Extracto
Antecedentes
La dihidroartemisinina (DHA), un semi derivado sintetico de la artemisinina, ha demostrado recientemente la actividad antitumoral en diversas células cancerosas. ligando Apo2 o necrosis tumoral ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor (Apo2L /TRAIL) es considerado como un agente anticanceroso prometedor, pero la quimio-resistencia afecta su eficacia como estrategia de tratamiento. La apoptosis inducida por la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL no ha sido bien documentado, y los mecanismos implicados siguen sin estar claros.
Metodología /Principales conclusiones
A continuación, mostramos que el DHA mejora la eficacia de Apo2L /TRAIL para el tratamiento de cáncer de páncreas. Se encontró que la terapia combinada usando DHA y Apo2L /TRAIL mejora de forma significativa la apoptosis en BxPC-3 y las células PANC-1 en comparación con el tratamiento con un solo fármaco
in vitro
. El efecto de DHA fue mediada a través de la generación de especies reactivas de oxígeno, la inducción de la muerte del receptor 5 (DR5) y la modulación de las proteínas relacionadas con la apoptosis. Sin embargo, la cisteína N-acetil redujo significativamente la apoptosis mejorada observada con la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL. Además, desmontables de DR5 por pequeños ARN de interferencia también redujo significativamente la cantidad de la apoptosis inducida por la DHA y Apo2L /TRAIL.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados sugieren que el DHA mejora la Apo2L /TRAIL la apoptosis mediada por células de cáncer de páncreas humanos a través de las especies reactivas de oxígeno mediada sobre regulación de DR5
Visto:. Kong R, G Jia, Cheng Zx, Wang Yw, Mu M, Wang SJ, et al. (2012) dihidroartemisinina Mejora Apo2L /TRAIL mediada por apoptosis en células de cáncer pancreático a través de ROS mediada por la regulación de la muerte del receptor 5. PLoS ONE 7 (5): e37222. doi: 10.1371 /journal.pone.0037222
Editor: Joseph Alan Bauer, Fundación de Investigación Bauer, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Julio, 2011; Aceptado: April 15, 2012; Publicado: 30 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Kong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Fundación del primer hospital Afiliado de la Universidad médica de Harbin (2011BS007), la Fundación Nacional de Ciencia para científicos de post-doctorado de china (20110491109), y la Fundación de Investigación de la Oficina de Educación de la provincia de Heilongjiang, china ( 12511246). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es uno de los tumores malignos del sistema digestivo más letales y tiene un muy mal pronóstico [1], [2]. La quimioterapia convencional ha demostrado beneficio de supervivencia limitado cuando se combina con la resección quirúrgica [3]. Por lo tanto, se necesita urgentemente una estrategia de tratamiento eficaz para el cáncer de páncreas.
La artemisinina (el principio activo de la hierba medicinal china, la Artemisia annua [4], [5]) y sus derivados son los fármacos antipalúdicos extremadamente eficaces con pocos efectos secundarios adversos [6]. Dihidroartemisinina (DHA), un derivado de la artemisinina, es un antipalúdico más eficaz y soluble en agua que la artemisinina [7]. Recientemente, se ha demostrado que el DHA mata eficazmente diversos tipos de células de cáncer [8] - [13]. Además, se ha determinado que el DHA puede inhibir significativamente el crecimiento celular e inducir la apoptosis de las células de cáncer de páncreas de una manera dosis-y dependiente del tiempo, pero es esencialmente no tóxico para las células normales [9]. En estudios anteriores, Agtmael [14] y O'Neill PM [5] demostró que la artemisinina contiene un puente endoperóxido, que es esencial para la reacción con el hierro para formar especies reactivas de oxígeno (ROS). Por otra parte, se ha demostrado que las células cancerígenas absorben mayores cantidades de hierro para producir niveles más altos de ROS intracelulares que se encuentran en las células normales [15]. Por lo tanto, es probable que la potencia de DHA contra las células cancerosas está relacionada con la generación de ROS [16], pero el mecanismo real de la acción DHA es poco conocido.
Apo2 ligando o de necrosis tumoral apoptosis relacionado con el factor -inducing ligando (Apo2L /TRAIL) es un miembro de la superfamilia de TNF, que sirve como un agente anticancerígeno eficaz debido a su especificidad de células cancerosas y una potente actividad antitumoral. Apo2L /TRAIL induce apoptosis en células de cáncer a través de interacciones con receptores de muerte 4 (DR4) y DR5, que forman el complejo de la señal induce a la muerte (DISC) mediante la unión a FADD y la caspasa-8 o caspasa-10 [17] - [19] . El disco, a su vez, inicia una cascada de proteasas, que activa las caspasas efectoras aguas abajo, incluyendo la caspasa-3. Además, muchas proteínas relacionadas con la apoptosis aguas abajo de los receptores de muerte, tales como la caspasa-6, caspasa-7 y la caspasa-9, participan en Apo2L /TRAIL inducida por apoptosis [20]. Un número de estudios han demostrado que los terpenoides pueden regular por incremento la expresión de DR4 y /o DR5 en células cancerosas humanas [12], [20], [21]. Por lo tanto, los agentes que pueden regular por incremento los receptores de Apo2L /TRAIL y regular a la baja las proteínas anti-apoptóticas tienen el potencial para mejorar los efectos apoptóticos de Apo2L /TRAIL. En este estudio, hemos tratado de determinar el efecto de DHA en Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de páncreas. Nuestros resultados muestran que el DHA puede potenciar los efectos apoptóticos de Apo2L /TRAIL a través de la regulación de la expresión de DR5 en células de cáncer de páncreas humano.
Resultados
DHA y Apo2L /TRAIL sinérgicamente inhibe el crecimiento de las células de cáncer pancreático
para determinar si DHA y Apo2L acto /TRAIL de forma sinérgica para inhibir el crecimiento de células de cáncer pancreático, se midió la viabilidad celular en las líneas celulares PANC-1 BxPC-3 y en respuesta a diferentes regímenes de tratamiento. Se observó una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis cuando las células BxPC-3 fueron tratados con DHA (0-100 mmol /L) o Apo2L /TRAIL (0-200 ng /ml) sola (Figura 1A izquierda). Sin embargo, el tratamiento con dosis más altas de DHA y Apo2L /TRAIL en combinación (50 mmol /L y 100 ng /ml, respectivamente y 6 mol /L y 200 ng /ml, respectivamente) dio como resultado la inhibición del crecimiento más potente que el tratamiento con cualquiera de los compuestos solo (Figura 1A izquierda). Para determinar con mayor precisión los efectos de la terapia de combinación, los datos se examinaron usando el análisis de la mediana del efecto para determinar el tipo de interacciones que se produjo, es decir, el antagonismo (CI & gt; 1), adición (CI = 1) o sinergismo (CI & lt; 1). El efecto sinérgico (CI & lt; 1) se observó en la terapia de combinación (Figura 1A derecha). Del mismo modo, se observó un efecto sinérgico sugestivo de DHA y Apo2L /TRAIL en el crecimiento celular en células Panc-1 (datos no presentados).
Las células (A) se trataron con solo DHA, Apo2L /TRAIL solo o una combinación de los dos agentes y se incubaron a 37 ° C durante 72 h. La viabilidad de las células se evaluó mediante el método MTT. índice de combinación (IC) frente a las parcelas fracción afectada (Fa) obtenidos a partir del análisis del efecto mediana de Chou-Talalay. Un CI & gt; 1 indica antagonismo, = 1 indica aditividad, y & lt; 1 indica sinergia. (B) El ensayo clonogénico se realizó como se describe en la sección Materiales y Métodos. Las células fueron tratadas con DHA (50 mmol /L) solo, Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) solo o la combinación de los dos fármacos durante 24 h y se lavó con PBS. Las células se incubaron a continuación durante un 7 d adicional y se tiñeron con cristal violeta. (C) la supervivencia clonogénico se presenta como el porcentaje de colonias supervivientes formado en las células tratadas con fármaco con respecto a las células no tratadas.
A continuación, se realizó un ensayo clonogénico para determinar si DHA aumenta el efecto de Apo2L /TRAIL en la formación de colonias a largo plazo. Las células fueron tratadas con DHA (50 mmol /L) y Apo2L /TRAIL (100 ng /ml), ya sea solos o en combinación para 24 h. Después, las células se lavaron con PBS, se incubaron en medio fresco y, siete días más tarde, se tiñeron con cristal violeta. El ensayo clonogénico indicó que el número de colonias supervivientes en el grupo que recibió la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL fue dramáticamente más baja que en los grupos tratados con DHA o Apo2L /TRAIL solo. Estos resultados indican que el tratamiento combinado con DHA y Apo2L /TRAIL redujo significativamente el número de células reproductivas (Figura 1B y 1C).
DHA mejora Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL depende de especies reactivas de oxígeno
para determinar si la capacidad de DHA para potenciar la citotoxicidad de Apo2L /TRAIL estaba mediada por la apoptosis inducida por ROS, se utilizó citometría de flujo y microscopía de escaneo láser confocal para medir la tasa de apoptosis e intracelular de ROS en BxPC-3 y PANC- 1 en las células.
BxPC-3 y PANC-1 células fueron tratadas con DHA (50 mmol /L) y /o Apo2L /TRAIL (100 ng /ml). Después de 72 h de tratamiento, las células se tiñeron con Anexina V y yoduro de propidio (PI), sometidas a citometría de flujo y vieron por microscopía de barrido láser confocal para medir la tasa de apoptosis. histogramas representativos de la citometría de flujo experimentos indican que las tasas de apoptosis de control de BxPC-3 células y las células tratadas con DHA, Apo2L /TRAIL o la combinación de ambos eran 5,1%, 29,4%, 15,5% y 47,8%, respectivamente (Figura 2A ). Con respecto a las células PANC-1, las tasas de apoptosis fueron 6,7%, 18,6%, 11,9% y 45,8%, respectivamente. Por lo tanto, el tratamiento con DHA o Apo2L /TRAIL solo aumentó significativamente la tasa de apoptosis de las células BxPC 3-en comparación con los controles (tanto
P Hotel & lt; 0,05). Además, el tratamiento con la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL condujo a un aumento adicional de la tasa de apoptosis en comparación con el tratamiento con DHA o Apo2L /TRAIL solo (ambos
P
& lt; 0,01). Se obtuvieron resultados similares con células PANC-1. La extensión de la apoptosis, como se detecta por medio del etiquetado Anexina V, se aproxima a la reducción de la viabilidad celular después del tratamiento con DHA, Apo2L /TRAIL o la combinación de ambos, lo que sugiere que las cuentas de la apoptosis para la mayor parte de la citotoxicidad observada. Sin embargo, el pretratamiento con N-acetil cisteína (NAC, 10 mM) fue capaz de reducir significativamente la cantidad de apoptosis causada por el tratamiento combinado de DHA y Apo2L /TRAIL en las células BxPC-3 y PANC-1 (ambos
P
& lt; 0,01). Tomados en conjunto, estos datos indican que ROS media la capacidad de DHA para mejorar Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL. El uso de escaneo láser confocal de microscopía confirmó el aumento de la apoptosis medida por citometría de flujo, como se muestra en las fotografías representativas (Figura 2B). células BxPC-3 y PANC-1 tratados con DHA y Apo2L /TRAIL muestran más numerosas células apoptóticas temprana y la fase tardía de los controles, que tenía muy pocas células apoptóticas en etapa temprana.
(A) Apoptosis de células de cáncer pancreático. células BxPC-3 y PANC-1 fueron tratados con DHA (50 mmol /L) y Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) como se indica. La citometría de flujo se realizó para medir las tasas de apoptosis (%). Un aumento significativo en la tasa de apoptosis en comparación con el control se representa por "*" (
P
& lt; 0.05), un aumento significativo en comparación con las células de DHA o de Apo2L /TRAIL tratados se denota por "†" (
P
& lt; 0,01), y una disminución significativa en comparación con las células de DHA + Apo2L /TRAIL tratados se denota por "‡" (
P
& lt; 0,01). histogramas representativos de células BxPC-3 y PANC-1 citometría analizados tratados con control, DHA, Apo2L /TRAIL, DHA + Apo2L /TRAIL o NAC (10 mM). (B) de barrido láser microscopía confocal de las células. fotografías representativas fueron tomadas del control BxPC-3 y las células PANC-1 y de BxPC-3 y las células PANC-1 tratados con DHA + Apo2L /TRAIL y DHA + Apo2L /TRAIL + NAC. (C) Los niveles de ROS intracelulares medidos in vitro. células BxPC-3 y Panc-1 fueron tratados con DHA (50 mmol /L), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml), DHA + Apo2L /TRAIL, o pretratadas con NAC (10 mM) y luego tratados con DHA + Apo2L /TRAIL durante 6 h. Las células no tratadas sirvieron como control. Las células se incubaron con DCFHDA y después se sometieron a citometría de flujo para medir los niveles de ROS intracelulares, como la representada por la fluorescencia DCF. Un aumento significativo de la fluorescencia DCF comparación con el control se representa por "*" (
P
& lt; 0,05), una diferencia altamente significativa en comparación con el control se representa por "**" (
P
& lt; 0,01), y una reducción significativa en comparación con el Apo2L tratamiento DHA + /TRAIL se denota por "†" (
P
& lt; 0,05). (D) representativos se muestran fotografías de las células teñidas con DCFHDA observados mediante escaneo láser microscopía confocal. La fluorescencia verde representa ROS intracelulares. (E) La intensidad de fluorescencia media se midió para las células teñidas con DCFHDA, y las respectivas imágenes plano horizontal 3 dimensiones fueron producidos por barrido láser microscopía confocal. Una diferencia significativa del control se representa por "*" (
P
& lt; 0,01), y una diferencia significativa con el tratamiento /TRAIL + DHA Apo2L se denota por "†" (
P
& lt;. 0.05)
BxPC-3 y las células Panc-1 se incubaron con DHA (50 mmol /L), Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) o la combinación de ambos para 12 h, y DCF fluorescencia se registró como una medida de los niveles de ROS intracelulares. Como se muestra en la Figura 2C, los niveles de ROS intracelular fueron significativamente (
P
& lt; 0,01) más alta en las células que habían sido tratados con DHA y la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL que en las células de control. Sin embargo, el tratamiento Apo2L /TRAIL solo tuvo poco efecto en los niveles de ROS intracelulares en las células PANC-1 BxPC-3 y. Para confirmar que la generación de ROS es responsable de la mejora de Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL, las células fueron pretratadas con NAC 10 mM, un inhibidor conocido de la producción de ROS, por 6 h y después se incubaron con la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL. Láser resultados del análisis indican que el pretratamiento con NAC significativamente (
P
& lt; 0,05) redujo el nivel de ROS intracelular en todos los tipos de células en comparación con las células tratadas con DHA y Apo2L /TRAIL solo. La microscopía confocal en combinación con la tinción de DCFHDA, donde fluorescencia verde representa la ROS intracelular (Figura 2D), reveló que intracelular de ROS fue significativamente (
P
& lt; 0,01) más alta en las células tratadas con DHA que en las células de control. Sin embargo, el pretratamiento con NAC significativamente (
P Hotel & lt; 0,05). Reducirse la intensidad de fluorescencia media de las células DHA y Apo2L /TRAIL-tratado (Figura 2E)
DHA regula la apoptosis relacionada la expresión génica
a continuación, se analizó la expresión de genes relacionados con la apoptosis mediada por ROS después del tratamiento con DHA. células BxPC-3 y Panc-1 se trataron con diversas concentraciones de DHA (0, 25, 50 y 100 mmol /L) o pretratadas con NAC (10 mM) seguido de la adición de DHA (100 mmol /L) durante 72 h , y los niveles de expresión de Bcl-2, Bax, sobreviviendo, caspasa-3, caspasa-8 y la caspasa-9 se detectaron por análisis de transferencia Western. En respuesta a la DHA, los niveles de expresión de Bax, caspasa-3, caspasa-8 y la caspasa-9 fueron significativamente regulados up-, mientras que Bcl-2 expresión disminuyó de una manera dependiente de la dosis, y la expresión de survivina se mantuvo sin cambios en el BxPC-3 y PANC-1 en las células. Curiosamente, el pretratamiento con NAC (10 mM) bloqueó la capacidad de DHA a un máximo de regular la expresión de la caspasa-8, Bax, caspasa-9 y la caspasa-3. También se encontró que el DHA mejoró significativamente Apo2L mediada por TRAIL apoptosis /en ambas líneas celulares, y esta correlacionado con el aumento de activación de la caspasa-8, Bax, caspasa-9 y la caspasa-3 (Figura 3).
células BxPC-3 y PANC-1 se trataron con diversas concentraciones de DHA (0, 25, 50, 100 mol /L) y pretratados con NAC seguido de DHA (100 mmol /L) durante 72 h. Extractos de células enteras se prepararon y analizaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpos contra Bcl-2, Bax, sobreviviendo, caspasa-3, caspasa-8, y la caspasa-9. DHA significativamente hasta regulada la expresión de Bax, caspasa-3, caspasa-8 y la caspasa-9, y el regulado de la expresión de Bcl-2. Sin embargo, DHA tuvo poca influencia en la expresión de survivina. DHA con NAC (10 mM) de tratamiento previo no hasta de regular la expresión de la caspasa-8, Bax, caspasa-9, y la caspasa-3. β-actina sirvió como control interno.
DHA-inducida sobre regulación de DR5 depende de las especies reactivas del oxígeno
A continuación examinó si ROS participó en DR5 inducida por el DHA expresión. células BxPC-3 y PANC-1 se trataron con diversas concentraciones de DHA durante 48 h, se prepararon extractos de células enteras y se examinó la expresión de la proteína DR5. Hemos encontrado que el DHA tuvo efectos dosis-dependiente de la expresión de DR5 (Figura 4A). Por lo tanto, hemos tratado de determinar si la generación de ROS se asocia directamente con la capacidad de DHA para inducir la expresión de DR5. detección FACS mostró que el tratamiento de BxPC-3 y PANC-1 con DHA aumentó los niveles de ROS intracelulares de una manera dependiente de la dosis, y el aumento inducido por DHA en los niveles de ROS se bloqueó de manera significativa por el tratamiento previo con NAC 10 mM (Figura 4B). Es importante destacar que, el pretratamiento con NAC marcadamente inhibida la inducida DHA sobre regulación de la expresión de DR5 (Figura 4A).
células (A) BxPC-3 y Panc-1 se trataron con las dosis indicadas de DHA para 48 h . Extractos de células enteras se prepararon y analizaron para la expresión de DR5 mediante transferencia Western. DHA tuvo efectos dosis-dependiente de la expresión de DR5. El aumento inducido por DHA en los niveles de DR5 se bloqueó de manera significativa por el tratamiento previo con NAC 10 mM. ß-actina sirvió como un control interno. (B) Las células se recogieron y se analizaron mediante citometría de flujo. Se observó un aumento gradual en la fluorescencia en células tratadas con 25, 50 y 100 mmol /L DHA, respectivamente, lo que indica un aumento dependiente de la dosis en la producción de ROS en respuesta al tratamiento DHA en las dos líneas celulares. La producción de ROS fue marcadamente inhibida por el pretratamiento de las células con NAC (10 mM). (C) Las células fueron tratadas con DHA (50 mmol /L) solo, Apo2L /TRAIL (100 ng /ml) solo o una combinación de los dos agentes. Las células fueron también tratados con NAC (10 mM) solo o pretratados con NAC y se incubaron a 37 ° C durante 72 h. La viabilidad de las células se evaluó mediante el método MTT y se calculó el índice de viabilidad (%). Las diferencias significativas se indican con "*" (
P Hotel & lt; 0,01).
A continuación examinó si la compactación de los ROS podría atenuar la muerte celular Apo2L /TRAIL inducida reforzada por el DHA . Como se muestra en la Figura 4C, DHA notablemente mayor Apo2L muerte celular /inducida por TRAIL en células PANC-1 BxPC-3 y. Sin embargo, el pretratamiento con NAC reduce significativamente la capacidad de DHA para inducir la muerte celular de 63% a 14% en BxPC-3 células y del 31% al 17% en las células PANC-1. Tomados en conjunto, estos datos indican que el ROS mediada sobre regulación de DR5 es crítica para la mejora observada de DHA Apo2L apoptosis /inducida por TRAIL.
Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL está mediada por DR5 regulados por el DHA
expresión
también se investigó si se requiere la expresión de DR5 mediada DHA para Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL en células de cáncer de páncreas. Para determinar el papel de DR5 en la apoptosis de Apo2L /TRAIL-inducida, se utilizó siRNAs para regular a la baja la expresión de DR5. A continuación examinó si la supresión de DR5 de siRNA podría derogar los efectos sensibilizantes de DHA en la muerte celular Apo2L /TRAIL-inducida. La transfección de células con siRNA DR5 aumentó la viabilidad de BxPC-3 células por 47% (
P
& lt; 0,01) y la viabilidad de las células PANC-1 por 42% (datos no mostrados), en comparación con la combinación tratamiento solo (Figura 5); tratamiento con ARNsi de control no tuvo ningún efecto (Figura 5). Estos resultados ponen de manifiesto, por lo tanto, que el efecto de DHA sobre la apoptosis inducida por TRAIL Apo2L /había abolido eficazmente en las células que fueron transfectadas con DR5 siRNA, lo que indica que DR5 es un mediador importante de apoptosis de Apo2L /TRAIL-inducida.
BxPC-3 y PANC-1 células fueron transfectadas con DR5 siRNA y el control de siRNA, ya sea solo o en combinación. Después de 48 h, las células se trataron con 50 mmol /L DHA durante 24 h, y extractos de células enteras se sometieron a transferencia Western para detectar la expresión de DR5. La transfección de células con siRNA dirigidos DR5 silenciada específicamente la expresión de DR5. Las células se sembraron en un portaobjetos de cámara y se transfectaron con siRNAs. Después de 48 h, las células se trataron con 50 mmol /L DHA, 100 ng /ml de Apo2L /TRAIL, solo o en combinación, y se incubaron a 37 ° C durante 72 h. La viabilidad de las células se evaluó mediante el método MTT, y se calculó el índice de viabilidad (%). El silenciamiento de DR5 por siRNA reduce el efecto citotóxico de la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL pero no de DHA solo. Las diferencias significativas se indican con "*" (
P Hotel & lt; 0,01).
DHA y Apo2L /TRAIL inhibe significativamente el crecimiento de células de cáncer de páncreas humanos
in vivo
Para investigar el efecto de DHA y /o Apo2L /TRAIL en el crecimiento celular
in vivo
, BxPC-3 células fueron xenoinjertado por vía subcutánea en ratones desnudos. Ni el DHA ni los grupos de Apo2L /TRAIL demostraron una reducción significativa en el volumen del tumor en comparación con el grupo control (
P
& lt; 0,05). Sin embargo, los ratones tratados con la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL tenían tumores que no sólo eran significativamente más pequeño que el control (
P
& lt; 0,01), pero también eran más pequeños que los tratados con cualquier agente solo (
P
& lt; 0,05), lo que demuestra mayor supresión en el crecimiento del tumor
in vivo
(Figura 6A y B). El análisis de transferencia Western de lisados de tejido tumoral también reveló que los niveles de expresión de DR5, caspasa-3 y caspasa-8 fueron significativamente hasta reguladas en el grupo tratado con la terapia de combinación y en un grado más alto que los grupos tratados con DHA o Apo2L /TRAIL solo (Figura 6C). Estos resultados son consistentes con nuestros
in vitro
estudios, proporcionando una prueba más de que el DHA puede potenciar la actividad antitumoral de Apo2L /TRAIL
in vivo
.
(A) BxPC- 3 tumores se establecieron por vía subcutánea en ratones. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 120 mm
3 en volumen, los ratones se asignaron aleatoriamente a control, DHA, Apo2L /TRAIL, o grupos de DHA + Apo2L /TRAIL y se tratan como se describe en la sección de métodos. (
3 medidos en mm) de los tumores se controlan y registran los tamaños. Una diferencia significativa en el volumen del tumor del control se representa por "*" (
P
& lt; 0,05), y una reducción significativa en comparación con el DHA o tumores de Apo2L /TRAIL tratados se denota por "**" (
P Hotel & lt; 0,01). (B) Los animales representativos y los tumores se muestran para cada grupo. (C) Los tumores de los ratones de control y de los ratones tratados con DHA, Apo2L /TRAIL, y DHA + Apo2L /TRAIL se homogeneizaron y se sometieron a análisis de transferencia Western para detectar la expresión de la caspasa-3 y caspasa-8. ß-actina sirvió como un control interno. (D) Análisis de PCNA marcador de proliferación por inmunohistoquímica y el estado apoptótico de las células tumorales in situ por ensayo de TUNEL. PCNA positivas (E) y las células TUNEL positivas (F) también se contaron bajo el microscopio para calcular el índice de proliferación y índice apoptótico, respectivamente. "*":
P Hotel & lt; 0,05, comparado con el control. "**":
P Hotel & lt; 0,01, en comparación con un solo agente
La proliferación celular PCNA marcador y apoptosis de las células se examinaron más
In situ
en el tumor. muestras de los cuatro grupos. Como se muestra en la figura 6D y E, DHA o grupos tratados con Apo2L /TRAIL había reducción de la expresión de PCNA en comparación con el grupo control (
P
& lt; 0,05). Mientras que los ratones tratados con la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL tenido expresión de PCNA que no sólo era más bajo que el de control (
P Hotel & lt; 0,01), pero también fue más bajo que cualquiera de los agentes solo tratado (
P Hotel & lt; 0,05). Mono-terapia, ya sea con DHA o Apo2L /TRAIL produjo significativamente mayor apoptosis de control (
P
& lt; 0,05), mientras que la terapia combinada produjo aún más la apoptosis no sólo que el control (
P & lt
; 0,01), sino también que los grupos tratados con agente único (
P
. & lt; 0,05, Figura 6D y F)
Discusión
En el presente estudio, mostramos que el DHA, un derivado semisintético de la artemisinina, puede mejorar el efecto apoptótico de Apo2L /TRAIL contra las células de cáncer de páncreas. DHA actúa sinérgicamente con Apo2L /TRAIL para inhibir la proliferación e inducir la apoptosis a través de la mediada por ROS regulación de DR5 en células BxPC-3 y PANC-1. Por otra parte, hemos demostrado que el DHA puede sensibilizar a las células de cáncer de páncreas para el tratamiento de Apo2L /TRAIL
in vivo
.
Soluble Apo2L /TRAIL, que está surgiendo como un agente anticancerígeno atractivo, ha sido evaluado en varios ensayos clínicos. Sin embargo, muchos informes indican que la mayoría de las líneas celulares de carcinoma de páncreas son resistentes a Apo2L /TRAIL [22] - [25]. resistencia de las células del cáncer de Apo2L /TRAIL es uno de los mayores obstáculos para la explotación adicional de esta terapia. Por lo tanto, se necesitan con urgencia agentes que pueden ya sea potenciar el efecto de Apo2L /TRAIL o superar la resistencia [26]. Los objetivos de este estudio fueron determinar si la combinación de DHA con Apo2L /TRAIL podría promover la actividad antitumoral sinérgico y de comprender el mecanismo exacto por el cual la terapia de combinación utilizando estos agentes provoca la muerte celular de cáncer de páncreas
in vitro
y
in vivo
.
a pesar de que muchas neoplasias muestran cierta resistencia a Apo2L /TRAIL en ensayos clínicos, un cuerpo creciente de datos demuestra que Apo2L /TRAIL puede matar selectivamente a las células cancerosas sin dañar las células normales, lo que podría aliviar muchos efectos secundarios de la quimioterapia convencional. En particular, muchos informes han demostrado que algunos extractos de plantas y agentes quimioterapéuticos pueden sensibilizar células de cáncer a Apo2L inducida por TRAIL muerte celular /[17], [26] - [29], lo que indica que la resistencia a Apo2L /TRAIL se puede superar con el uso de sensibilizadores eficaces. Recientemente, DHA se ha demostrado que producen fuertes efectos antitumorales, ya sea solos o en combinación con agentes quimioterapéuticos con toxicidad para el huésped mínima contra diversos tipos de carcinoma
e in vitro
in vivo
[8] - [ ,,,0],10], [30] - [32]. Mientras tanto, el efecto de DHA contra el cáncer de páncreas se ha confirmado en nuestros estudios anteriores [9], [30]. Sin embargo, se desconoce si el DHA y el Apo2L /TRAIL actúan de forma sinérgica contra el cáncer de páncreas. En el presente estudio, hemos encontrado que la combinación de DHA y Apo2L /TRAIL como resultado significativamente mayor inhibición del crecimiento de BxPC-3 y PANC-1 en las células
in vitro
que cuando cualquiera de estos agentes se usan solos. Nuestros resultados indican que el DHA puede mejorar sinérgicamente Apo2L /citotoxicidad mediada por TRAIL y sensibilizar a líneas celulares de cáncer de páncreas humano a Apo2L apoptosis /inducida por TRAIL.
Varios informes han demostrado que la generación de ROS está implicado en la mediada por TRAIL /Apo2L apoptosis [33], [34]. ROS también se acepta en general que se asocia con la tumorigénesis y metástasis, aunque esta correlación es a menudo compleja y contradictoria [35]. De hecho, la mayoría de los agentes antineoplásicos tienen mecanismos bien establecidos de acción que implican la generación de ROS [36]. En las células cancerosas, el estrés oxidativo inducido por fármacos superpone sobre el estrés oxidativo intrínseca, lo que resulta en una respuesta citotóxica mediada por ROS potente que preferencialmente destruye las células tumorales o inhibe su proliferación [37]. Un puente endoperoxido en la artemisinina reacciona con el hierro intracelular para generar radicales libres, que pueden dar lugar a daños macromolecular y la muerte celular [38], [39]. DHA, un derivado de la artemisinina, se ha demostrado que causa la muerte de líneas celulares que expresan el virus del papiloma humanos mediante la inducción de estrés oxidativo que conduce a la generación de ROS [8]. Un trabajo reciente ha demostrado también que las células del melanoma metastásico humanas cultivadas son sensibles a la apoptosis inducida por la exposición de DHA y la regulación del estrés oxidativo celular, la externalización de fosfatidilserina y la procaspasa-3 división [40]. En nuestro estudio, se encontró que los niveles de ROS intracelulares aumentado significativamente por el tratamiento DHA en presencia y ausencia de Apo2L /TRAIL, mientras que el tratamiento con Apo2L /TRAIL solo tuvo poco efecto sobre intracelular de ROS en células PANC-1 BxPC-3 y. También se encontró que la capacidad de DHA para mejorar Apo2L /apoptosis inducida por TRAIL podría ser atenuada por el pretratamiento con NAC. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan un nuevo mecanismo por el cual el DHA puede actuar sinérgicamente con Apo2L /TRAIL para ejercer sus efectos pro-apoptóticos combinados en el cáncer de páncreas, al menos en parte a través de la generación de ROS. En las células de cáncer de colon, la apoptosis inducida por Apo2L /TRAIL solo también está regulada por la generación de ROS [41]
Se conocen dos vías principales para iniciar la apoptosis celular:. La muerte, vía extrínseca receptor inducida y la intrínseca, vía mitocondrial [42], [43]. Hemos informado anteriormente de que el DHA podría desencadenar la vía mitocondrial para inducir la apoptosis mediante la regulación de la expresión de Bcl-2 y Bax, que conduce a la liberación de citocromo c de la mitocondria y la activación del iniciador de aguas abajo de la caspasa-9, lo que resulta en la activación del efector caspasas y la inducción de la apoptosis [44]. Sin embargo, varios estudios han puesto de manifiesto que la resistencia Apo2L /TRAIL en líneas celulares de cáncer implica la expresión de la proteína anti-apoptótica c-FLIP y la baja regulación de la pro-apoptóticos proteína caspasa-8 [20], [27], [45 ]. Algunos agentes quimioterapéuticos, incluyendo zerumbone [20] y garcinol [27], se puede regular hacia abajo de manera significativa la expresión de c-FLIP y /o regular por incremento la expresión de la caspasa-8 a través de ROS para aumentar la sensibilidad de las células a Apo2L /TRAIL . Se reconoce que la caspasa-8 es un objetivo corriente abajo directa de DR5, y DISC pro-caspasa-8 reclutas para activar la caspasa-8, lo que resulta en la activación de las caspasas efectoras aguas abajo [46]. En nuestro estudio, DHA hasta regula la caspasa-8 expresión de una manera dependiente de la dosis para iniciar la apoptosis celular. También mostramos que el DHA modula la expresión de DR5 de una manera dependiente de la dosis y que el aumento de la expresión de DR5 está vinculado a los cambios observados en el estrés oxidativo. Nuestros datos indican que ROS es uno de los reguladores aguas arriba responsables de la inducción mediada por DR5 de DHA y que el DHA puede potenciar Apo2L /apoptosis celular inducida por TRAIL a través de las vías de la muerte de los receptores extrínsecos. Estos resultados son consistentes con los reportados en un estudio anterior [20]. La diafonía entre estas dos vías es probablemente debido a la escisión de la oferta y su posterior translocación a la mitocondria donde se inicia la vía de la apoptosis intrínseca [28] caspasa-8 mediada. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que, además de las vías de apoptosis mitocondrial mediada por la generación de ROS DHA dependiente también juega un papel fundamental en el aumento sinérgico de Apo2L apoptosis /TRAIL inducida a través de las vías de la muerte de los receptores extrínsecas en células de cáncer pancreático .
a continuación, hemos utilizado con éxito el eliminador de ROS, NAC, para inhibir el estrés oxidativo. Los experimentos se repitieron tres veces.