Extracto
Antecedentes
La diosgenina, una saponina esteroide obtenido a partir de alholva (
Trigonella foenum graecum
), fue encontrado para ejercer propiedades anti-cancerígenos, tales como inhibición de la proliferación y la inducción de apoptosis en una variedad de células tumorales. Sin embargo, el efecto de diosgenina en la metástasis del cáncer sigue siendo poco clara. El objetivo del estudio es examinar el efecto de la diosgenina sobre la migración y la invasión de las células PC-3 de cáncer de próstata humano.
métodos y las conclusiones principales
La diosgenina inhibe la proliferación de las células PC-3 en de una manera dependiente de la dosis. Cuando se trata con dosis no tóxicas de diosgenina, la migración celular y la invasión fueron notablemente reprimida por vitro herida en la curación de ensayo y el ensayo Boyden cámara de invasión, respectivamente. Además, la diosgenina reduce las actividades de la metaloproteinasa de matriz 2 (MMP-2) y MMP-9 por el ensayo de zimografía de gelatina. El nivel de mRNA de MMP-2, -9, -7 e inductor de metaloproteinasa de la matriz extracelular (EMMPRIN) fueron también suprimió mientras que el inhibidor tisular de la metaloproteinasa-2 (TIMP-2) se incrementó en diosgenina. Además, la diosgenina suprimió la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), en células PC-3 y la formación de tubos de células endoteliales. Nuestros ensayos de inmunotransferencia indicaron que la diosgenina potentemente suprimió la fosforilación de phosphatidylinositide-3 quinasa (PI3K), Akt, señal extracelular regulación de quinasa (ERK) y c-Jun N-terminal quinasa (JNK). Además, la diosgenina redujo significativamente el nivel nuclear del factor nuclear kappa B (NF-
κ sobre B), lo que sugiere que la diosgenina inhibe la actividad de NF-kB.
Conclusión /Importancia
Los resultados sugieren que la diosgenina inhibe la migración y la invasión de las células PC-3 mediante la reducción de la expresión de MMPs. También inhibe ERK, JNK y PI3K /Akt vías de señalización, así como NF
κ B, la actividad
. Estos resultados revelan un nuevo potencial terapéutico para la diosgenina en la terapia anti-metastásico
Visto:. Chen PS, Shih YW, Huang HC, Cheng HW (2011) diosgenina, una saponina esteroideos, inhibe la migración y la invasión de cáncer de próstata humano Las células PC-3 mediante la reducción de metaloproteinasas de la matriz de expresión. PLoS ONE 6 (5): e20164. doi: 10.1371 /journal.pone.0020164
Editor: Robert E. Medios, Escuela de Medicina de la Universidad de Yale, Estados Unidos de América
Recibido: 1 de Febrero, 2011; Aceptado: 14 de abril de 2011; Publicado: 23 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la diosgenina es un esteroide de origen natural presente en una saponina. variedad de plantas, incluyendo la alholva (
Trigonella foenum graecum
) y las raíces de ñame silvestre (
Dioscorea villosa
) [1]. La diosgenina se ha utilizado en la medicina tradicional como un agente antihypercholesterolemia, antihypertriacylglycerolemia, antidiabético y antihyperglycemia [1], [2], [3], [4]. Varios informes han demostrado que la diosgenina inhibe la proliferación e induce la apoptosis en una amplia variedad de células tumorales de colon humano [5], osteosarcoma [6], leucemia [7], eritroleucemia [8], de mama [9], y el hígado [10] . El efecto anti-cáncer de diosgenina ha sido demostrado a través de la detención del ciclo celular [7], [11], la activación de p53 y la caspasa-3 [5], [7], [8], [12]. Además, la diosgenina inhibe la actividad de NF-kappa B y la expresión de genes regulados por el NF-kappa B y la proliferación reduciendo posteriormente, la invasión y la osteoclastogénesis [6], [13]. La diosgenina también suprime la ciclooxigenasa-2 [11] y de la lipoxigenasa [14], que están implicados en la carcinogénesis y objetivos como importantes para la quimioprevención del cáncer y la terapia. Por lo tanto, la diosgenina puede poseer la quimioterapia contra el cáncer potencial y su actividad consiste en múltiples dianas celulares y moleculares.
El cáncer de próstata es uno de los tumores más comúnmente diagnosticado en hombres y la segunda causa de mortalidad por cáncer en los Estados Unidos [ ,,,0],15]. Aunque el cáncer de próstata en estadio temprano puede ser tratado con cirugía y terapia de privación de andrógenos, con el tiempo progresa a más maligna, metástasis y el cáncer de próstata refractario a hormonas (CPRH), para los cuales no existe una terapia curativa [16], [17] . Por lo tanto, se necesita el desarrollo de terapias innovadoras para el tratamiento de cáncer de próstata. Debido avanzado de células de cáncer de próstata con el resultado potencial altamente invasiva en las altas tasas de morbilidad y mortalidad, la inhibición de la invasión y la metástasis podría ser un buen método para el tratamiento del CPRH.
la metástasis del cáncer es un proceso paso a paso muy coordinada que incluye desprendimiento de células del tumor primario, la proteolisis local de la matriz extracelular (ECM), la penetración a través de la membrana basal del capilar y los vasos linfáticos, intravasación, y luego invasión en nuevo tejido y el crecimiento [18], [19]. El proceso de la metástasis es promovido por expresar y secretar diversas enzimas proteolíticas que pueden degradar la mayoría de los componentes de la MEC. Las metaloproteinasas de matriz (MMP), una familia de endopeptidasas dependientes de Zn-, son las principales proteasas que participan en la migración de las células tumorales, la difusión, la invasión de tejidos y metástasis [20]. Entre las MMPs, MMP-2 y MMP-9 son enzimas clave para el colágeno de tipo IV degradante y contribuyen al proceso de metástasis [21], [22]. MMP-2 y MMP-9 son también capaces de escindir colágeno de tipo I [23], [24], el principal componente de formación de una estructura reticular en el estroma [25]. La activación de estas enzimas se han asociado con el aumento de la metástasis del tumor, lo que sugiere un papel funcional central para estas proteasas en el proceso metastásico [26]. La degradación proteolítica de microambiente del estroma juega un papel crítico en la promoción de la invasión. Para adquirir información detallada sobre la invasión de células de cáncer en el estroma, colágeno de tipo I se utiliza en el ensayo de cámara de Boyden invasión en el presente estudio.
Además, la degradación proteolítica de la ECM en la metástasis tumoral puede ser regulada por otras proteínas tales como inductor de metaloproteinasa de la matriz extracelular (EMMPRIN) y el inhibidor tisular de las metaloproteinasas (TIMPs). EMMPRIN es una glicoproteína multifuncional que puede modificar el microambiente del tumor mediante la activación de proteinasas, la inducción de factores angiogénicos en las células tumorales y estroma. EMMPRIN es capaz de regular las MMP y participar en los procesos de invasión y metástasis de las células de cáncer de próstata [27]. Las actividades de la mayoría de las MMP son regulados por TIMPs. El balance entre los niveles de MMP y TIMP es un determinante importante de la actividad proteolítica neta [28].
Proteína activada por mitógeno
quinasa (MAPK) ha sido conocido por participar en numerosas cascadas de señalización que desempeñan importantes funciones reguladoras en crecimiento celular, la apoptosis, la diferenciación, y la metástasis [29]. Los diversos miembros de MAPK se activan en respuesta a diversos estímulos extracelulares y tienen distintos objetivos de abajo, estimulando así la migración celular, la proteinasa-inducción, y la angiogénesis, eventos que son esenciales para la metástasis [30]. Extracelular señal de regulación quinasa (ERK1 /2) y c-Jun N-terminal quinasa (JNK), dos importantes MAP quinasas de mamíferos, han sido implicados en la migración celular y la proteinasa-inducción, eventos que son esenciales para la metástasis [30]. ERK1 /2 y JNK juegan un papel central en la regulación de la expresión de MMPs [20]. La inhibición de la vía MAPK podría tener el potencial para prevenir la angiogénesis, la proliferación, la invasión y la metástasis para una amplia gama de tumores [31], [32], [33]. La metástasis también está regulada por la PI3K /Akt vía de señalización, que está implicado en muchos procesos celulares, incluyendo la supervivencia celular, la adhesión celular y la metástasis [34], [35]. La inhibición de la MAPK y las vías PI3K /Akt puede tener el potencial de prevenir la proliferación de células de cáncer, invasión y metástasis [31], [33]. Además, PI3K /Akt y MAPK vías de señalización desempeñan un papel central en la regulación de la expresión de MMPs por factores de transcripción, incluyendo NF-kappa B [34], [36], [37]. NF-kappa B se mantiene en una forma inactiva en el citoplasma por proteínas inhibidoras llamados inhibidores de kappa B (I? B). En respuesta a una señal de activación, NF-kappa B es liberado de I? B? Y se transloca desde el citoplasma al núcleo, donde se une a cognado secuencias en la región promotora de un número de genes diana y posteriormente facilita la proliferación celular, la angiogénesis y la metástasis. Por lo tanto, el bloqueo de PI3K /Akt y MAPK vías, así como NF-kappa B proporcionan posibles objetivos para estrategias terapéuticas tumorales.
Aunque diosgenina está implicado como un nuevo agente quimiopreventivo basado en multidiana contra varias células de cáncer, el papel de la diosgenina contra la metástasis tumoral y la angiogénesis aún no está claro. El objetivo de este trabajo es examinar los efectos inhibidores y los mecanismos moleculares de la diosgenina sobre la metástasis. Dado que el cáncer de próstata PC-3 exposiciones de células humanas actividad altamente invasivo y metastásico y se ha utilizado para la investigación de los cambios bioquímicos en las células de cáncer de próstata avanzado y en la evaluación de su respuesta a los agentes quimioterapéuticos [38], las células PC-3 se utilizó para los presentes experimentos .
Materiales y Métodos
Reactivos y la célula Cultura y
La diosgenina, dimetilsulfóxido (DMSO), Tris-HCl, EDTA, SDS, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), Nonidet P -40, ácido desoxicólico y ortovanadato de sodio, se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). kit de ensayo de proteína se obtuvo de Bio-Rad Labs (Hercules, CA). medio de Eagle modificado de polvo Dulbecco (DMEM) se adquirió de Gibco /BRL (Gaithersburg, MD). kit de extracción de ARN total y el kit de PCR eran de Viogene (Sunnyvale, CA). Los anticuerpos contra ERK, JNK, Akt, NF-kB (p65), C23 y proteínas fosforiladas se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra PI3K y PI3K fosforilada se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). líneas celulares de cáncer de próstata humano PC-3 y se obtuvo de BCRC (Investigación de Industrias Agroalimentarias y Desarrollo del Instituto, Taiwán). Las células se mantuvieron en DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10%, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina, y se incubaron en un CO 5%
2 incubador humidificado a 37 ° C. de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), proporcionado amablemente por el Dr. Hua-Lin Wu [39], se aisló de las venas del cordón umbilical humano como se describe anteriormente [39], y se cultivaron en 0,1% platos recubiertos de gelatina y se mantuvo en medio M199 suplementado con 16% FBS, suplemento de crecimiento de células endoteliales y sulfato de heparina (Upstate Biotechnology). HUVECs entre pasajes 2 y 6 se utilizaron en todos los experimentos. Para el tratamiento de la diosgenina, la diosgenina se disolvió en etanol y se diluyó con medio de cultivo (la concentración final de etanol fue inferior a 0,2%).
viabilidad celular Ensayo
El ensayo se realizó como se describe anteriormente [ ,,,0],40]. Brevemente, las células se sembraron en una placa de 96 pocillos y se trataron con diosgenina por triplicado. Después de 24 y 48 horas de incubación, el medio se reemplazó con medio fresco que contiene 0,5 mg /ml de MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro]. Después de 4 horas, los sobrenadantes se retiraron y el formazan MTT resultante se solubilizaron en DMSO y se midió espectrofotométricamente a 570 nm.
Curación de Heridas migración Ensayo
El ensayo se realizó como se describió anteriormente [41] . PC-3 células se sembraron en una placa de 12 pocillos y se crecieron hasta confluencia. El cultivo en monocapa fue luego raspar-herido con una punta de micropipeta estéril para crear una zona desnuda (brecha) de anchura constante. Después de retirar los restos celulares con PBS, las células se expusieron a diversas concentraciones de diosgenina después de 24 hrs. PC-3 células migraron a la región heridos fueron observados por Olympus CK-2 microscopio invertido y se fotografiaron (100 aumentos). El área de la herida se midió mediante el programa Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/). El porcentaje de cierre de la herida se calculó mediante la siguiente ecuación: Cierre de la herida% = [1- (área de la herida en T
t /área de la herida en T
0) x 100%, donde T
t es el tiempo después de la herida y T
0 es el tiempo inmediatamente después de la herida.
Boyden cámara invasión ensayo
ensayo de invasión de cámara de Boyden se llevó a cabo como anteriormente [41]. En resumen, el filtro de policarbonato (8 micras de poro) fue pre-recubierto con colágeno de tipo I (10 mg /ml). Después se trató con diosgenina durante 24 horas, las células (1 × 10
4 células /pocillo) se añadieron a la cámara superior en medio libre de suero. El medio completo (que contiene 10% de FBS) se aplicó a la cámara inferior como quimioatrayente. La cámara se incubó durante 6 horas a 37 ° C. Al final de la incubación, las células en la superficie superior de la membrana se retiraron cuidadosamente con un hisopo de algodón y las células que invadieron a la superficie inferior de la membrana se fijaron con metanol y se tiñeron con solución Giemsa al 5%. Las células invadidas en la superficie inferior del filtro de membrana se puntuaron de cinco campos aleatorios bajo microscopía (200 aumentos).
Tubo Formación Determinación
El ensayo de formación de tubo se realizó como se describe. En pocas palabras, a 15 así μ-Slides (ibidi, Alemania) se recubrió con 10 l de Matrigel, que se dejó solidificar a 37 ° C. Para evaluar el efecto de la diosgenina, las células PC-3 fueron tratados con varias concentraciones de diosgenina durante 24 horas y el medio acondicionado se recogieron y se sometieron a ensayo de formación de tubo. Se sembraron HUVEC en el Matrigel y se cultivaron en medio condicionado de células PC-3 durante 6 horas. Las redes incluidas en tubos completos se contaron y se fotografiaron en un microscopio invertido. Las longitudes tubulares de las células se midieron usando el programa Image J.
Extracción de ARN y transcripción inversa PCR y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN total fue de extracción usando el kit de extracción de RNA total de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. El ARN total (1 g) de cada muestra fue sometido a transcripción inversa con cebadores oligo (dT) por kit de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cDNA sintetizado se usó para la amplificación por PCR con los siguientes cebadores [41]: MMP-9, 5'-gcacgacgtcttccagtacc-3 '(para), 5'-tcaactcactccgggaactc-3' (Rev); MMP-2, 5'-ggactatgaccgggataagaaatatg-3 '(para), 5'-gggcaccttctgaatttcca-3' (Rev); β-actina: 5'-TGTTACCAACTGGGACGACA-3 '(Para), 5'-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3' (Ap). Los ADNc se amplificaron durante 35 ciclos y cada condición de reacción de PCR fue como sigue: etapa de preparación a 94 ° C durante 5 min, paso de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, etapa de recocido a 56 ° C durante 30 segundos, y la etapa de polimerización a 72 ° C durante 30 seg. Los productos de PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. Las expresiones de ARNm de MMP-2, -9, -7, EMMPRIN y TIMP-1, -2 se determinaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real que se realiza en el sistema StepOne (Applied Biosystem, Foster City, CA, EE.UU.). Brevemente, cada mezcla de amplificación (50 l) contiene 10 ng de ADNc y 25 l SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 2 min, 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 45 s. Las secuencias de los cebadores para la β-actina, MMP-2, MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1, TIMP-2 y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se dedujeron de PrimerBank y enumerados en la Tabla 1. Los resultados de la PCR fueron deducirá a partir de la C
T método comparativo.
Análisis de MMP-2 y MMP-9 actividades de gelatina zymography
las actividades de MMP-2 y MMP-9 fueron se ensayó mediante zimografía de gelatina como se describe anteriormente [41]. Brevemente, las células subconfluentes PC-3 se incubaron con medio libre de suero con diversas concentraciones de diosgenina durante 24 hrs. El medio acondicionado se recogió y se concentró por centrifugación de ultra-filtración. La muestra (20 g) se mezcló con tampón de carga y se sometió a 10% de gel de SDS-poliacrilamida que contiene 0,1% de gelatina. La electroforesis se realizó a 100 V durante 3 horas a 4 ° C. a continuación, los geles se lavaron con tampón de lavado (2,5% de Triton X-100 en dd H
2O) a temperatura ambiente para eliminar SDS, seguido de incubación a 37 ° C en tampón de reacción (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM CaCl
2, 0,02% NaN
3). Después de 16 h, los geles se tiñeron con Comassie blue R-250 (0,125% Comassie blue R-250, 50% de metanol, 10% de ácido acético) durante 1 h y se destiñeron con solución decolorante (20% de metanol, ácido acético 10%, 70% ddH
2O) hasta que las bandas se visualizaron claros.
proteína nuclear Extracción
las proteínas nucleares se prepararon como se describe anteriormente [41]. Brevemente, las células se lavaron con hielo-frío PBS, se centrifugaron, y se resuspendieron en tampón hipotónico (HEPES 10 mM, pH 7,9, MgCl 1,5 mM
2, mM KCl 10, 0,05% NP-40, DTT 0,5 mM y 0,5 mM PMSF). Los núcleos se centrifugaron durante 10 min a 3000 rpm a 4 ° C. Después, el sedimento se resuspendió en tampón de extracto nuclear (HEPES 20 mM, pH 7,9, MgCl 1,5 mM
2, NaCl mM 420, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,5 mM y glicerol 25%) y se incubó durante 30 min sobre hielo. Después de otra centrifugación a 14.000 rpm durante 10 min, el sobrenadante que contiene la proteína nuclear se transfirió a un tubo de microcentrífuga de preenfriado. Los extractos se almacenaron a -80 ° C.
Western Blot
Después de ser tratado con diosgenina, PC-3 células se lavaron dos veces con PBS y se trataron con tampón de extracción (50 mM Tris-Cl , pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, 1% NP-40, y ácido desoxicólico 0,5%). Las extracciones de células se recogieron y se centrifugaron a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C, y los sobrenadantes se recogieron como lisados celulares. Los lisados celulares se sometieron a SDS-PAGE, y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, Bedford, MA). Las membranas se bloquearon con 5% (w /v) de leche no grasa en PBS que contenía 0,1% de Tween-20, y luego se transfirieron con anticuerpo primario. Posteriormente, las membranas se incubaron con un anticuerpo apropiado secundario (de rábano picante de cabra conjugado con peroxidasa anti-ratón o anti-IgG de conejo). Las proteínas inmuno-detectado después se revelaron por quimioluminiscencia mejorada.
Análisis estadístico
Los datos se expresaron como media ± desviación estándar. La significancia estadística se analizó por ANOVA de una vía. Si se observa la importancia, se utilizó la prueba post-hoc de Dunnett para determinar la diferencia entre los grupos de tratamiento y grupo no tratado, con valores de p
. & Lt; 0,05 considerado estadísticamente significativo
Resultados
efecto citotóxico de diosgenina en células PC-3
en primer lugar, dilucidado el efecto citotóxico de diosgenina en las células de cáncer de próstata PC-3 (Fig. 1). Hemos demostrado que trata de diosgenina a una concentración por debajo de 20 mM durante 24 o 48 horas no afectó a la viabilidad de las células PC-3 de manera significativa. La viabilidad de las células PC-3 se redujo significativamente por la diosgenina a 30 mM. Los datos indicaron que el tratamiento con diosgenina en dosis de no más de 20 M durante 24 y 48 horas no causaron citotoxicidad de células PC-3.
Las células se trataron con varias concentraciones de diosgenina para 24 h y 48 h . La viabilidad celular se presentan como media ± S. D. de cuatro experimentos independientes.
*** p
. & Lt; 0,001 en comparación con el control sin tratar
diosgenina inhibe la migración de células PC-3
Debido a una mayor concentración de diosgenina era tóxico , investigamos el efecto inhibidor de la diosgenina sobre la migración y la invasión de células PC-3 con dosis no tóxicas. Después de la incubación con diferentes concentraciones de diosgenina durante 24 horas, la diosgenina suprimió la migración de las células PC-3 a la zona desnuda de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2, A y B). Estos resultados revelaron que la diosgenina inhibe la motilidad de PC 3 células de manera significativa.
Las monocapas de células se rasparon por una punta de micropipeta estéril y las células se trataron con varias concentraciones de diosgenina para 24 h. Las células (A) migrado a la región heridos fueron fotografiados (100 aumentos). (B) El área de la herida de los cultivos celulares se cuantificaron en cuatro campos de cada tratamiento, y los datos se calcula a partir de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes.
p * Hotel & lt; 0,05,
** p
. & Lt; 0,01, comparado con el control sin tratar
diosgenina inhibe la invasión de en células PC-3
Para dilucidar el efecto inhibidor de la diosgenina sobre la invasión de PC 3-células a través de la matriz extracelular, se analizaron las células que invadieron a través del filtro de policarbonato recubierta con colágeno de tipo I en la cámara de Boyden. Los resultados mostraron que la diosgenina suprime la invasión de células PC-3 a través del filtro revestido con colágeno de tipo I de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento con diosgenina de 10 y 20 mM inhibió 22% y el 40% de la invasión de células, respectivamente (Fig. 3, A y B). Los resultados indicaron que la diosgenina invasión marcadamente inhibida de células PC-3.
Las células se trataron con varias concentraciones de diosgenina se realizó para 24 h y la invasión de células de ensayo. Se fotografiaron las células invadidas (A) (200 aumentos). (B) Las células PC-3 invadidas se contaron en cinco campos aleatorios en cada tratamiento, y los datos se calcula a partir de tres experimentos independientes. Los datos se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes.
p * Hotel & lt; 0,05,
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. & Lt; 0,01, comparado con el control sin tratar
La diosgenina inhibe la activación y expresión de MMP-2 y MMP-9 en células PC-3
Desde la activación de MMPs es crucial para la degradación de ECM, que se requiere para la invasión de células, se investigó el efecto de diosgenina en la activación de MMPs. Después de las células PC-3 fueron tratados con varias concentraciones de diosgenina durante 24 horas en medio libre de suero, se recogió el medio acondicionado, se concentró y se ensayó para la actividad de MMP por zimografía de gelatina. Los resultados mostraron que la MMP-9 y MMP-2 actividades se redujeron marcadamente por 20 M de diosgenina (Fig. 4A). Además, demostró que la diosgenina suprimió la expresión de MMP-9 y MMP-2 mRNA y de la proteína determinada por RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western, respectivamente (Fig. 4, B y C). Los resultados indicaron que ambas actividades enzimáticas y expresiones de MMP-9 y MMP-2 fueron inhibidos por la diosgenina
.
células (A) PC-3 fueron tratados con varias concentraciones de diosgenina para 24 h y las actividades de MMP -9 y MMP-2 se determinaron por zimografía de gelatina. Las expresiones de MMP-9 y MMP-2 mRNA (B) y la proteína (C) se analizaron por RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western, respectivamente. β-actina se utilizó como control interno. (D) Los niveles de MMP-2, -9, -7, EMMPRIN y TIMP-1, -2 mRNA se expresaron como media ± S. D. de tres experimentos independientes.
p * Hotel & lt; 0,05,
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. & Lt; 0,01, comparado con el control sin tratar
diosgenina inhibe la expresión del ARNm de la MMP-2, MMP -9, MMP-7 y un inductor de metaloproteinasa de la matriz extracelular (EMMPRIN), mientras que induce TIMP-2 expresión
con el fin de dilucidar el efecto de diosgenina en la expresión de genes implicados en la degradación de ECM, los niveles de mRNA de MMP-2 , MMP-9, MMP-7, EMMPRIN, TIMP-1 y TIMP-2 se analizaron por cuantitativa en tiempo real PCR. Los resultados demostraron que la diosgenina inhibe la expresión de mRNA de MMP-2, MMP-9, MMP-7 y EMMPRIN de una manera dependiente de la dosis. La diosgenina también elevó la expresión de TIMP-2, que se sabe que bloquea el potencial proteolítica de MMPs (Fig. 4D). Los resultados sugieren que la diosgenina podría afectar a la expresión de genes implicados en la activación proteolítica.
diosgenina inhibe PC-3 celular inducida de vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC) la formación del tubo
formación de tubos de células endoteliales es uno de los pasos cruciales en la angiogénesis asociada con la progresión del cáncer y la metástasis. Con el fin de examinar el efecto inhibitorio de la diosgenina sobre la angiogénesis inducida por PC-3 de células, se realizó en la formación de tubo HUVEC de vitro por medio condicionado de células PC-3. HUVEC cultivadas en Matrigel se trató con el medio acondicionado a partir de células PC-3 tratadas con diosgenina durante 24 horas, y se evaluaron la formación del tubo. Los resultados demostraron medio condicionado de células PC-3 inducida por la formación del tubo de HUVEC, y medios acondicionados de las células expuestas a la diosgenina la formación de tubos de HUVEC suprimido de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5, A y B). Los resultados sugieren que la diosgenina podría suprimir la angiogénesis inducida por PC-3 de células in vitro. Debido a que las células PC-3 inducen la angiogénesis a través expresando factores angiogénicos como el VEGF, evaluamos si la diosgenina inhibe la expresión de VEGF en las células PC-3. Los resultados demostraron que la expresión de ARNm de VEGF en células PC-3 se disminuyó notablemente por la diosgenina de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5C). Nuestros datos sugieren que la diosgenina de inhibición de células PC-3 de la angiogénesis mediante la supresión de la expresión del VEGF inducida.
HUVECs (A) se sembraron en Matrigel y se incubaron con medio condicionado de células PC-3 tratadas con diosgenina para 24 h. Después de 6 h, se fotografiaron las redes incluidas en tubos completos (100 aumentos). (B) Las longitudes tubulares de las células se midieron usando software Image J. (C) La expresión de mRNA de VEGF se determina y se presentan como media ± S. D. de tres experimentos independientes.
p * Hotel & lt; 0,05,
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. & Lt; 0,01, comparado con el control sin tratar
La diosgenina inhibe la fosforilación de PI3K, Akt, ERK y JNK
Varios estudios han indicado que las proteínas de señalización que incluyen PI3K, Akt y MAPK miembros están involucrados en la expresión de MMPs y la inducción de metástasis [30], [34], [35]. Se investigaron los efectos de la diosgenina sobre el estado fosforilado de PI3K, Akt, ERK1 /2, JNK1 /2 y p38 en las células PC-3. Los datos demostraron que la diosgenina reduce la fosforilación de PI3K y Akt de la dosis y dependiente del tiempo de forma (Fig. 6, A y B). Además, la diosgenina suprimió la fosforilación de ERK1 /2 y JNK1 /2 en una dosis y de manera dependiente del tiempo, mientras que no alteró la fosforilación de p38 (Fig. 7, A y B).
las células PC-3 fueron tratados con varias dosis de diosgenina durante 24 h (a), o 20 mM de diosgenina para 3, 6, 12, 18 y 24 h (B). La fosforilación de PI3K y Akt se determinó por SDS-PAGE y Western Blot. β-actina se utilizó como control de carga.
células PC-3 fueron tratados con varias dosis de diosgenina durante 24 h (A), o 20 mM de diosgenina para 3, 6, 12, 18 y 24 h (B). La fosforilación de ERK1 /2, JNK1 /2 y p38 se determinó por SDS-PAGE y Western Blot. β-actina se utilizó como control de carga.
Para investigar más a fondo si la inhibición de la invasión celular y la MMP-2/9 de expresión eran través de la inhibición de la ERK1 /2, JNK1 /2 señalización y PI3K caminos, células PC-3 fueron tratados con un inhibidor de PI3K (LY294002; 20 M), inhibidor de ERK (U0126; 20 M) y el inhibidor de JNK (SP600125; 20 M) durante 24 hrs. Los resultados mostraron que el tratamiento de LY294002, U0126 y SP600125 reduce la invasión de células y MMP-2/9 expresión significativamente (Fig. 8, A y B), lo que sugiere que la inhibición de la invasión celular y la MMP-2/9 expresión por diosgenina podría ocurrir en parte a través de la supresión de PI3K, ERK y JNK vías.
las células (a) se trataron con LY294002, U0126 y SP600125 de 24 h y la célula capacidades invasivas se realizaron mediante el ensayo de cámara de Boyden invasión. (B) La expresión de MMP-2, -9 ARNm se determinaron y expresaron como media ± S. D. de tres experimentos independientes.
p ** Hotel & lt; 0,01,
p *** Hotel & lt; 0,001, en comparación con el control sin tratar
Diosgenin regula a la baja el contenido nuclear de NF. kappa B en células PC-3
Para investigar el efecto inhibidor de la diosgenina sobre la actividad de NF-kappa B, la cantidad de I? B? en los extractos citosólicos y NF-kappa B en los extractos nucleares de células se midieron mediante transferencia Western. Los datos revelaron que las células PC-3 diosgenina tratados demostraron un aumento en el nivel de proteína citosólica de I? B? Y una disminución en el nivel de proteína nuclear de NF-kappa B (Fig. 9). Los resultados implicaron que la diosgenina la actividad de NF-kB, inhibió.
células PC-3 fueron tratados con varias dosis de diosgenina para 24 h. (A) El citosólica y extractos nucleares se prepararon y analizaron para la degradación de I? B? Y NF-kappa B translocación p65. β-actina y C23 se utilizaron como citosólicas y de control de carga de proteína nuclear, respectivamente. (B) los niveles determinados de I? B? Y NF-kB se cuantificaron por análisis densitométrico. Los resultados densitométricos se expresaron como media ± S. D. de tres experimentos independientes.
p * Hotel & lt; 0,05,
p ** Hotel & lt; 0,01,
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. & Lt; 0,001, en comparación con el control sin tratar
Discusión
La diosgenina se ha demostrado que poseen potencial anti-cancerígenos, tales como inhibición del crecimiento celular y la inducción de la apoptosis de diversas líneas celulares de cáncer [5], [6], [7], [8] , [9], [10]. En el presente estudio, hemos proporcionado evidencias de que la diosgenina fue capaz de inhibir la metástasis
in vitro
, tales como la migración y la invasión en células humanas de cáncer de próstata PC-3, lo que sugiere que la diosgenina posible que poseen potencial anti-metastásico.
Hemos demostrado que la proliferación diosgenina suprimido de las células PC-3 de manera significativa a la concentración de 30 mM. Cuando las células PC-3 fueron tratados con diosgenina a dosis no tóxicas (por debajo de 20 mM), la migración y la invasión se inhibieron. Estos resultados implicaban que los efectos inhibidores de diosgenina en la migración de células PC-3 y la invasión no eran debido a su efecto citotóxico.
metástasis del cáncer requiere la migración de células cancerosas. Durante la migración celular, la proteólisis pericelular de ECM es importante para protrusión celular. Se requiere que la degradación proteolítica de ECM mediada por proteasas extracelulares, tales como MMPs, por la migración de células de cáncer de próstata y la invasión. Entre ellos, MMP-2, MMP-9 y MMP-7 desempeñan un papel crítico en la progresión del cáncer de próstata. La expresión de MMP-2 y MMP-9 están asociados con la progresión del cáncer de próstata [42], [43]. La inhibición de la MMP-2 y MMP-9 expresión suprimir el potencial metastásico del cáncer de próstata [32], [44]. MMP-7 posee actividad proteolítica contra una variedad de sustratos de ECM, incluyendo colágenos, proteoglicanos, elastina, laminina, fibronectina y caseína. MMP-7 también es producida por varias células tumorales malignas incluyendo próstata, gástrico, de cabeza y cuello, pulmón, hepatocelular, y carcinomas colorrectales [45], [46]. La sobreexpresión de MMP-7 promueve la invasión de células de cáncer de próstata [47]. Además, EMMPRIN es capaz de regular MMPs y participar en los procesos de invasión y metástasis de células de cáncer de próstata [27]. La inhibición de la expresión EMMPRIN reduce la invasión de células tumorales en células de cáncer de próstata humano [48]. TIMPs, el regulador de las MMP, también están involucrados en la progresión tumoral, invasión, metástasis y angiogénesis [49], [50]. En el presente estudio, hemos demostrado que la diosgenina inhibe la migración y la invasión de células PC-3.