Extracto
análisis funcional orientada a la enfermedad de factores epigenéticos y sus mecanismos de regulación en el silenciamiento aberrante es un requisito previo para un mejor diagnóstico y terapia. Sin embargo, los mecanismos precisos aún no están claros y complejo, que implica la interacción de varios efectores incluyendo el posicionamiento de nucleosomas, la metilación del ADN, histonas variantes y modificaciones de las histonas. Hemos investigado la complejidad silenciamiento epigenético en el gen supresor de tumores
CADM1
en cáncer de pulmón líneas de células progenitoras de ratón, exhibiendo hipermetilación promotor asociado con la represión transcripcional, pero sobre todo que no responde a los tratamientos con medicamentos de desmetilación. Después de predecir las posiciones de los nucleosomas y sitios de unión del factor de transcripción a lo largo del
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promotor, que lleva a cabo el mapeo de una sola molécula de ADN metiltransferasa
M.Sss
I, que revela en promotores silenciosas alta ocupación nucleosoma y oclusión de sitios de unión de factores de transcripción. Por otra parte,
M.Sss
mapas I de promotores variar dentro y entre las diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón. análisis de la cromatina con nucleasa micrococcal también indica las variaciones en el posicionamiento de nucleosomas tener implicaciones en la unión de factores de transcripción cerca de las fronteras de nucleosomas. inmunoprecipitación de la cromatina mostró que las variantes de histonas (H2A.Z y H3.3), y marcas de modificación de histonas (H3K4Me3 y H3K27me3) colocalizó todo en las mismas posiciones de nucleosomas que es una reminiscencia de la plasticidad epigenéticos en las células madre embrionarias opuestas. En total, la complejidad epigenéticos silenciamiento en la región promotora de
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no sólo se define por la hipermetilación del ADN, pero nucleosoma ocupación alta, alterado el posicionamiento de nucleosomas, y '' bivalentes modificaciones de las histonas, también es probable que contribuyó en la represión transcripcional de este gen en las células de cáncer de pulmón. Nuestros resultados ayudarán a definir las estrategias de intervención terapéutica utilizando fármacos epigenéticos en el cáncer de pulmón
Visto:. Reamon-Buettner SM, Borlak J (2012) La disección de silenciamiento epigenético Complejidad en el supresor del cáncer de pulmón de ratón de genes
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. PLoS ONE 7 (6): e38531. doi: 10.1371 /journal.pone.0038531
Editor: Javier S. Castresana, Universidad de Navarra, España |
Recibido: septiembre 22, 2011; Aceptado: May 7, 2012; Publicado: 6 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Reamon-Buettner, Borlak. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Cultura, Baja Sajonia, Alemania 25A 5-7251-99 /00. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte, pero los mecanismos moleculares de la enfermedad son en gran parte desconocidos. Muchos estudios muestran ahora que las alteraciones genéticas y epigenéticas como culpables [1]. eventos epigenéticos son cambios heredables en la expresión génica sin alteraciones en la secuencia de ADN primaria. Son importantes en el desarrollo normal y la diferenciación, pero el plomo cuando mal dirigida a las enfermedades, especialmente el cáncer [2]. No obstante, muchos de los procesos que resultan en el silenciamiento de genes se puede revertir con fármacos epigenéticos, que ofrece una esperanza para el tratamiento y la terapia [3]. El paisaje epigenético de silenciamiento es, sin embargo, complejo que implica la interacción de los principales efectores incluyendo el posicionamiento de nucleosomas, la metilación del ADN, histonas variantes, modificaciones de las histonas y los ARN no codificantes [4]. Cómo estos efectores interactúan entre sí para afectar la expresión del gen y causar la enfermedad sigue siendo poco clara.
El DNA se empaqueta en una estructura de nucleoproteína complejo en el núcleo de una célula llamada cromatina, y la unidad de repetición básica de la cromatina es conocida como nucleosoma, la estructura y función de los cuales todavía están siendo dilucidado [5]. Cada nucleosoma se compone de un núcleo de histona octameric (dos copias de cada uno de H2A, H2B, H3, y H4), alrededor de los cuales aproximadamente 147 pb de ADN se envuelven en 1,65 vueltas superhelical. el posicionamiento de nucleosomas juega un papel crucial en la cromatina superior plegado orden y en la regulación de genes [6] - [8]. Los nucleosomas pueden afectar a la transcripción mediante la modulación de la accesibilidad del ADN a las proteínas reguladoras y maquinaria transcripcional, dando lugar a la activación de genes o represión. el posicionamiento de nucleosomas puede, a su vez, se ve afectada por varios factores, incluyendo la secuencia de ADN preferencias, la metilación del ADN, histonas variantes y modificaciones postraduccionales de las histonas [6]. Por otra parte, el posicionamiento de nucleosomas difiere de ocupación nucleosoma, que no tiene en cuenta nucleosoma comienza a condición de que un par de bases dada está dentro de un nucleosoma [7].
Modificación por metilación del ADN se produce por la adición covalente de un grupo metilo a la posición 5 del anillo de citosina, la creación de 5-metilcitosina. metilación del ADN es un conocido mecanismo de silenciamiento epigenético y se asocia en diversos procesos biológicos y enfermedades (opiniones, [4], [9]). Tet (RTE las once de translocación), las proteínas pueden convertir 5-metilcitosina (5mC) en 5-hidroximetilcitosina (5hmC) [10], [11], y recientemente también en 5-formylcytosine (5FC) y 5-carboxylcytosine (5caC) [12] . la metilación del ADN puede inhibir la expresión génica mediante la prevención de activadores de la transcripción de unión a la diana de ADN o por reclutamiento de proteínas metil-CpG-dominio de unión (MBD), que a su vez reclutan modificadoras de histonas y complejos de remodelación de la cromatina a los sitios metilados [4]. CpG metilación también puede contribuir a la represión de genes mediante la inducción de una conformación de nucleosomas más compacto y rígido [13].
La maquinaria de metilación del ADN de mamíferos está mediada por las metiltransferasas de ADN (DNMTs), que establecen y mantener la metilación del ADN patrones. Se requiere DNMT1 en los patrones de metilación del ADN que mantienen, mientras que
de novo methyltransferases
DNMT3A y DNMT3B dirigirse a nuevos sitios no metilados de ADN (para una revisión, [14]). Nucleosomas pueden influir en la metilación del ADN, pero los estudios hasta el momento muestran resultados contrastantes. De cualquier metiltransferasas de ADN preferentemente se dirigen a nucleosoma unida a ADN [15], o nucleosomas hacen que la protección contra la metilación [16]. Por otra parte, los nucleosomas que contienen ADN metilado se estabilizan ADN de novo methyltransferases 3A /3B (DNMT3A /3B) que permite poca DNMT3A libre /3B que existe en el núcleo [17]. La estabilización de DNMT3A /3B en nucleosomas en las regiones metiladas promueve una mayor propagación de la metilación del ADN y por lo tanto asegura la herencia epigenética fieles. CpG metilación también puede tener una influencia distinta de la proteína de unión cuando está presente en un fondo nucleosomal [18].
histonas del nucleosoma se pueden intercambiar con las histonas variantes, y su incorporación pueden influir en el posicionamiento de nucleosomas, y por lo tanto la actividad del gen (revisado en [19]). La síntesis de las histonas canónicas está acoplada a la replicación del ADN en la fase S, mientras que las variantes de histonas se sintetizan durante todo el ciclo celular. Además, en contraste con las histonas canónicas cuya función es principalmente en el empaquetado del genoma y la regulación de genes, las histonas no canónicos tienen papeles cruciales en una serie de procesos, incluyendo la segregación de cromosomas, la regulación transcripcional, y la reparación del ADN. Entre estas variantes de histonas es la variante H2A.Z H2A, que está altamente conservado durante la evolución eucariota [20], [21]. variante de la histona H2A.Z difiere significativamente de H2A por varios aminoácidos y preferentemente se localiza en los promotores de genes en células de mamífero, en el que se extiende sobre varios nucleosomas aguas arriba y aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción [22]. Otra variante de la histona bien conservado es H3.3, una variante que difiere de H3 canónica por pocas sustituciones de aminoácidos, y se encontró que ser enriquecido por todo el cuerpo de genes de los genes transcritos, regiones promotoras de genes activos e inactivos, y en los elementos reguladores. Esta variante también se acumula en los loci en silencio en la cromatina pericentric y telómeros [23]
.
Además de la sustitución de las variantes de las histonas, los residuos de aminoácidos en las colas N-terminales de las histonas (canónica, así como variantes), se pueden modificar por diversas modificaciones posteriores a la traducción covalentes (PTMs) y formar la base para la regulación epigenética de la estructura de la cromatina y la función de genes [24]. Más importante aún, no hay interferencia entre las modificaciones de histonas con otros reguladores epigenéticos para reforzar o funciones de modificaciones revertir. Tales PTM, que incluyen entre otros la acetilación, metilación, fosforilación, juegan un papel directo en que afecta a la estructura de la cromatina, o pueden representar marcas o señales para ser reconocidos por los lectores de modificaciones de las histonas, para especificar una cromatina suelto o compacto [25]. Interrupciones de las modificaciones de las histonas en los procesos normales de regulación se han encontrado en las enfermedades, incluyendo el desarrollo y progresión del cáncer [26].
CADM1 gratis (molécula de adhesión celular 1) es un gen supresor de tumores no identificado en cáncer de pulmón de células se forman pequeñas (NSCLC), pero también implicado en otras enfermedades de cáncer humano [27], [28]. Hemos demostrado previamente que
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fue reprimida en líneas de células progenitoras del cáncer de pulmón de ratón, y la expresión de genes altamente correlacionado con la hipermetilación del promotor [29]. Pero después del tratamiento con el agente de desmetilación 5-aza-2-desoxicitidina (5-aza-dC), la mayoría de las líneas celulares no eran sensibles lo que sugiere la participación de eventos silenciamiento epigenético adicionales. Este estudio tuvo como objetivo comprender paisajes epigenéticos que conducen a la represión transcripcional de
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en las mismas células progenitoras de cáncer de pulmón de ratón, y, finalmente, para obtener conocimientos sobre mecánica en el silenciamiento epigenético de genes supresores de tumores, en general, y la respuesta a fármacos epigenéticos. El uso de herramientas bioinformáticas, que predijo posiciones de los nucleosomas y factor de transcripción sitios a lo largo del
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promotor de unión. Se realizó un mapeo de una sola molécula de la cromatina rigurosa con el ADN metiltransferasa,
M.Sss
I para determinar la ocupación nucleosoma y la oclusión de sitios de unión de factores de transcripción. Con un panel de cebadores para interrogar el medio, así como las fronteras izquierda y derecha de nucleosomas predichos, se analizaron para el posicionamiento nucleosoma diferencial en la cromatina digerido con MNase y ADN chiped con la histona H2A canónica, histona variantes H2A.Z y H3.3, así como para las modificaciones de histonas, H3K4me3 y H3K27me3. En total, las células de cáncer de pulmón muestran varios eventos silenciamiento epigenético que ayudarán a definir estrategias de intervención terapéutica.
Resultados
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la hipermetilación del promotor se correlaciona con la represión transcripcional
Esto y estudio anterior [29], se encontró que
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promotor CpG hipermetilación correlacionada con la represión transcripcional en líneas celulares de cáncer de pulmón establecida a partir de células individuales, transformados espontáneamente pulmonares de tumores de
c-Myc
y
c-Raf
doble ratones transgénicos. Metilación de CpG en los clones individuales fue heterogénea dentro y entre las 10 líneas celulares de cáncer de pulmón diferentes. Ese estudio anterior también demostró que la metilación de CpG en los sitios de factores de transcripción Sp1, Sp3, y ZF5 abrogó de unión a ADN-proteína de unión central. Por otra parte, el tratamiento con el agente de desmetilación, 5-aza-2-desoxicitidina (5-aza-DC) restaurada
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la expresión de genes, pero hasta ahora sólo en dos líneas celulares, lo que sugiere eventos silenciamiento epigenético adicionales. De hecho, la comparación de la metilación del ADN en los no tratados y en la línea celular de cáncer de pulmón tratados con aza A2C12 con la correspondiente re-expresión de
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mostró que la mayoría de los 69 analizados CpG en la región promotora todavía se metilado en el aza-tratada A2C12. Por lo tanto, el tratamiento con 5-aza-DC por sí sola no era capaz de restablecer la expresión de genes en todas las líneas celulares de cáncer de pulmón o demethylate la región promotora del
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y estas observaciones nos llevaron a sospechar de capas adicionales de silenciamiento epigenético en su lugar. Además, investigó el
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promotor y de ese modo a hacerse una idea de la magnitud de la complejidad silenciamiento epigenético en las diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón.
Las predicciones posicionamiento de nucleosomas y anotaciones a lo largo del
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región promotora
para determinar si la metilación CpG podría influir nucleosoma ocupación que lleva a silenciamiento epigenético, como se indica anteriormente [30], que utiliza herramientas bioinformáticas para predecir las posiciones de los nucleosomas, y para realizar anotaciones en el
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región promotora. El uso de una predicción basada en el posicionamiento de nucleosomas secuencia de ADN genómico (Segal, ver Materiales y Métodos), localizamos al menos cinco posiciones posibles de nucleosomas aproximadamente 1000 pb hacia el sitio de inicio de transcripción (TSS) y el sitio de inicio de la traducción (ATG). El RefSeq TSS (NM_001025600.1) se encuentra en -21 de ATG. Los nucleosomas predichos se designan arbitrariamente con respecto al ATG, como nuc 1 (-1011 a -865), nuc 2 (-697 a -551), nuc 3 (-417 a -271), nuc 4 (-230 a -84 ) y nuc 5 (-41 a 106). Los sitios de unión de factores de transcripción específicos de secuencia predichos se encuentran en las fronteras o dentro de estos nucleosomas, y muy concentradas en los nucleosomas más adyacentes a la TSS (Figura 1A). Muchos CpG se encuentran dentro de los nucleosomas, especialmente aquellos dentro de la isla CpG en la región promotora de
CADM1 gratis (Figura 1B). La región de 1000 pb está cubierto por cinco fragmentos de tamaños desde 124 hasta 349 pb se utilizó para analizar la metilación CpG en el ADN genómico tratado con bisulfito, en particular en relación con el ADN a base de metiltransferasa de la cromatina de una sola molécula (MAP-IT) ensayo (Figura 1C , el cuadro S1). Durante el estudio, otros algoritmos de posicionamiento de nucleosomas se hicieron disponibles (por ejemplo NuPOP, ICM, véase Materiales y Métodos) y la comparación mostraron superposición en las predicciones entre los tres métodos utilizados (Figura 1D). No obstante, la posición de tres nucleosomas (designado nuc 1, 3, 4) parecía ser más o menos constante.
(A) Posición de cinco analizaron nucleosomas (rectángulos azules) y sitios de unión de factores de transcripción. Los nucleosomas están numerados arbitrariamente a partir de la más lejana (por ejemplo nuc 1) hacia el sitio de RefSeq transcripción de inicio (TSS) y el sitio de inicio de la traducción ATG, que están ambas situadas en nucleosoma 5 (nuc 5). numeración de nucleótidos con 1 corresponde a una de la ATG. (B) pronosticó nucleosomas y la ubicación de las GPC (rayas verticales) y la isla CpG lo largo de la
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promotor. (C) Cinco fragmentos que cubren los CpG analizadas en el ADN genómico tratado con bisulfito y predijeron nucleosomas. (D) Las posibles posiciones de los nucleosomas tres algoritmos diferentes.
sola molécula de cromatina Cartografía de
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región promotora con
M.SssI
revela Alta Ocupación en Nucleosoma las células del cáncer de pulmón
a continuación llevó a cabo un mapeo de la cromatina de una sola molécula de la
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región promotora. Hemos utilizado una estrategia que permite el mapeo footprinting estructura de la cromatina en las islas CpG no metiladas por tratamiento de núcleos aislados con metiltransferasas de ADN, en particular la metiltransferasa de ADN específica de CpG (
M.Sss
I), seguida de la secuenciación de bisulfito genómico de la progenie individuo moléculas de ADN [31], [32]. Este procedimiento se denomina como basada en la metilación del promotor solo análisis (M-SPA), también se describe como protocolo de metiltransferasa accesibilidad para plantillas individuales (MAP-IT) [33]. En esencia, los CpG metilados serán por
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I, una metiltransferasa bacteriana citosina C5, a menos que las GPC son bloqueados por nucleosomas o proteínas de unión al ADN. Para este efecto, la localización de nucleosomas se define como una región de aproximadamente 147 pb que es inaccesible a
M.Sss
I.
Los CpG dentro de la
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región promotora en pulmonar normal son esencialmente no metilado y el gen se expresa. Se han tratado la cromatina de pulmón normal con
M.Sss
I y analizado los CpG no metilados (protegidas) a lo largo de la región promotora del
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, especialmente dentro de los nucleosomas predichos o sitios de unión del factor de transcripción. Se utilizó cebadores que amplifican bisulfito cinco fragmentos, tres de los cuales se superponen, y cubren 69 CpG desde -944 a +41, con respecto al sitio de inicio de la traducción, ATG (véase la Figura 1C, el cuadro S1).
M.Sss
Me tratamiento de ADN genómico "desnudo" sirvió como control. Utilizando el patrón de metilación del ADN en el ADN genómico "desnudo" y pulmonar normal como referencia, se analizaron la cromatina de tumor de pulmón, cáncer de pulmón de células líneas, y una línea celular de cáncer de pulmón tratados con 5-aza-DC con el gen ligera re-expresión. Para hacerse una idea de los diferentes instantáneas del
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promotor, se compararon los patrones de metilación de ADN de independiente
M.Sss
me tratamientos de mismas líneas celulares.
eficiencia de metilación de M .SssI lo largo de la región promotora CADM1 en los controles de ADN genómico "desnudas".
la metilación de la eficiencia
M.Sss
yo estaba determinado por primera vez en el ADN del ratón "desnudo" genómico. La eficiencia de metilación en un promedio de 21 clones para cada fragmento osciló entre 51-91% (Figura S1). Se obtuvo la eficiencia más alta de los dos fragmentos más cercanos de todo el TSS, es decir MFRA y TSFR1 al 91%. CpG no metilados en estos fragmentos eran más o menos al azar. Esta eficiencia metilación diferencial podría ser una indicación de que la región promotora en el entorno de TSS fue más sensible a la metilación del ADN. En nuestro análisis anterior, el índice de metilación en TSFR1 fragmento que incluye el SAT dio la correlación más clara a la represión transcripcional. metilación total en cinco fragmentos, 106 clones y 1.478 CpG fue del 76%. Usando el mismo protocolo, también se determinó la eficiencia de metilación de ADN "desnudo" genómico aislado de una línea celular de cáncer de pulmón (A2Cl2) que ya contenía antes de metilación CpG. metilación total en cinco fragmentos, 31 y 416 clones CpG fue del 98%, lo que indica la robustez del ensayo.
M.SssI mapa de la cromatina pulmonar normal.
Se analizó el mapa en M.SssI cromatina aislada de nueve pulmones normal mezclado. Para BFR fragmento (255 pb, 6 CpG -944 a -837), la mayoría de los clones mostró un tramo de CpG no metilados (Figura S1), especialmente aquellos que están situados dentro de un nucleosoma predicho (nuc 1) (Figura S2). Para fragmento 1FR (279 pb, 10 CpG, -682 a -531), varios clones mostraron también un tramo de CpG no metilados, muchos caen dentro de un nucleosoma predicho (nuc 2) (Figura S3). Estos resultados son indicativos de ocupación nucleosoma
.
En los próximos tres fragmentos superpuestos de todo el TSS (MFR1, MFRA, TSFR1) y en la región donde el factor varios transcripción sitios de unión se pudo encontrar (véase la Figura 1A), la patrones en la mayoría de los clones indican ausencia de ocupación nucleosoma, sino más bien sugestiva de unión de factores de transcripción u otras proteínas necesarias para la regulación. Fragmento MFR1 (124 pb, 14 CpG, -456 a -341) es amplificada por los cebadores específicos de metilación (con tres GPC en ambos cebadores directo e inverso). Este fragmento contiene predijo sitios de unión para factores de transcripción, por ejemplo PPARg, ER, ETF, en el que los CpG dentro de estos sitios de unión fueron en su mayoría no metilado en varios clones, para sugerir su unión y un posible papel en la regulación transcripcional de
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. El sitio ETF predicho está dentro de un nucleosoma (nuc 3), mientras que el PPARg está en la frontera de nuc 3, y podría estar influenciada fácilmente por alteraciones relativas a la ocupación nucleosoma y correderas (Figura S4).
Fragmento MFRA (222 pb, 27 CpG, -396 a -180) también es amplificado por los cebadores específicos de metilación (con 5 GPC en primer adelante, 6 GPC en primer inversa). Este fragmento abarca un nucleosoma predicha (nuc 3), y en parte la de otro (nuc 4) (Figura S5). Contiene dos sitios de unión para Sp1 que se encuentra dentro o en la orilla izquierda del nuc 4. Los CpG en los sitios de unión Sp1 en -224 y -211 fueron ocupados en muchos clones que tienen el patrón sin nucleosoma. Este resultado apoya, además, que el SP1 de hecho puede jugar un papel en la regulación de
CADM1
. Había 2 de 15 clones, sin embargo, que mostró una larga extensión de la protección CpG dentro de un nucleosoma predicho (nuc 3), lo que indica la formación de nucleosomas en esta parte del promotor de
CADM1
.
fragmento TSFR1 (345 pb, 37 CpG, -302 41) es amplificada por los cebadores que contienen tres GPC sobre el cebador directo, y dos GPC en el cebador inverso (Figura 2). Nuestros resultados anteriores mostraron que el índice de metilación obtiene a partir de este fragmento se correlacionó altamente con la represión transcripcional en comparación con los otros fragmentos analizados en el
CADM1
región promotora. Contiene sitios de unión para Sp1, ZF5, y otros factores de transcripción predichos. También se incluye el sitio de inicio de transcripción RefSeq (TSS), el sitio de inicio de la traducción, ATG, así como al menos dos predijo nucleosomas (nuc nuc 4 y 5). No hubo largo tramo de CpG no metilados, a excepción de 3 de 15 clones en los que la mayor parte de las GPC protegidas caer dentro de un nucleosoma predicho (nuc 4). En aquellos clones sin ocupación aparente de nuc 4, un nucleosoma predicha (nuc 5) en el que el TSS RefSeq, así como los sitios de ATG se encuentran, parecían no estar presente, así, consistente de una cromatina abierta que está asociado con la transcripción. Por otra parte, el -224 CpG en el sitio de unión de SP1 y el -192 CpG en ZF5, eran con frecuencia no metilado, para apoyar su unión en la región promotora de
CADM1.
(A) Los patrones de metilación en los clones después del tratamiento con ADN metiltransferasa específica de CpG (
M.Sss
I) y la puntuación de 32 CpG (-271 a +24 CpG, fragmento TSFR1) en el ADN genómico "desnudo" ratón-cola, y la cromatina de nueve pulmones normales agrupados, tres agruparon los tumores de pulmón sólidos, y siete líneas celulares de cáncer de pulmón diferentes con poca o ninguna
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la expresión génica. Los patrones se obtuvieron con BISMA en cajas azules que representan los CpG no metilados (= protegido) mientras que las cajas rojas, CpG metilados. En los tumores de pulmón y líneas de células de cáncer de pulmón, CpG metilación podría ser endógeno y /o de la
M.Sss
I tratamiento. (B) Anotación de analizados
CADM1
región promotora (GPC, supuestos sitios de unión de factores de transcripción específicos de pulmón, predijeron nucleosomas), y los patrones de metilación del ADN de secuencia de contexto correspondientes que se muestran en (A). Un tramo de CpG protegidas, especialmente dentro del nucleosoma predicho 4 era frecuente en muchos de los 84 clones obtenidos en líneas celulares de cáncer de pulmón.
Para resumir, el
M.Sss
metilación I mapa observado en clones de pulmón normal sugiere la formación de los predichos cinco nucleosomas a lo largo de la región promotora de
CADM1
. Los patrones que se encuentran en los tres fragmentos (MFR1, MFRA, y TSFR1) en torno a la SAT, en el que tres nucleosomas (nuc 3, 4 nuc, y Nuc 5) están situadas, mostró la ausencia de ocupación nucleosoma en muchos clones. Sin embargo, los sitios de unión de factores de transcripción como SP1 y ZF5 mostraron protección, lo que sugiere su papel en la regulación transcripcional de
CADM1
. Por el contrario, para los dos nucleosomas más lejos de la TSS (NUC1 y nuc 2), no se observa ningún remodelación nucleosoma parecía tener lugar como la mayoría de los clones sólo se exhiben largos tramos de CpG no metilados.
mapa de la cromatina M.SssI tumor de pulmón.
analizó el
M.Sss
I mapa de la cromatina aislada de tres agruparon los tumores de pulmón sólidas de c
RAF
ratones transgénicos.
CADM1
era todavía expresaron en estos tumores (no mostrada). Debido a la metilación de CpG endógeno en los tumores de pulmón, sólo los resultados de los CpG no metilados (es decir, protegidas) después de
M.Sss
tratamiento que se interpretaron. No obstante, los patrones en clones sugirieron la formación de al menos tres nucleosomas (NUC1, Nuc 2, nuc 3) (Figuras S1, S2, S3, S5). En fragmento TSFR1, donde nuc nuc 4 y 5 residen, no había ningún tramo largo de los CpG no metilados a lo largo del fragmento para indicar nucleosoma ocupación, pero 18 sitios CpG mostró protección (Figura 2). De hecho, 13 de 19 clones mostraron el mismo patrón. Entre las características de estos patrón común incluir casi no metilación en dos sitios de unión Sp1 (-224, -164 GPC), así como la de ZF5 (-192, -190, -188 CpG). El tratamiento de la cromatina derivado de la muestra de tumor de pulmón no mostró la presencia de ocupación nucleosomal en clones analizados en fragmento TSFR1. Sin embargo, este resultado se basa en los tumores de pulmón combinados que todavía expresan en algún grado
CADM1
. Además, tumor de pulmón se compone de muchos tipos de células incluyendo las no cancerosas que podrían haber contribuido a los resultados mostrados en la Figura 2. No obstante, a nivel de las líneas de células tumorales individuales, marcadas diferencias en el posicionamiento nucleosomal se observaron como se discute a continuación.
M.SssI mapas de cromatina de diferentes líneas celulares de cáncer de pulmón.
Nos lleva a cabo
M.Sss
asignación de E en las líneas celulares de cáncer de pulmón 10 con diversos grados de
CADM1
hipermetilación del promotor y la represión de la transcripción, así como una línea celular de cáncer de pulmón tratado con 5-aza-dC. Al igual que en tumor de pulmón, debido a la metilación de CpG endógeno en las líneas celulares de cáncer de pulmón, sólo los patrones de CpG no metilados (es decir, protegida) después de
se consideraron M.Sss
Me tratamiento. Se analizaron los mapas de líneas celulares individuales (Figura S6, S7), así como colectivamente. Como se mencionó anteriormente, también se analizaron los patrones de ADN genómico 'desnuda' a partir de una línea celular de cáncer de pulmón (A2C12), que fue metilado endógena (véase la Figura S1C). Por otra parte, para confirmar los resultados y determinar los patrones de diferentes instantáneas del
CADM1
promotor, que han llevado a cabo dos ensayos de tratamiento en algunas líneas celulares (Figura S6). A continuación, describimos el
M.Sss
Me mapas encontrados en las líneas celulares de cáncer de pulmón con poca o ninguna
CADM1
la expresión génica.
Para fragmento de BFR, un tramo colectiva de se observaron al menos tres CpG no metilados en muchos clones. Estos tres sitios en -944, -924, -903 CpG, se encuentran dentro de nuc 1 y por lo tanto, lo que sugiere la ocupación de este nucleosoma (Figura S2). Por fragmento 1FR, aunque no eran clones que mostraban un tramo de al menos tres CpG no metilados para sugerir ocupación nucleosoma (nuc 2), la mayoría de los clones eran CpG altamente metilados y la fuente de esta metilación podrían ser tanto endógenas y debido a
M .sss
I tratamiento (Figura S3)
.
para fragmento MFR1, la mayor parte de los 98 clones eran altamente metilada, a excepción de los dos CpG en -423 y -408. Estos dos son los CpG dentro de la secuencia de unión de factores de transcripción predicho (PPARg, ER), y se encuentran en la frontera de nuc 3 (figura S4). La protección de estos dos sitios CpG podría ser a la vez de la unión de la transcripción y de deslizamiento nucleosoma. EMSA resultados sugirieron que se unen PPARg
in vitro
a la
CADM1
promotor con extractos nucleares de la línea celular de cáncer de pulmón (A2C12), pero no en pulmón normal (Figura S8), y podría jugar un papel en el cáncer de pulmón.
para fragmento MFRA, había cinco clones entre 86 clones con casi ninguna metilación sugerir nucleosoma ocupación (nuc 3) (Figura S5). También hubo sitios CpG que exhibieron baja metilación, especialmente los sitios de unión Sp1 en -224 y -211, que se encuentra en la frontera de un nucleosoma (nuc 4) (Figura S5). Por lo tanto, la protección de las líneas celulares de cáncer de pulmón a -224 y -211 podría ser debido tanto a la unión Sp1 y la ocupación nucleosoma.
Para fragmento TSFR1, la mayor parte de los 84 clones muestran largos tramos de CpG no metilados que sugiera nucleosoma ocupación alta (nuc nuc 4 y 5) en torno a la SAT (Figura 2). Un parche de protección era evidente en los sitios CpG -224 a -188; otro parche estaba en -174--90. Los sitios de unión para Sp1 y ZF5 están dentro de una parcela de CpG no metilados que indican la oclusión debido a la ocupación nucleosoma. Para apoyar esta hipótesis de un nucleosoma ocupación, se encontró el mismo tramo de no metilación después de tratar la cromatina de una línea celular de cáncer de pulmón (GA7) con
M.Cvi
PI (GPC metilasa), y en el que la metilación de sitios CpG (= endógena de metilación CpG) fue marcado (datos no mostrados).
línea de pulmón de células cancerosas (A2C12) después del tratamiento con 5-aza-dC.
La línea celular A2C12 responde al tratamiento con 5-aza-dC que resulta en
CADM1
reexpresión. Sin embargo, el grado de re-expresión varía de tratamiento al tratamiento. Hemos analizado la
M.Sss
I mapa de A2C12-aza-tratado-5 dC, que exhibió una ligera
CADM1
gen re-expresión y la comparación con los no tratados con A2C12 y pulmonar normal (Figura 3 ). Para fragmento de BFR, ahora algunos clones mostraron tramo de CpG no metilados, y este resultado sugiere nucleosoma ocupación (nuc 1). Para fragmento 1FR, tres clones también mostraron tramos de CpG no metilados para indicar la ocupación nucleosoma (nuc 2).
(A) Localización de los cinco fragmentos analizados en el
CADM1
región promotora que cubren 69 CpG -944 a 41, con relación al sitio de inicio de la traducción, ATG. CpG están representadas por rayas. (B-D) mapas de metilación de pulmón normal y A2C12; cajas azules representan los CpG no metilados (= protegido) mientras que las cajas rojas, CpG metilados. Los fragmentos se presentan con respecto a su ubicación es decir, de BFR a TSFR1. Los CpG en la secuencia de núcleo de sitios de unión Sp1 y ZF5 se indican mediante flechas. (D) Después del tratamiento y el gen ligera re-expresión de 5-aza-DC, algunos clones se asemejan a los patrones que se encuentran en pulmón normal (por ejemplo, en TFSR1, cerrado), para sugerir remodelación nucleosoma (desalojo) en la expresión génica.
En los próximos tres fragmentos hacia el TSS (MFR1, MFRA, TSFR1), algunos clones muestran patrones similares a los de pulmón normal, es indicativo de patrones asociados con nucleosomas desalojadas y activa la transcripción. Por fragmento MFR1, seis clones parecían a los patrones de no nucleosoma de ocupación y factores de transcripción de unión como se ve en pulmón normal. Para fragmento MFRA, sólo había cuatro patrones observados: 7/21 completa ausencia de metilación; 12/21 con el mismo patrón y los clones que parecía estar en proceso de ser remodelado o nucleosoma siendo desalojado; y 2/21 en el medio. Los dos sitios SP1 estaban ocupados en todos los clones. Por lo tanto, SP1 es obligatorio en aquellos clones con nucleosomas desalojadas, un hallazgo que concuerda bien con nuestros resultados anteriores [29] EMSA. Para fragmento TSFR1, varios clones parecían a patrón encontrado en pulmón normal que indica ausencia de nucleosoma, pero el factor de transcripción vinculante. Este resultado sugiere remodelación de la cromatina después de 5-aza-DC tratamiento.
Resultados generales M.SssI mapeo.
Para resumir,
M.Sss
I mapeo en soportes pulmonares normales la formación de al menos cinco nucleosomas en las posiciones previstas a lo largo de la región promotora del
CADM1.
Hay eran clones para mostrar largos tramos de CpG no metilados en estas posiciones, especialmente en los dos nucleosomas (nuc nuc 1, 2)