Ni) (http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los glucocorticoides (GC), tales como la dexametasona (DEX) son ampliamente utilizados como un co-tratamiento con quimioterapia debido a su eficacia para prevenir el edema, náuseas y reacción tóxica causada por el tratamiento citotóxico en pacientes tumorales [1]. GC co-tratamiento también mejora el apetito, pérdida de peso y alivia el dolor en los huesos [2]. Sin embargo, estudios recientes indican que los GC pueden inhibir el efecto de la quimioterapia no sólo en líneas celulares de cáncer establecidas y xenoinjertos de tumores [3], [4], [5], pero también en las células recién aisladas de resecciones quirúrgicas de tumores de diversos orígenes [6], [7], [8]. Por otra parte, los GC co-tratamiento reduce la sensibilidad de varios medicamentos de quimioterapia, incluyendo DDP [3], el paclitaxel [9], [10], el trastuzumab [4], gemcitabina [6] y camptotecina [11]. Un creciente cuerpo de evidencia sugiere que los GC reduce la sensibilidad celular a la quimioterapia puede ocurrir a través de múltiples mecanismos, por ejemplo, mediante la mejora de la capacidad de reparación del ADN, supresión de la respuesta inmune del huésped antitumorales, y el bloqueo de la apoptosis [5], [11], [12] . Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen en el efecto de los GC aún no se conocen.
En todo el mundo, el recuento de cáncer de pulmón en el mayor número de nuevos casos de cáncer y muertes por cáncer cada año [13], y una gran cantidad de pruebas indican que la quimioterapia adyuvante basada en DDP mejora la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón no microcítico resecado completamente [14], [15], [16]. Los fármacos citotóxicos tales como DDP pueden activar la señalización de daño de ADN vía [14], [17] y las proteínas de detección, tales como γH2AX y 53BP1, que son instrumentales en la conducción de la senescencia celular [18], [19]. La senescencia celular se caracteriza por una detención irreversible de la proliferación celular, de modo que pueda evitar la proliferación aberrante e ilimitada de células tumorales [20]. Las células senescentes presentan cambios morfológicos menos dilatados y la motilidad de las células jóvenes, lo que puede contribuir a la supresión de la migración celular, invasión y metástasis [21]. Por lo tanto, la senescencia celular actúa como una barrera importante para el cáncer y juega un papel importante en la supresión tumoral.
Para analizar si DEX también puede reducir la sensibilidad DDP embotando la senescencia celular, examinamos la senescencia celular en diferentes líneas celulares de cáncer humano y xenoinjertos después del tratamiento DDP en presencia o ausencia de DEX. Se encontró que el DEX tuvo un fuerte efecto anti-senescencia en las células de carcinoma utilizados, así como en xenoinjertos humanos en ratones desnudos. Esto fue debido a la inhibición de la actividad de NF-kappa B que resulta en un bloqueo de la vía de señalización de p53. La transferencia directa de p53 y NF-kB restaura la sensibilidad de los carcinomas de senescencia tratadas con DEX en líneas celulares de cáncer. Estos
in vitro
y
in vivo
datos sugieren la necesidad de considerar cuidadosamente el uso de DEX y otros GC junto con la terapia citotóxica en el tratamiento de pacientes con carcinoma de pulmón.
Materiales y Métodos
cultivos celulares y estimulación de las células
CPNM líneas celulares A549, NCI-H292 y NCI-H1299 fueron adquiridos por el Instituto celular de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) [22], [23], [24]. Las células A549 se cultivaron en medio F12-K. células H292 y H1299 se cultivaron en RPMI 1640 medio. DDP (Sigma Aldrich) se disolvió en DMF a una concentración de 10 mM. Un almacén 10 mM de DEX (Sigma Aldrich) se preparó en agua destilada doble. Después del pretratamiento de DEX durante 24 horas, las células se trataron con DDP durante 48 horas. Las células fueron lavadas para eliminar las drogas y se incubaron durante 3 días adicionales en medio fresco.
Proyección proliferación y Ensayo de proliferación celular
Se estima que el número de células viables usando el Cell Counting Kit-8 ( Dojindo, Kumamoto, Japón) de ensayo que proporcionó determinación eficaz y reproducible de la actividad proliferativa de las células. Para medir la actividad proliferativa de las células en microplacas de 96 pocillos, se añadió CCK-8 (10 l /pocillo) y la incubación continuó durante 1 hora. Se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de microplacas (Molecular Devices) con una longitud de onda de referencia de 650 nm.
Alive Medición de Cell Bio-comportamientos
Cell Bio-comportamientos se midieron mediante real sistema de monitorización de células tiempo, utilizando una plataforma de cultivo de células Cell-IQ equipado con un microscopio de control de fase y una cámara [25]. Las imágenes fueron capturadas en intervalos de 5 minutos durante 48 horas. El análisis se realizó con un software de imagen de libre distribución (Facilidad de McMaster Biofotónica, Hamilton, ON, Canadá), usando el plugin Seguimiento manual creado por Fabrice Cordelières (Institut Curie, Orsay, Francia). Tratada con DDP en presencia o ausencia de DEX, a continuación, las células A549 y H292 se cultivaron en el sistema Cell-IQ con placas de 24 pocillos durante 48 horas. sistema de células-IQ discrimina automáticamente etapa de célula y el número de células totales calculadas. Cada grupo contenía sitios de imágenes 6 replicados.
inmunofluorescencia
Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y se permeabilizaron en PBS-0,2% de Triton durante 10 min. Después se bloquearon durante 1 hora, los anticuerpos primarios (γH2AX: 2212-1, Epitomics, 1:100; 53BP1: Cell Signaling Technology, 1:100: AB36823, Abcam, 1:100, NF-kB) se diluyeron en tampón de bloqueo y se incubaron con células fijadas durante la noche a 4 ° C. Las células se lavaron, se incubaron con anticuerpos secundarios (Jackson, 1:100) durante 1 hora a temperatura ambiente. Todas las diapositivas se counterstained con 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI). La inmunofluorescencia se realizó mediante microscopía de escaneo láser confocal (Lecia) o microscopía de fluorescencia (Olympus).
Apoptosis ensayos de incorporación de BrdU,
La reacción TUNEL se realizó utilizando el TUNEL in situ kit- detección de muerte celular fluoresceína (Roche Applied Science, Laval, Quebec, Canadá) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante 10 min. Las células fueron entonces permeabilizaron durante 2 min en hielo antes de su etiquetado con 50 l de mezcla de reacción TUNEL e incubando a 37 ° C durante 1 hora. Después de lavados, los portaobjetos se montaron y se examinaron por microscopía de fluorescencia. El porcentaje de células apoptóticas se calculó como (células TUNEL-positivas /células totales) x 100%. BrdU incorporada se detectó por el ensayo de proliferación de células BrdU (QIA58, Calbiochem, Merck, Alemania). Se añadió BrdU y se incubaron durante 24 horas adicionales, y se añadió solución entonces fijador /desnaturalizante durante 30 min. Se añadió anticuerpo anti-BrdU (1:100) para interactuar con BrdU incorporado durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron con anticuerpo anti-BrdU (1:1000) durante 30 min. Después de lavado, la solución de parada se añadieron y la absorbancia se midió usando un lector de placas espectrofotométrico a longitudes de onda duales de 450 a 540 nm.
asociada a la senescencia β-galactosidasa (SA-β-gal) de tinción y cuantificación
Las células fueron lavadas para eliminar las drogas y se incubaron durante 3 días adicionales en medio fresco. En la tinción in situ de SA-β-gal con células o secciones congeladas se realizaron utilizando un kit de tinción galactosidasa senescencia-β (Instituto de Biotecnología Beyotime, China) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se consideraron positivas cuando el citoplasma se tiñó con Gal SA-β. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Análisis FACS
Las células se fijaron en etanol al 70% enfriado con hielo y se tiñeron con PBS que contiene /ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) y 100 g 50 g /ml RNasa a para el análisis de contenido de ADN por citometría de flujo en un sistema de análisis FACSCalibur (BD). El porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular se calculó utilizando el software FlowJo (Árbol Star Inc., Ashland, Oregón, EE.UU.).
La extracción de RNA y PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo usando el minikit RNeasy (QIAGEN, Hamburgo, Alemania). RNA (2 g) fue transcrito inversamente a ácido desoxirribonucleico complementario y 40 ng de ADN complementarios se utilizaron como molde para la PCR en tiempo real. Las reacciones de ciclos de amplificación (40 ciclos) se realizaron como sigue: 5 seg a 95 ° C y 30 segundos a 60 ° C. valores de cuantificación relativa de los genes diana fueron estandarizadas según la comparativa ciclo umbral (2
-ΔΔCT).
Análisis Western Blot
Las proteínas (30 g) en el lisado celular total fueron separados por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces con 15 ml de TBS /0,1% Tween. Las transferencias se incubaron con anti-PCNA (1:1000; Millipore), anti-TRIME H3K9 (1:1000, la señalización de la célula), anti-TRIME H3K27 (1:1000, la señalización de la célula), anti-53BP1 (1:1000; Abcam), anti-γH2AX (1:1000; Epitomics), anti-PCNA (1:1000; Sigma-Aldrich), anti-p53 (1:1000, Señalización celular), anti-p21
CIP1 (1:1000 ; Cell Signaling), anti-p27
KIP1 (1:1000, señalización celular), anti-pRb (1:1000, señalización celular), anti-ciclina A (1:1000; señalización celular) y anti-GAPDH ( 1:1000, Sigma-Aldrich). Las membranas se lavaron y después se incubaron con el anticuerpo secundario (1:1000) durante 1 hora. Las bandas se visualizaron por quimioluminiscencia (ECL; Amersham) seguido de exposición a película de rayos x (RX-U; Fujifilm). la densidad de las bandas se cuantificó usando ImageJ densitométrica (National Institutes of Health).
Ensayos de luciferasa
El pGL3-p53 y plásmidos informadores de luciferasa de luciérnaga pGL3-NF-kB (regalo del Dr. Liu HO) se utilizaron en combinación con el pGL3-basic vector control (Promega) y el control interno plásmido pRL-SV40 (Promega). Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos 1 × 10
5 /pocillo durante la noche y se transfectaron con el plásmido indicado con X-tremeGENE HP ADN reactivo de transfección (Roche, 06366236001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron 24 horas después de la transfección y los lisados se analizaron para la actividad firely y de luciferasa de Renilla utilizando el Luciferase reportero sistema de ensayo Dual (Promega, Madison, WI). Los datos se representan como la inducción veces en comparación con el vector pGL3-Basic. Tres experimentos de transfección independientes se realizaron por triplicado para cada construcción experimental.
ratones desnudos y xenoinjertos
Nuestro experimento con animales se aprobó y se llevó a cabo en estricto apego a las políticas y lineamientos establecidos por la Universidad de Fudan Cuidado de Animales y el empleo. Brevemente, 1 × 10
7 células A549 con 100 l de PBS se inyectaron en el lomo de ratones desnudos de 4 semanas de edad. DDP 5 mg /kg se inyectó por vía intraperitoneal semanalmente durante un periodo de 4 semanas cuando los tamaños de los tumores alcanzaron un volumen de 200 mm
3 en la ausencia o presencia de DEX. DEX 0,2 mg /kg se dio por sonda dos veces al día el día antes, el mismo día y el día después de la administración DDP. El crecimiento tumoral se monitorizó en serie con medición de pinzas de dos diámetros perpendiculares. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula:. Los ratones fueron sacrificados humanitariamente en tamaños tumorales & gt;. 3000 mm
3
Análisis estadístico
Todos los resultados se expresaron como media ± SEM. Las diferencias de grupo se evaluaron mediante ANOVA de una vía o por el estudiante de
t-test
según corresponda. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier para calcular las probabilidades de supervivencia. Las diferencias entre los grupos experimentales con
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
DEX El tratamiento conjunto de viabilidad celular en aumento de DDP tratada con CPNM líneas celulares
con el fin de investigar los efectos de DDP solo o, más DEX sobre la supervivencia
in vitro
, que usó un ensayo CCK8 y se examina en el CPNM líneas celulares A549 y H292. DDP podría disminuir significativamente el número de células de supervivencia de una manera dependiente de la dosis en células de NSCLC. En líneas celulares A549 y H292, el IC50 fue 7,12 M y 5,44 M, respectivamente. Co-tratamiento con DEX 1 M aumentó significativamente el número de células y la supervivencia IC50 (A549:15.78 mu M, H292:11.60 mu M) en comparación con DDP grupo solo (
P
& lt; 0,05). (Figura 1A)
(A) La detección de IC50 por CCK-8 ensayo. líneas celulares de NSCLC se cultivaron en un medio que contiene varias dosis de DDP (0 m, 1 m, 2 m, 4 m, 8 m, 16 m, 32 m, 64 m, 128 m) como se indica en la ausencia o presencia de 1 M DEX durante dos días, y luego se monitorizó la viabilidad de las células. (B) ensayo de viabilidad celular en respuesta a las concentraciones indicadas DDP (0 M, 5 × 10
-7 M, 1 × 10
-6 M, 2 × 10
-6 M, 4 × 10
-6 M y 8 × 10
-6 M) se midió por el ensayo de CCK-8 durante 5 días, incluyendo 2 días de tratamiento DDP y 3 días adicionales de incubación medio libre de drogas. (C) de fluorescencia imágenes microscópicas representativas de las células A549 y H292 después de ensayo de TUNEL (izquierda) y el análisis cuantitativo de la apoptosis (a la derecha). (D) La detección de un aumento de porcentaje del número de células totales por Cell-IQ y CCK-8. El número total de células de A549 y H292 se midieron 72 horas después se cultivaron con diferentes fármacos. (E) la incorporación de BrdU de células A549 y H292. BrdU se incubó durante 24 horas, y luego se fijaron y se detectó con BrdU células. Para el análisis de la cantidad de incorporación de BrdU, valores de DO relativos se ensayaron en comparación con el grupo de vehículo. (F) Análisis de transferencia Western mostró niveles de proteína PCNA en células A549 y H292 y los datos cuantitativos de los niveles de proteína PCNA. Los datos representan medio de seis determinaciones ± error estándar de la media (SEM). * P
Restaurant & lt; 0,05 y ** p
. & Lt; 0,01 analizado por una sola vía de análisis de varianza (ANOVA)
La incubación de las líneas celulares Las células A549 y H292 con DDP de 2 días, seguido de un medio libre de drogas durante 3 días. Dependiendo de DDP concentraciones, detener la proliferación y /o muerte celular se produjo como resultado. Elegimos seis diferentes gradientes de concentración de DDP (M 0, 5 × 10
-7 M, 1 × 10
-6 M, 2 x 10
-6 M, 4 × 10
-6 M y 8 × 10
-6 M) y se examinaron con CCK-8 ensayo. A concentraciones de menos de 2 × 10
-6 M, DDP retrasa la proliferación celular, y a 2 x 10
-6 M, el número de células se mantuvo constante durante todo el período de incubación que sugiere la detención del crecimiento irreversible, lo que significaba senescencia . Por el contrario, concentraciones mayores DDP inducen la muerte celular (Figura 1B). Para confirmar este efecto, también elegimos el gradiente de concentración de seis diferentes por encima de DDP y se evaluó en las células A549 y H292 con ensayo de TUNEL. El tratamiento con DDP la que las concentraciones de menos de o igual a 2 × 10
-6 M no mostró ningún cambio significativo, mientras que DDP que concentraciones mayores de 2 × 10
-6 M aumentó significativamente el porcentaje de células TUNEL positivas (Figura 1C). Por lo tanto, se utilizó 2 × 10
-6 M DDP en el que la concentración puede inducir la senescencia celular en lugar de la apoptosis en el siguiente experimento.
A continuación, se evaluó el efecto de DEX co-tratamiento en el porcentaje de el número de células totales con IQ celular en A549 y líneas celulares H292. El porcentaje de número total de células disminuyó significativamente después de la estimulación de DDP en comparación con vehículo. DEX co-tratamiento aumentó el número total de células por 17,21%, 15,51% (0,1 M DEX, A549, H292, respectivamente), 95,06%, 118,43% (1 M DEX, A549, H292, respectivamente), 131,18%, 150,11% ( 10 M DEX, A549, H292, respectivamente) en presencia de DDP (Figura 1D). Desde concentración de 1 M DEX o superior puede aumentar significativamente el número total de células, se utilizó 1 DEX mu M en el siguiente experimento. El pretratamiento con antagonistas del receptor de glucocorticoides (GR), RU486, podría bloquear la influencia de DEX, que sugieren que DEX reduce la sensibilidad DDP estaba actuando a través del GR. Además, también se realizó la CCK-8 y ensayo confirmó el papel comedication DEX (Figura 1D). La eficacia de diferentes dosis de DDP (1 M, 2 M, 4 M, 8 M, 16 mM, 32 mM) en presencia o ausencia de DEX también fue detectado por CCK-8. DEX co-medicación indicada efectos protectores en diferentes dosis de DDP (2 m, 4 m, 8 m) y la ineficacia, cuando las dosis superó los 16 M (Figura 1D).
Para complementar la anterior conclusión, hemos examinado siguiente celda proliferación con BrdU, un análogo de timidina que se puede incorporar en el ADN recién sintetizado de S-fase. DDP disminución de la proliferación normal de las células A549 y H292 mientras que atenúa esta disminución DEX (Figura 1E). Además, también se detectó la expresión de la proliferación de antígeno de células nuclear (PCNA), una proteína implicada en la replicación del ADN y la reparación del ADN, a través de análisis Western-blot. DDP también disminuyó la expresión de la proteína de PCNA, y el tratamiento combinado DEX puede reducir este descenso (Figura 1F). Estos datos sugieren que DEX co-tratamiento viabilidad celular en aumento DDP tratada líneas celulares de NSCLC.
DEX protegido tumores mediante la inhibición de la TIS
Desde 10 M DEX solo dio lugar a una ligera inhibición de la célula el crecimiento de las células A549 y H292 (Figura 1D), el aumento del número de células de supervivencia cuando las células fueron co-tratado con DEX y DDP no fue debido a la aceleración del crecimiento de las células, pero lo más probable era debido a la influencia TIS. Para probar esta probabilidad, se examinaron más el cambio en la senescencia celular de las células A549 y H292 con DDP o DEX solo o con una combinación de DEX y DDP durante 48 horas. Y se identificaron las células senescentes sobre la base de múltiples características. En primer lugar, hemos observado que DDP causado notables y característicos alteraciones morfológicas, incluyendo el tamaño ampliada celular y una forma aplanada en las células A549 y células H292, y DEX co-tratamiento atenuada estas alteraciones morfológicas (Figura 2A). DEX co-tratamiento también afecta de manera significativa el crecimiento de A549 y líneas de células H292 (Figura 2B).
Las células (A) se cultivaron en medio libre de drogas, fijo, y manchadas. Las células se visualizaron con 200 × magnificación utilizando microscopía de contraste de fase. ensayo (B) La proliferación celular se lleva a cabo después de lavado de drogas, y se contaron las células durante 5 días. actividad (C) SA-β-gal se analizó por microscopía en el día 3 después de lavado de drogas (izquierda). El porcentaje de células SA-β-gal-positivas se presentó en el histograma (derecha). (D) fotos representativos para la formación SAHF en células A549 y H292 en el día 3 después de lavado de drogas. formación SAHF se cuantificó contando 200 células de & gt; 10 campos al azar, y los resultados se muestra en el histograma de la derecha. (E) Las proteínas de las células A549 y H292 se incubaron con anticuerpos específicos para trimetilada H3K9 lisinas y H3K27 y analizados por perno occidental. La expresión de GAPDH se tomó como control interno de carga. Los datos representan medio de seis determinaciones ± error estándar de la media (SEM). *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & Lt; 0,01 analizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) guía empresas
A continuación, se detectó una ampliamente aceptada marcador, la actividad β-SA-gal, que tiñe el azul compartimento perinuclear. DDP inducida significativamente mayor actividad SA-β-gal, y de manera interesante, DEX co-tratamiento disminución de la actividad SA-β-gal en comparación con la de tratamiento DDP solo (Figura 2C). Además, también se observó la formación obvio asociada a la senescencia heterocromatina focos (SAHF), que se piensa que es un biomarcador núcleos de senescencia, en DDP tratada células A549 y H292. El porcentaje de células SAHF-positivas fue significativamente mayor con el tratamiento DDP. DEX co-tratamiento podría disminuir el porcentaje de células SAHF-positivo en comparación con el de tratamiento DDP solo (Figura 2D). Los focos de material compuesto de SAHF contiene metilado y desacetilado histonas y otras proteínas asociadas. marcadores ampliamente probados en esta categoría incluyen la metilación de la histona 3 en lisinas 9 y 27 y la fosforilación de la histona H2AX familia, miembro de X (γ-H2AX), todos los cuales colocalize en SAHF [19], [26]. Se detectó la expresión de Trime H3K9 y Trime H3K27 y los resultados indicaron la misma tendencia de SAHF (Figura 2E).
inducida por DDP daño del ADN se inhibe en presencia de DEX
Debido a DEX influencias inducida por el tratamiento y la senescencia replicativa, y la señalización de respuesta de daños en el ADN juega un papel central en tanto, el próximo investigó si DEX modula el puesto de control de daños en el ADN. Hicimos un seguimiento de daños en el ADN inducidos por la terapia mediante el examen de dos marcadores utilizados comúnmente de daño en el ADN, γH2AX y 53BP1. DDP células tratadas, como se esperaba, tuvo un incremento en el daño del ADN sobre las células de control, y DEX co-tratamiento con DDP atenuado el grado de daño en el ADN, según se juzga por cualquiera γH2AX o 53BP1 (Figura 3A, 3B y 3C).
Las células (a) se fijaron y tiñeron para γH2AX focos (verde) 48 h después de lavado de drogas. tinción DAPI se realizó para visualizar los núcleos (azul). Porcentaje de células γH2AX-positivas se presenta en el histograma (derecha). (B) Las células se fijaron y se tiñeron para 53BP1 focos (verde) 48 horas después de lavado de drogas. tinción DAPI se realizó para visualizar los núcleos (azul). Porcentaje de células 53BP1-positiva se presenta en el histograma (derecha). (C) Después del tratamiento DDP durante 48 horas en presencia o ausencia de DEX, las células se lavaron y se cultivaron durante otras 48 horas. γH2AX y nivel de proteína 53BP1 se investigaron mediante análisis de transferencia Western. La expresión de GAPDH se tomó como control interno de carga. análisis (D) del ciclo celular se realizó a las 48 horas después de lavado de drogas. Los porcentajes de G1, S y G2 se demuestran como se muestra. El histograma muestra los cambios relativos de la fase G1 en comparación con la fase S. (E) Las expresiones de p21, p27, ciclina D1, CDK2 y ciclina A nivel de proteína fueron investigados por Western blot. La expresión de GAPDH se tomó como control interno de carga. Los datos representan medio de seis determinaciones ± error estándar de la media (SEM). *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p
. & Lt; 0,01 analizada por un solo sentido el análisis de varianza (ANOVA) guía empresas
Las células senescentes nunca se vuelva a introducir el ciclo celular y aparecerá a la disminución de la síntesis de ADN, la detención del crecimiento de alcanzar y mantener, ya sea en G1 o G2 etapa /M del ciclo celular, en parte por el aumento de la expresión de inhibidores de la quinasa dependientes de ciclina específicas (CDKIs). Se realizó el análisis FACS y encontramos terapia DDP la detención del ciclo celular inducida en la fase G1, acompañada por la disminución de los porcentajes de la fase S, y DEX disminuyó el grado de estos cambios (Figura 3D). Las detecciones de las proteínas reguladoras del ciclo celular asociados con la senescencia descubiertos hasta-regulaciones en p21 y p27, y con los pies en la normativa ciclina D1 y CDK2 en células tratadas con DDP, y las tendencias en consecuencia el debilitamiento en las células co-tratadas con DEX (Figura 3E). Estos resultados apoyan la hipótesis de la influencia de DEX sobre puesto de control de daños en el ADN. Estos resultados son consistentes con DEX afecta a la senescencia al influir en la activación del punto de control de daño del ADN.
DEX Co-tratamiento redujo DDP sensibilidad en un dependiente de p53 Manner
La vía de p53 es importante para establecer y el mantenimiento de la detención del crecimiento senescencia causada por el estrés citotóxico. Por lo tanto, nos preguntamos si DEX co-tratamiento influenciado sensibilidad quimioterapia por vía de p53. Después del tratamiento DDP, la proteína p53 acumula gradualmente, y el efecto se debilita notablemente en presencia de DEX. La misma tendencia se detectó también acerca de la expresión de la proteína de p21
CIP1, un objetivo transcripcional bien establecida y el efector aguas abajo de p53 con funciones en la detención del ciclo celular, inducción de la senescencia y la apoptosis (Figura 4A). Se esperaba que la inducción fuerte de p21 para inhibir la actividad de los complejos ciclina /CDK G1 a resultar en hipofosforilación de la proteína retinoblastoma (pRb) y fracaso de la inducción de S ciclinas de fase (figura 4A). Del mismo modo, el nivel de ARNm de p53 también se aumentó después del tratamiento DDP, y DEX co-tratamiento atenúa este aumento (Figura 4B). Además, también se utiliza ensayos de reportero de luciferasa para detectar la actividad del promotor p53, y el análisis mostró DEX co-tratamiento también podría atenuar la actividad del promotor p53 en comparación con el de grupo DDP tratado (Figura 4C). Estos cambios corroboraron la retención de la fase G1 observada en los histogramas de ADN y se mantuvo constante con la detención G1 irreversible observado en la senescencia inducida por quimioterapia. Por lo tanto, diferentes resultados biológicos del tratamiento DDP en la ausencia o presencia de DEX surgieron de la regulación diferencial de p53 y su aguas abajo p21 objetivo.
(A) La p53, p21 y pRb en lisados a partir de células A549 y H292 se determinó por Western-blot, carga de proteína equivalente entre los carriles se confirmó por análisis Western de los niveles de GAPDH. (B) los cambios de los niveles de expresión de ARNm de p53 después del tratamiento DDP en presencia o ausencia de DEX fueron detectados por PCR cuantitativa en tiempo real. Plegables cambios se calcularon a partir de valores de Ct normalizado beta-actina. (C) Las células fueron transfectadas transitoriamente con el plásmido p53 reportero promotor-luciferasa. La actividad de luciferasa en lisados de células enteras se determinó 24 horas después de la transfección. Los datos mostrados son medias (± error estándar de la media) de la relación de actividad de luciferasa de luciérnaga sobre la actividad de luciferasa de Renilla y se normalizaron a la relación de grupo de vehículo. las células (D) A549 y H292 transfectadas con un vector de expresión de p53 (pcDNA3.1- /p53) fueron tratados con DDP en presencia o ausencia de DEX. actividad SA-β-gal se analizó por microscopía en el día 3 después de lavado de drogas. Porcentaje de células SA-β-gal se presentó en el histograma. Se utilizaron células (E) H1299 (p53 de tipo deficiente) para detectar si DDP insensibilidad se produjo en forma dependiente de p53 por CCK-8 ensayo usando varias dosis de DDP (0 m, 1 m, 2 m, 4 m, 8 m, 16 mu M , 32 mM, 64 mM, 128 mM). Los estados de p53 se confirmaron mediante el examen de p21
CIP1 y HDM2 expresiones. Se detectó actividad (F) SA-β-Gal en células H1299 tratadas con DDP en presencia o ausencia de DEX. (G) El efecto de siRNAs diseñado contra p53 se midió mediante Western-blot en células A549. Se detectó y se analizó la actividad de SA-β-Gal. Los datos representan medio de seis determinaciones ± error estándar de la media (SEM). *
p Hotel & lt; 0,05 y **
p Hotel & lt; 0,01 analizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) guía empresas
Para confirmar aún más el efecto. de p53 /p21
vía CIP1, las células A549 y H292 fueron tratados con pcDNA3.1- /p53. Después de 2 días de tratamiento con o sin DDP pcDNA3.1- /p53, se determinó que la sobreexpresión de p53 podría prevenir la disminución de la actividad de SA-β-Gal en el grupo DEX co-tratamiento (Figura 4D). Por otra parte, para analizar si DEX asociada a la insensibilidad DDP dependía de co-tratamiento reduce la sensibilidad DDP es dependiente de p53, se utilizaron dos líneas celulares diferentes en función de p53, A549 (p53 de tipo salvaje) y H1299 (p53 de tipo deficiente). El estado de p53 de las células A549 y H1299 se confirmó mediante el examen de p21
CIP1 y expresiones HDM2, y CCK-8 ensayo revelaron que no hubo diferencia significativa de DDP IC50 entre DDP solo y grupo DEX co-medicación en células H1299 (Figura 4E). También encontramos en las células H1299, DEX no influyó en la actividad de SA-β-Gal (Figura 4F). A549 células fueron transfectadas con siRNA p53 y control de siRNA. Western blot para la supresión de p53 confirmado por p53 siRNA. Como era de esperar, p53 siRNA podría disminuir aún más la actividad β-SA-Gal (Figura 4G). Tomados en conjunto, los resultados indican que p53 puede ser activado por el estrés citotóxica, y la influencia DEX co-tratamiento TIS es dependiente de p53.
NF-kB fue un importante mediador de la función del DEX en quimioterapia Insensibilidad
Para caracterizar mejor si la señalización NF-kB promueve o abroga la senescencia, se determinó la actividad de NF-kB en las células NSCLC después del tratamiento DDP con o sin DEX. El tratamiento con DDP potentemente activa la actividad del promotor de NF-kappa B en A549, H292 y H1299, y el tratamiento con DEX disminuyó la actividad del promotor de NF-kappa B sólo en A549 y células H292 (Figura 5A). A continuación, se han detectado moléculas liberamos NF-kB trasladar al núcleo después del tratamiento DDP. DDP grupo que sólo mostró la translocación nuclear de p65 NF-kB y DEX co-tratamiento disminuyó el nivel de la translocación nuclear (Figura 5B). La translocación nuclear de p65 se confirmó por Western-blot. tratamiento DDP promovió significativamente la localización nuclear de p65, mientras que la cantidad total de p65 en el citoplasma se cambió ligeramente en función de la relación de p65 /GAPDH. Y DEX co-medicación se redujo la translocación nuclear en las células A549 y H292 pero no en células H1299 (Figura 5C).
Las células (A) se transfectaron transitoriamente con NF-kB plásmido informador promotor-luciferasa.