Extracto
La diabetes tipo 2 se ha asociado con un menor riesgo de cáncer de próstata en los estudios de observación, y esto asociación inversa ha sido confirmada recientemente en varios estudios de cohortes grandes. Sin embargo, los mecanismos implicados en este efecto protector aún no se han dilucidado. El objetivo del presente estudio fue explorar si las diferentes características de la diabetes tipo 2 (hiperinsulinemia, hiperglucemia y factor de necrosis tumoral alfa [TNF-α]) protegen contra el desarrollo del cáncer de próstata. Para este fin se utilizaron células LNCaP por
in vitro
experimentos en ratones desnudos y en la que habían sido implantados PAC120 (cáncer de próstata humano dependiente de hormonas) xenoinjertos fueron utilizados para
in vivo
exámenes. Ofrecemos pruebas de que el aumento de las concentraciones de glucosa regulan negativamente receptor de andrógenos (AR) mRNA y los niveles de proteína través de la activación de NF-kB en las células LNCaP. Además, no había un efecto sinérgico de la glucosa y TNFa en la regulación negativa de la AR en las células LNCaP. Por el contrario, la insulina no tuvo ningún efecto sobre la regulación de AR.
in vivo
experimentos mostraron que la diabetes inducida por estreptozotocina (STZ-DM) produce un retraso del crecimiento del tumor y una reducción significativa en la expresión de AR en ratones de cáncer de próstata PAC120. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la hiperglucemia y TNF-a juega un papel importante en la protección contra el cáncer de próstata mediante la reducción de los niveles del receptor de andrógenos a través de NF-kappa B
Visto:. Barbosa-Desongles A, Hernández C, De Torres I , Munell M, MF Poupon, Simó R, et al. (2013) Diabetes Protege de cáncer de próstata mediante la regulación negativa del receptor de andrógenos: Contribuciones clave a partir de células LNCaP y PAC120 modelo de ratón. PLoS ONE 8 (9): e74179. doi: 10.1371 /journal.pone.0074179
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 16 de abril, 2013; Aceptado: July 29, 2013; Publicado: 10 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Barbosa-Desongles et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto de Salud Carlos III (DMS) y el Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), una iniciativa del Instituto de Salud Carlos III (RF, ABD, CH y DMS) . DMS es el destinatario de un contrato de Miguel Servet. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La diabetes de tipo 2 (DM2) y el cáncer de próstata (CaP) son dos de los principales problemas cada vez mayores, de salud que afectan a millones de hombres en todo el mundo. CaP es una neoplasia dependiente de andrógenos, que constituye el cáncer de órgano sólido más común en los hombres en los EE.UU., Canadá y Australia, y el segundo cáncer más común en los hombres a nivel mundial [1].
DT2 ha sido reconocida como una el factor clave que contribuye al desarrollo de tumores malignos de órganos sólidos, incluyendo el hígado, el páncreas, colorrectal, de mama, de endometrio, útero y vejiga [2], [3] Sin embargo, varios estudios de cohortes grandes han demostrado una significativa disminución en el riesgo de CaP en la diabetes tipo 2 [4 ] - [7]. Además, se ha observado que la magnitud de esta asociación inversa es mayor al aumentar la duración de la diabetes [4], [8]. Aunque la diabetes de larga data protege contra el desarrollo del CaP, existe evidencia de que los hombres diabéticos pueden tener un resultado peor porque tienen histológicamente CaP más agresivo en comparación con los pacientes no diabéticos [9] - [11]. Una de las razones de esta característica podría ser los niveles séricos bajos de antígeno prostático específico (PSA) que los pacientes diabéticos tipo 2 presentan en comparación con los sujetos no diabéticos [5], [12], [13]. Desde PSA es el método de detección de corriente para CaP, menores niveles de PSA que existen en los pacientes diabéticos podría dar lugar a retraso en el diagnóstico, lo que aumenta la incidencia de alto grado /CaP avanzado. Sin embargo, cabe señalar que el efecto protector de la diabetes en el CP no es simplemente una consecuencia del sesgo de detección del retraso en el diagnóstico debido a los niveles de PSA más bajos [5], [14], [15].
El precisas mecanismos implicados en el efecto protector de la DT2 en el desarrollo del CaP aún no se han dilucidado. Se ha informado de que los individuos con aumento de la susceptibilidad genética a la diabetes tipo 2 tienen un menor riesgo de CaP [16] - [18]. En este sentido se ha demostrado que la misma variación en la HNF1B (también conocido como TCF2) de genes, que se asocia con un mayor riesgo de CaP, confiere protección contra la diabetes tipo 2 [19]. Otras explicaciones propuestas han incluido el desarrollo progresivo del agotamiento de las células beta con el agotamiento de la insulina y la diabetes se asocia con niveles más bajos de testosterona y el factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF1) [15]. Además, hay que señalar que la inflamación de bajo grado es un componente significativo de T2D y que se ha informado de altos niveles séricos del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en comparación con los controles no diabéticos [20]. Recientemente hemos presentado pruebas de que TNF puede desempeñar un papel esencial en la regulación negativa de los niveles de SHBG y de testosterona en suero [21], [22]. Por lo tanto, una estrecha relación entre los niveles de inflamación y de andrógenos podría ser un mecanismo subyacente que representa el bajo riesgo de CaP se observa en la DT2. Por otra parte, recientemente se ha demostrado que varios genes relacionados con la inflamación se asocian con niveles séricos de andrógenos en los hombres [23].
Desde el CP es dependiente de andrógenos, el primer objetivo del presente estudio fue examinar si la insulina o los niveles de glucosa tuvieron ningún efecto sobre el receptor de andrógenos (AR) en las células LNCaP CaP (una línea celular de cáncer de CaP inmortalizado andrógeno-sensibles) [24]. Además, dado que el TNF-α es upregulated en la DT2 y una regulación negativa de la expresión del RA por el TNF-α se ha informado anteriormente [25], queríamos explorar si el TNF-α tuvo ningún efecto sobre la regulación AR en nuestro
sistema in vitro. Además, dado que la hiperglucemia es capaz de activar NF-kB en las células endoteliales, pericitos y células musculares lisas vasculares [26] - [30], y la activación de NF-kB podría estar involucrado en AR downregulation [25], [31], se examinaron si la hiperglucemia podría reducir los niveles de AR a través de la activación de NF-kB en las células LNCaP. Por último, se utilizó un modelo de ratón de cáncer de próstata PAC120 [32] tratados con estreptozotocina (STZ) para evaluar
in vivo
los efectos de la hiperglucemia sobre la regulación de AR y el crecimiento tumoral.
Materiales y Métodos
cultivo celular
las líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.) y se sembraron en frascos de 75 cm2 y se cultivaron en medio RPMI 1640 (PAA Laboratories , Pasching, Austria) que contiene 10% de FBS, 1% penicilina /estreptomicina, 1% de diferentes concentraciones de insulina (20, 100 o 200 mu IU /ml) o la concentración de glucosa (5 Hepes y, 10 o 30 mM de D-glucosa y 5 o 30 mM de L-glucosa) durante 4 días. células LNCaP fueron también tratados con cantidades crecientes de D-glucosa (5 mM, 10 mM y 30 mM) en presencia o ausencia de TNFa (50 ng /ml) o QNZ (Enzo Life Sciences International, Inc. PA, EE.UU.). Las células se mantuvieron en un incubador humidificado con 5% de CO
2 a 37 ° C. Todos los
in vitro
experimentos se realizaron al menos en dos experimentos independientes por triplicado.
Modelo Animal
En
in vivo
estudia un modelo de ratón PAC120 CaP en se utilizó. De Pinieux
et al
[33] creado este modelo de PCa humana utilizando tejido obtenido mediante la resección transuretral de un CaP localmente recidivante. Este tejido CaP se estableció como el xenotrasplante trasplantables en ratones desnudos, donde creció de forma local y se muestra el mismo inmunofenotipo que el tumor original.
se alojaron cinco semanas de edad ratones suizos atímicos (Charles River Laboratories, Inc) en la única zona libre de patógenos de los Laboratorios de instalaciones de animales del Institut de Recerca de la Vall d'Hebron y se les proporcionó comida y agua
ad libitum
. Los tumores de próstata se cortaron en 5 x 5 mm y piezas injertaron subcutáneamente como se describe anteriormente [33]. Las intervenciones quirúrgicas se realizaron bajo anestesia con isofluorano y meloxicam analgesia, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. El protocolo fue aprobado por la CEEA (Comité ético Experimentación Animal), del Instituto de Investigación del Hospital Vall d'Hebron (Número de permiso 14/05 CEEA). Todos los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las normas institucionales, que cumplieron con los requisitos establecidos por el Gobierno español y la Comunidad Europea (Real Decreto 223/1988 y BOE 256, 10.25.90). El crecimiento del tumor fue evaluada por la medición de dos diámetros perpendiculares con un calibre. El volumen (V) de cada tumor se midió una vez a la semana y se calculó como se describe anteriormente [33]. La mediana de los volúmenes tumorales se calculó para cada grupo de ratones
Tratamiento Animal
ratones se dividieron en cuatro grupos: a.) Los ratones inyectados con 6 mg de estreptozotocina (STZ) (Sigma-Aldrich , Madrid, España) por vía intraperitoneal (IP), una semana antes de que el tumor se injertó; b) los ratones tratados con STZ IP después de la implantación del tumor; c) Los ratones tratados con el vehículo (citrato mM pH del tampón 50 4,5) IP y d) los ratones no tratados. Las muestras de sangre se tomaron dos veces por semana por la vena safena para mediciones de su glucemia como un control del mantenimiento de la condición diabética. Al final de los experimentos, los animales tratados y de control fueron sedados por CO
2, e inmediatamente sacrificados por dislocación cervical. El tejido se recogieron y se congeló a -80 ° o en formalina
Histología
Las muestras tumorales fueron fijadas con formol y embebidos en parafina.; a continuación, cinco secciones de la muestra tumor mu M de espesor se hidrataron con xileno (3 x 10 min) y etanol en concentraciones decrecientes (100%, 90%, 70%, 30%; 2 x 5 minutos cada uno) y se tiñeron con hematoxilina (30 segundos) (Surgipath medicina Industrias, Inc., IL, EE.UU.) y eosina (20 segundos) (Sigma-Aldrich). Finalmente, las muestras se deshidrataron con soluciones de etanol graduado (como se describió anteriormente) y se aclaró en xileno antes de ser montada con DPX (Panreac SA, Barcelona, España).
La inmunohistoquímica
Después de la de-encerado y procesos de hidratación, las diapositivas fueron tratados previamente empleando un método de recuperación de antígeno por microondas (Dako Diagnósticos SA, Barcelona, España). La peroxidasa endógena se inactivó antes de la incubación durante la noche a 4 ° C con el receptor de andrógenos contra (conejo policlonal AR C-19, Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Alemania) se utiliza en 1:50 y con citoqueratina anti-humano de ratón monoclonal, (clones AE1 /AE3; Dako, Dinamarca). Después de varios lavados, las secciones se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Dako Diagnósticos SA), y las reacciones se desarrollaron durante 1 min con diaminobenzidina y el H
2O
2 sistema. controles negativos apropiados se realizaron secciones de incubación sin el anticuerpo primario.
Análisis de ARN
ARN total fue extraído a partir de células LNCaP de D-glucosa y L-glucosa tratada utilizando RNeasy Mini kit, (QIAGEN SL, Madrid, España) la transcripción inversa (RT) se realizó a 42 ° C, durante 50 minutos usando 2 g de ARN total y 200 U de superíndice II, junto con un cebador oligo-dT y reactivos suministrados por Invitrogen. Una alícuota del producto de RT se amplificó en una reacción de 25 l usando SYBRGreen (Invitrogen SA, Barcelona, España) con pares de cebadores de oligonucleótidos adecuados correspondientes a receptor de andrógenos (cebador directo 5'-TGAAAGCCATGCTACTCTTCAG-3 'y el cebador inverso 5' GCTCA CCATGTGTGACTTGAT-3 '), 18S humanos (cebador directo 5'TAACGAACG AGACTCTGGCAT-3' y el cebador inverso 5'-CGGACATCTAAGGGCATCACAG-3 '). Los resultados fueron analizados utilizando el programa de SDS 7000 y se cuantificaron mediante el comparativo C
método de T (2
-ΔΔC
método T).
Análisis de Western Blot
Después de los tratamientos , las células LNCaP se lavaron dos veces con PBS frío, raspado del matraz y se homogeneizaron en tampón RIPA suplementado con Complete ™ cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Barcelona, España). Los extractos de proteína se utilizaron para la transferencia de Western con anticuerpos contra anticuerpo policlonal de conejo AR AR N-20 (Santa Cruz Biotechnology Inc), humano fosfo-NF-kappa B (sc-33039; Santa Cruz Biotechnology Inc.) y anticuerpo policlonal de conejo PPIA (SA- 296;. BIOMOL Int, Madrid, España) a 4 ° C. Después de varios lavados, las bandas inmunorreactivas se visualizaron por rábano anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Dako Diagnósticos SA), seguido de reactivo quimioluminiscente peroxidasa dependiente (Pierce Biotechnology Inc., Barcelona, España) por la exposición a película de rayos x. El análisis densitométrico se realizó mediante ImageJ programa.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como media ± desviación estándar. Los datos se sometieron a la prueba y el significado de ANOVA (p & lt; 0,05; p & lt; 0,01) se alcanzó
Resultados
El tratamiento con insulina no tiene ningún efecto sobre el receptor de andrógenos (AR) Los niveles en células LNCaP
Desde el CP es dependiente de los andrógenos, lo primero que queríamos examinar si la insulina tuvo ningún efecto sobre los niveles de AR. Se han tratado las células LNCaP con diferentes concentraciones de insulina (20, 100 o 200 μUI /ml) durante cuatro días. Los resultados mostraron que los tratamientos de insulina no cambiaron los niveles de AR ARNm en comparación con las células LNCaP no tratadas (Figura 1A). Por otra parte, los niveles de proteína de AR fueron también sin cambios por el tratamiento con insulina en comparación con los controles (Figura 1B). La eficacia del tratamiento de insulina se determinó midiendo la fosforilación de proteínas IRS-1 y PS6. Los resultados mostraron que el tratamiento con insulina aumentó la fosforilación de ambas proteínas en comparación con las células control de LNCaP (Figura 1C).
se muestran (A) los niveles relativos de AR ARNm en presencia de diferentes concentraciones de insulina. Humano 18 S mRNA se amplificó como un control. Los puntos de datos se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. (B) Análisis de los niveles de proteína de AR en presencia de diferentes concentraciones de insulina en las células LNCaP por Western blot. PPIA se ha utilizado como una proteína de referencia de limpieza. (C) los niveles de fosforilación de IRS-1 y PS6 en células LNCaP tratadas durante 4 días con diferentes concentraciones de insulina medidos por el Western Blot. Ppia se ha utilizado como una proteína de referencia limpieza.
El aumento de las concentraciones de glucosa regular a la baja en las células LNCaP AR
A continuación quería estudiar los efectos de la hiperglucemia en los niveles de AR utilizando células LNCaP. células LNCaP se cultivaron con concentraciones crecientes de glucosa (5 mM, 10 mM y 30 mM) a lo largo de cuatro días. El medio se cambió cada día para mantener la concentración de glucosa constantes. los niveles de AR ARNm se redujeron significativamente en células LNCaP cultivadas en 10 o 30 mM de glucosa en comparación con las células LNCaP cultivadas en glucosa 5 mM (Figura 2A). Por otra parte, los niveles de proteína de AR también se redujeron significativamente en células LNCaP cultivadas en 10 o 30 mM de glucosa en comparación con las células LNCaP cultivadas en glucosa 5 mM (Figura 2B). Para descartar cualquier efecto osmótico de la glucosa, repetimos los experimentos usando L-glucosa y no encontramos ninguna disminución en los niveles de proteína AR (datos no mostrados).
(A) los niveles relativos de ARNm de AR en presencia se muestran de diferentes concentraciones de D-glucosa. ARNm 18S humana se amplificó como un control. Los puntos de datos se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. (B) Análisis de los niveles de proteína de AR en presencia de diferentes concentraciones de D-glucosa en las células LNCaP por Western blot. Ppia se ha utilizado como una proteína de referencia limpieza.
El efecto sinérgico de glucosa en sangre altas concentraciones y TNFa en la regulación a la baja de la AR en las células LNCaP
Los pacientes diabéticos se caracterizan por una cierta estado de inflamación de bajo grado y presentan altos niveles circulantes de TNF-α en comparación con los sujetos control. Por lo tanto, hemos querido estudiar el efecto de la adición de TNF-α en nuestro
in vitro
sistema. Para este propósito repetimos los tratamientos de glucosa en la presencia o ausencia de TNF-α (50 ng /ml). Los resultados mostraron de nuevo que AR ARNm y los niveles de proteína se redujo significativamente cuando las células se cultivaron en 10 o 30 mM de glucosa en comparación con las células LNCaP cultivadas en glucosa 5 mM. En particular, se obtuvo un efecto sinérgico potente que conduce a una reducción adicional significativa de los dos niveles de ARNm y de proteína de AR cuando se añadió TNF a diferentes concentraciones de D-glucosa en las células LNCaP (Figura 3A y B).
(A) niveles relativos de ARNm de AR en LNCaP tratadas con una concentración creciente de D-glucosa con o sin TNF. Humano 18 S mRNA se amplificó como un control. Los puntos de datos se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 en comparación con 5 mM de D-glucosa. (B) Análisis de los niveles de proteína de AR en células LNCaP tratadas como en A medidos por Western Blot utilizando ppia como una proteína de referencia limpieza.
La hiperglucemia regula a la baja a través de AR activación NF-kB en las células LNCaP
para examinar si la hiperglucemia fue capaz de regular negativamente AR través de la activación de NF-kB en nuestro
in vitro
sistema en el que realizaron los siguientes experimentos.
en primer lugar, trataron células LNCaP con 5 mM y 30 mM de glucosa y los niveles de mRNA de AR fueron analizados al inicio del estudio y después de 4 días de cultivo. Los resultados mostraron que 30 mM de glucosa era capaz de reducir los niveles de AR ARNm en comparación con las células LNCaP cultivadas en glucosa 5 mM (Figura 4A). Los niveles de proteína AR también se redujeron en células LNCaP cultivadas en glucosa 30 mM en comparación con la glucosa 5 mM. Más importante, un aumento en la fosforilación de p65, una subunidad NF-kappa B, también fue detectado en células cultivadas en glucosa 30 mM en comparación con las células cultivadas en glucosa 5 mM (Figura 4B).
(A) AR relativa los niveles de mRNA en LNCaP tratadas con 5 mM o 30 mM de glucosa. Humano 18 S mRNA se amplificó como un control. Los puntos de datos se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 en comparación con glucosa 5 mM. (B) Análisis de AR y fosfo-p-65 niveles de proteína en células LNCaP tratadas como en A medido por transferencia Western utilizando PPIA como una proteína de referencia de limpieza. (C) los niveles relativos de ARNm de AR en LNCaP tratadas con 5 mM o 30 mM de glucosa en ausencia o presencia de QNZ (25 nM). Humano 18 S mRNA se amplificó como un control. Los puntos de datos se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 en comparación con glucosa 5 mM. (D) Análisis de los niveles de proteína en las células LNCaP AR tratados como en C medido por Western Blot utilizando ppia como una proteína de referencia limpieza.
A continuación decidimos tratar las células LNCaP con 5 mM o 30 mM de glucosa en presencia o ausencia de QNZ (25 nM), un inhibidor de NF-kB. Los resultados mostraron que QNZ co-tratamiento fue capaz de bloquear la regulación por disminución inducida por la hiperglucemia de AR ARNm y los niveles de proteína (Figura 4C y D).
Diabetes inducida por estreptozotocina (STZ-DM) Produce cáncer de próstata (CaP ) Retardo del Crecimiento en un modelo de ratón PAC120
a continuación quería estudiar si la hiperglucemia por sí mismo podría proteger contra el desarrollo del cáncer de próstata
in vivo
. Con el fin de hacer esto, se utilizó un modelo de ratón PAC120 CaP con STZ-DM. Para este propósito la inyección intraperitoneal de STZ se administró a los ratones nude suizo antes (n = 7) y después (n = 7) la implantación del tumor PAC120 por vía subcutánea. No tratados (n = 5) y se trató de citrato (n = 5) ratones se utilizaron como controles. No tratados y los ratones tratados con citrato mostraron un crecimiento del tumor similar (Figura 5ai) mientras que los ratones STZ-DM mostraron una reducción en el crecimiento del tumor (Figura 5Aii) o ningún crecimiento del tumor (Figura 5Aiii).
(A) Las imágenes de los tumores desarrollado en ratones tratados con vehículo (n = 5) (i), STZ tratados después o antes de la implantación del tumor (n = 7 para ambos) con reducida (ii) o no crecimiento del tumor (iii). (B) Comparación del volumen del tumor para (5 n =) y los ratones no tratados tratado de citrato (n = 5). (C) El volumen del tumor de los animales tratados con STZ después de la implantación del tumor en comparación con el volumen del tumor de los ratones tratados con citrato. (D) El volumen del tumor de los animales tratados con STZ antes de la implantación del tumor en comparación con el volumen del tumor de los ratones tratados con citrato. Los datos son la media ± SD. * P & lt; 0,05 y ** P & lt;. 0,01 en comparación con el control
El crecimiento tumoral se siguió midiendo volúmenes de los tumores una vez a la semana. No tratados y ratones tratados con citrato mostraron un crecimiento similar durante el experimento de 40 días (Figura 5B). Ambos grupos de ratones diabéticos mostraron crecimiento tumoral reducida en comparación con los ratones de control (Figura 5C y D). Los ratones que eran diabéticos antes de la implantación del tumor (Figura 5D) mostraron una mayor reducción en el crecimiento del tumor en comparación con los ratones que eran diabéticos después de la implantación del tumor (Figura 5C).
La diabetes inducida por estreptozotocina (STZ-DM) Reduce AR la expresión en tumores y endógeno próstatas de PAC120 modelo de ratón
el examen histológico de hematoxilina /eosina (HE) secciones teñidas de ambos grupos de ratones diabéticos (Figura 6 G y J) no mostró cambios morfológicos en el tumor en el respeto a los controles o los ratones tratados de citrato (Figura 6A y D). Ellos mostraron diferenciación glandular raro, alto índice mitótico y se clasificaron como Gleason 9 (4 + 5) por el patólogo.
(A) tinción con HE de xenoinjertos de tumores de próstata de los ratones de control, (d) tratado citrato ratones, (G) STZ-tratada antes de la implantación del tumor y (J) STZ tratadas después de la implantación del tumor. (B) tinción AR de xenoinjertos de tumores de próstata de los ratones no tratados, (E) tratados citrato ratones, (H) los ratones antes de la implantación del tumor y los ratones tratados con STZ (K) después de la implantación del tumor tratados con STZ. (C) Citoqueratina tinción de xenoinjertos de tumores de próstata de los ratones de control, (F) los ratones tratados con citrato, (I) los ratones tratados con STZ antes de la implantación del tumor y (L) ratones tratados con STZ después de la implantación del tumor.
Desde nuestros
in vitro
experimentos mostraron que la hiperglucemia reducido los niveles de AR que decidimos explorar la posibilidad de que STZ-DM estaba afectando a los niveles de AR
in vivo
. Se realizó inmunohistoquímica contra el receptor de andrógenos, en los tumores de control y ratones diabéticos. Los animales de control mostraron tinción nuclear positiva y fuerte para el receptor de andrógenos en todas las células epiteliales (Figura 6B y E). ratones diabéticos mostraron células epiteliales sin manchas o pocas células con tinción AR nuclear o citoplásmica, pero la mayoría de las células eran AR negativo (Figura 6H y K). Se confirmó que AR células epiteliales fueron negativos mediante la realización de una inmunohistoquímica contra pan-citoqueratina en los tumores de los ratones de control, citrato y STZ-DM (Figura 6C, F, I y L).
A continuación mide AR ARNm niveles en xenoinjertos de ratones control y STZ-DM y encontramos que la hiperglucemia reduce los niveles de ARNm de AR en tumores de los ratones STZ-DM en comparación con los ratones control (Figura 7A). Además, como ocurre en las células LNCaP una regulación a la baja de los niveles de AR fue acompañado por un aumento de la fosforilación de p65, una subunidad NF-kappa B, en xenoinjertos de ratones STZ-DM (Figure7B).
(A) AR relativa los niveles de mRNA de citrato y los ratones tratados con STZ. Humano 18 S mRNA se amplificó como un control. Los puntos de datos se muestran como media ± desviación estándar de los triplicados. (B) Análisis de AR (panel izquierdo) y los niveles de proteína de citrato y los ratones tratados con STZ medidos por Western Blot utilizando ppia como una proteína de referencia limpieza fosfo-p-65 (panel derecho).
Por último, teñidas las próstatas endógenos del control y los dos grupos de ratones diabéticos para explorar si la hiperglucemia también regula a la baja los niveles de AR endógenos. De hecho, AR tinción se redujo en próstatas de los ratones STZ-DM en comparación con los ratones de control (Figura 8).
tinción AR se muestra en los tumores de xenoinjerto de próstata (I) y en próstatas endógenos (II) a partir los ratones de control. tinción AR se muestra en los tumores de xenoinjertos de próstata (iii) y próstatas endógenos (iv) de STZ- ratones tratados.
Discusión
CaP es el cáncer de órgano sólido más común en los hombres en los EE.UU., Canadá y Australia, y el segundo cáncer más común en los hombres a nivel mundial. los hombres de Estados Unidos tienen un riesgo de por vida estimado actual de uno de cada seis y PCA representa, después del cáncer de pulmón, la segunda causa de mortalidad relacionada con el cáncer [1]. factores de riesgo establecidos de CaP son la edad avanzada, la etnia afroamericana y una historia de la enfermedad en un pariente de primer grado. DT2 se ha asociado con un bajo riesgo de desarrollar CaP y esto ha sido confirmado recientemente en un meta-análisis que incluyó 29 cohortes y 16 estudios de casos y controles relacionados con 8,1 millones de participantes y 132,331 casos de CaP [34]. Nuestros resultados dan el primer soporte experimental a este concepto.
La vía AR desempeña un papel clave en la integridad estructural y funcional de la próstata, así como para el crecimiento y la progresión de CaP [15]. A este respecto, se ha informado de que la caída de AR conduce a la inhibición del crecimiento y la apoptosis de las dos células de CaP andrógeno-dependiente y andrógeno-independiente [35] - [37]. Sin embargo, el efecto de la diabetes sobre el crecimiento del tumor y AR nunca había sido explorado. En el presente estudio proporcionamos primera evidencia de que la hiperglucemia regula a la baja AR través de la activación de NF-kB, y que este efecto inhibidor se incrementa aún más por TNFa. Además, se encontró que esta regulación a la baja de AR inducida por la diabetes se asocia con significativo retraso en el crecimiento del tumor en un
in vivo
modelo de CaP. Nos gustaría señalar que en los
in vitro
experimentos siempre hemos obtenido resultados consistentes en términos de reducción de la glucosa inducida por los niveles de AR. Sin embargo, hemos detectado una variabilidad significativa en la medida de la reducción de los niveles de AR causados por el tratamiento de la glucosa.
susceptibilidad genética y los bajos niveles de insulina, IGF-1 y la testosterona son algunos de los factores propuestos que confieren protección de CaP en la DT2. Por el contrario, el posible papel de dos acontecimientos esenciales que se producen en la DT2: hiperglucemia y el aumento de citoquinas proinflamatorias (. Es decir, TNFa) no han sido examinados previamente
CaP tiene una de las relaciones más fuertes entre la edad de los hubiere. cáncer humano, y los factores genéticos se estima que representan el 42% del riesgo [15]. Es posible que la presencia de factores genéticos, tales como variantes tcf2, que se asocian tanto con diabetes tipo 2 y el bajo riesgo de CaP participar en el bajo riesgo de CaP observó diabetes tipo 2 [20]. Sin embargo, la relación temporal entre el diagnóstico de DM y el riesgo de CaP (como el tiempo ya que los aumentos DM-diagnóstico, el riesgo de CaP disminuye) sostiene firmemente en contra de este concepto [4]. En apoyo de esto, hemos encontrado un menor crecimiento del CaP xenofraft en el grupo de ratones con diabetes duración más larga.
La insulina es un factor de crecimiento para el epitelio prostático y también estimula el crecimiento de una línea celular de rata in vitro CaP [38]. Más recientemente, un estudio experimental informó intracelular
de novo
esteroidogénesis promovido por la insulina en el CaP [39], pero el efecto sobre la AR no fue analizado. Estos resultados sugieren que la insulina puede promover directamente la proliferación de células de cáncer de próstata. Sin embargo, estas observaciones se basan en un modelo experimental de cáncer de próstata resistente a la castración, y el efecto de la insulina sobre la tumorigénesis de próstata durante la fase temprana o en el cáncer de hormona-naïve (tales como LNCaP) permanece por esclarecer. Además, las dosis de insulina utilizados fueron estudios suprafisiológicas y adicionalmente usando dosis de insulina en el intervalo picomolar (tal como se utilizó en el presente estudio) son necesarios. En el ámbito clínico, mientras que algunos estudios prospectivos demuestran que puede haber una asociación entre hiperinsulinemia y el riesgo de CaP, también hay varios estudios que no apoyan el papel de la insulina en el riesgo de CaP y por lo tanto sigue siendo un área de investigación [4 ], [15]. Sin embargo, el agotamiento de la insulina se produce al aumentar la duración de la diabetes puede limitar la acción de la insulina y por lo tanto proteger contra el CaP. En este sentido, los hombres con bajos niveles de insulina debido a la diabetes parecen tener un menor riesgo de desarrollo de CaP [40], [41]. De hecho, los niveles bajos de insulina podría ser un factor que contribuye implicado en el crecimiento del tumor menor observado en ratones PAC120 CaP tratados con STZ utilizado en el presente estudio.
Una hipótesis propuesta de cómo hipoinsulinemia puede disminuir la carcinogénesis de próstata es mediante la limitación de la biodisponibilidad del factor de crecimiento similar a insulina I (IGF-I) [15]. Sin embargo, estudios recientes sugieren que los niveles de IGF-1 no son significativamente diferentes entre los diabéticos y controles [41], [42]. Además, un gran estudio prospectivo reciente ha concluido la ausencia de correlación entre los niveles plasmáticos de IGF-1 y la resistencia a la insulina [42]. Por lo tanto, la asociación de IGF-1-CaP en la población diabética tipo 2 sigue siendo especulativa.
Desde el CP es dependiente de andrógenos es posible que los niveles más bajos de testosterona reportados en la diabetes a largo plazo (especialmente los hombres obesos) puede llegar a niveles por debajo de un umbral a un menor riesgo de CaP [4], [15]. Sin embargo, es bien sabido que relacionar un nivel de testosterona en suero a un fenotipo clínico es una simplificación excesiva, dado que los niveles circulantes de testosterona, ya sea libre o total, son poco probable que refleje con precisión la acción de andrógenos en el tejido plano. Sin embargo, algunas evidencias sugieren que los niveles bajos de testosterona circulantes pueden ser un factor de riesgo de CaP agresividad [43], [44] y esto podría ser una razón por la que el CP aparece en la DT2 tiene un peor pronóstico [15], [44]. En este sentido, es posible que los bajos niveles de AR debido a la hiperglucemia, los altos niveles de TNF y los niveles bajos de testosterona, además de conferir protección contra el desarrollo del CaP también podría actuar como un mecanismo para el accionamiento de las células de la próstata hacia un cierto grado de independencia de andrógenos. De hecho, la activación de NF-kappa B ha sido implicado en el crecimiento independiente de andrógenos del CP [45]. Una vez que un CaP se desarrolla en pacientes diabéticos tipo 2 esto explicaría su resultado agresividad y pobres [9] - [11]. Hasta cierto punto, esto también podría ocurrir en pacientes obesos, ya que la obesidad puede reducir el riesgo de CaP no agresivo, mientras que al mismo tiempo promover el riesgo de CaP agresivo [46], [47].
Los mecanismos que subyacen no se ha informado anteriormente de la hiperglucemia en la regulación AR. En el presente estudio se encontró que la hiperglucemia regula a la baja AR través de la activación de NF-kB, y que este efecto inhibidor se incrementa aún más por TNFa. Además, la regulación a la baja de AR inducida por la diabetes se asoció con una reducción del crecimiento del tumor o incluso no el crecimiento tumoral en el modelo de ratón PAC120 CaP tratados con STZ. Además, se detectó una reducción significativa en la expresión de AR en la próstata endógenos de este
in vivo
modelo. En general, nuestros resultados sugieren que los dos componentes esenciales de la diabetes tipo 2: la hiperglucemia y la citoquina proinflamatoria TNF participa en la reducción del riesgo de CaP en DM2.