colorrectal
Extracto
infiltración de macrófagos alta se ha correlacionado con la mejora de la supervivencia en el cáncer colorrectal (CCR). Tumor macrófagos asociados (TAMs) juegan un papel en la tumorigénesis complejos, ya que se cree que tienen actividades tanto tumor prevención (macrófagos M1) y la promoción de tumor (macrófagos M2). Aquí hemos aplicado un enfoque inmunohistoquímica para determinar el grado de infiltración de macrófagos con un fenotipo M1 o M2 en muestras clínicas de CRC en relación con el pronóstico, tanto en CRC en general, sino también en los subgrupos de CRC definidos por la inestabilidad de microsatélites (MSI) de estado de detección y el fenotipo isla CpG methylator (CIMP). Un total de 485 muestras de CRC consecutivos se tiñeron para la óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) (también denominado iNOS) como un marcador para el fenotipo de macrófagos M1 y el receptor scavenger CD163 como un marcador para el fenotipo de los macrófagos M2. La infiltración media de NOS2 y CD163 macrófagos que expresan a lo largo de la parte delantera del tumor invasivo fue evaluada usando una escala graduada de cuatro semi-cuantitativamente. Dos subtipos de macrófagos, mostrando M1 (NOS2
+) o M2 (CD163
+) fenotipos, fueron reconocidos. Se ha observado una correlación significativa entre la cantidad de NOS2
+ y CD163
+ células (
P Hotel & lt; 0,0001). Una fuerte correlación inversa con el estadio del tumor fue encontrado tanto para NOS2 (
P Hotel & lt; 0,0001) y CD163 (
P Hotel & lt; 0,0001) la infiltración. Además, los pacientes que albergan tumores altamente infiltrados por NOS2
+ células tenían un pronóstico significativamente mejor que los infiltrados por pocas células NOS2
+, y esto resultó ser independiente del estado de la detección de MSI y el estado CIMP. No se encontraron diferencias significativas en la supervivencia específica del cáncer en grupos de CRC con diferentes proporciones de NOS2 /CD163. En conclusión, un aumento de la infiltración de los macrófagos con un fenotipo M1 en la parte delantera tumor es acompañada por un aumento concomitante en los macrófagos con un fenotipo M2, y en una forma dependiente de la etapa correlacionado con un mejor pronóstico en pacientes con CRC.
Visto: Edin S, Wikberg ML, Dahlin AM, Rutegård J, Öberg Å, Oldenborg PA, et al. (2012) La distribución de los macrófagos con un fenotipo M1 o M2 en relación con el pronóstico y las características moleculares del cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (10): e47045. doi: 10.1371 /journal.pone.0047045
Editor: José Najbauer, Ciudad del Centro Médico Nacional de la Esperanza y el Instituto de Investigación Beckman, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Junio, 2012; Aceptado: 7 Septiembre 2012; Publicado: 15 Octubre 2012
Copyright: © Edin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Sociedad sueca del cáncer (concesión no CAN 2011/839, Palmqvist;. www.cancerfonden.se), Consejo Sueco de Investigación (subvención no B03488901, Palmqvist;. www.vr.se), la investigación de vanguardia de Grant del Consejo del Condado de Västerbotten, Suecia (concesión no VLL-132981, Palmqvist.), Fundación para la Investigación del cáncer en el norte de Suecia (concesión no AMP 09-619, Edin;. www.cancerforskningsfonden.se), y Tore Nilsons Fundación (Edin, www.torenilsonsstiftelse.nu). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células inflamatorias están presentes en el microambiente tumoral de la mayoría de tipos de cáncer y se ha informado de afectar el medio de mediadores inflamatorios y las señales de proliferación celular, la angiogénesis y la remodelación de tejidos en formas que podrían promover la progresión tumoral [1] - [3 ]. macrófagos asociados a tumores (TAM) y su papel en la invasión tumoral y la metástasis se han discutido en varias revisiones recientes [4] - [8]. En general, los TAM se encuentran dentro y alrededor de la mayoría de los tumores y pueden, cuando se activa, liberar numerosos factores que podrían influir en el comportamiento de las células tumorales y otras células del estroma tumoral. La capacidad de los macrófagos para adaptarse a su medio ambiente ha dado lugar a la identificación de los dos principales fenotipos polarizadas de los macrófagos [7], [9]. En resumen, los macrófagos M1 activados clásicamente se caracterizan por la expresión de óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) (también denominado iNOS), así como muchas citoquinas pro-inflamatorias (por ejemplo IL1β, IL6, IL12, IL23 y TNF) y se presentan tener un alto bactericida y capacidad tumoricida. Las principales funciones de los macrófagos activados alternativamente M2 son en lugar de compactar los desechos y promover la reparación del tejido, sino que también tienen funciones de regulación inmune. Muchos de los factores producidos por los macrófagos M2 actuar en favor de la progresión del tumor, estimulando el crecimiento del tumor, (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF1) y factor de crecimiento transformante beta 1 (TGFß1), la angiogénesis (por ejemplo endotelial vascular factor de crecimiento A (VEGFA)) y remodelación de la matriz (por ejemplo, FGF1, de fibrina y matriz metalopeptidasas (MMPs)). Además, los macrófagos M2 también producen factores de regulación inmune (por ejemplo IL10 y TGFß1) que amortiguan la respuesta inmune.
TAM se encuentran a menudo para tener un fenotipo M2 y se han asociado con una disminución de la supervivencia en pacientes con por ejemplo el melanoma [10], [11], de mama [12], [13], el riñón [14] y el cáncer de vejiga [15] ., [16] sin embargo, esto no es cierto para todos los cánceres Nosotros y otros han demostrado previamente que un aumento de la densidad de los macrófagos en el CCR se correlaciona con un mejor pronóstico [17] -.. [20] también estómago pacientes con cáncer han sido reportados para tener un mejor pronóstico con un elevado número de TAM [21], [22] Los resultados en la próstata [23], [24], de pulmón [25] -. [29] y el cáncer de endometrio [30] - [32] son Sin embargo en conflicto. Cada vez es más evidente que los macrófagos pueden desempeñar diferentes roles en la tumorigénesis dependiente de tejido y el tipo de cáncer. Es interesante especular que las diferentes funciones desempeñadas por los macrófagos en varios tipos de cáncer podrían implicar variaciones en el equilibrio entre M1 y M2 fenotipos (la prevención de tumores frente a la promoción de tumores), impulsados por factores en el microambiente tumoral de cánceres individuales. También podría haber variaciones dentro de ciertos tipos de cáncer.
CRC han sido tipificados en función de su estado de microsatélites (MSI) y el fenotipo isla CpG methylator (CIMP). Aproximadamente el 15% de los CRCs se definen como de microsatélites inestable (MSI), un fenotipo causado por defectos en la reparación del mal emparejamiento del DNA, la cual está en contraste con microsatélites estables (MSS) CRC [33]. En CRCs esporádicos, MSI ha sido altamente asociada con CIMP [34]. CIMP se puede clasificar como CIMP-alta o CIMP-bajo de acuerdo con el estado hypermetylation de las islas CpG en un conjunto de genes que no están metilados en el tejido colorrectal normal o en tumores CIMP-negativas [35] - [38].
en el presente estudio, la distribución de los diferentes subtipos de macrófagos fue calificar con certitud en 485 muestras clínicas de CRC, utilizando el óxido nítrico sintasa 2 (NOS2) como un marcador para el fenotipo de macrófagos M1 y el receptor scavenger CD163 como un marcador para la M2 fenotipo macrófago. La infiltración de NOS2
+ y CD163
+ células se relacionó con las variables clínico-patológicas y moleculares, así como el pronóstico, tanto en la cohorte completa CDN y en subgrupos de CRC definidas por el estado de detección de MSI y el estado CIMP. Podríamos concluir que la infiltración de macrófagos M1 en el CCR es acompañado por la infiltración de macrófagos M2 y correlacionada con la mejora de la supervivencia de una manera dependiente etapa de CRC, y que esto es independiente del estado de la detección de MSI y el estado CIMP.
Materiales y métodos
Declaración de Ética
el manejo de las muestras de tejido y datos de los pacientes en el presente estudio fue aprobado por el comité de ética de investigación en el hospital de la Universidad de Umea (regional de Ética Junta de Revisión en Umeå, Suecia), que incluye el procedimiento mediante el cual los pacientes verbalmente dieron su consentimiento informado. Este consentimiento se documentó en cada historia clínica del paciente, y considerado por el Comité de Ética de ser suficiente. Las muestras de tejido fueron registrados como un número de caso y el año en una base de datos utilizada para el análisis, sin nombres o número de identificación personal que se indican.
Población de estudio
Las muestras clínicas de pacientes de cáncer colorrectal en el Estudio de Umeå (Crums) [39], resecado quirúrgicamente de CCR fueron recogidos entre 1995 y 2003 en el Departamento de Cirugía, hospital de la Universidad de Umea, Umea, Suecia. De todos los pacientes, la parafina de tejido fijado con formalina se tomaron muestras y las variables patológicas se caracteriza por un patólogo mediante la revisión de las secciones de tinción rutinaria. Los datos clínicos, incluyendo los datos de supervivencia, se obtuvieron por un cirujano mediante la revisión de los registros de los pacientes. Un total de 485 pacientes (300 cánceres de colon, cáncer de recto, 180 y 5 subsitio no especificado dentro del colon y recto) se incluyeron en el estudio. Con 28 pacientes que carecen de información sobre cualquiera NOS2 o expresión de CD163, 474 especímenes para NOS2 y 468 especímenes para CD163 estaban disponibles para el análisis. La quimioterapia adyuvante se administró a 68 (14,0%) pacientes. La radioterapia preoperatoria se administró a 108 (60,0%) pacientes con cáncer rectal de los cuales 83 recibieron 5 × 5 Gy, y 25 recibieron 25 × 2 Gy. Para los análisis de supervivencia, 37 pacientes fueron excluidos debido a los datos de seguimiento incompletos o debido a la muerte por complicaciones perioperatorias. Para la supervivencia analiza los resultados con respecto a la relación de NOS2 /CD163, un total de 422 pacientes estaban disponibles.
La inmunohistoquímica y immunoflourescense
Las muestras fueron fijadas en formol al 4% y embebidos en parafina, de acuerdo con los procedimientos de rutina en el Departamento de Patología clínica, hospital de la Universidad de Umea, Suecia Umeå. Una de las secciones de 4 micras de cada paciente se cortó, se seca, encerado-DE y rehidratada. Las láminas fueron sometidos a la recuperación de antígenos mediada por calor utilizando la solución de la diva (Biocare médica, Concord, CA) en una olla a presión Decloaker ™. Para los procedimientos de inmunohistoquímica, se utilizó una máquina de tinción semiautomática (Ventana ES, Ventana Inc., Tucson, AZ). anticuerpo monoclonal anti-CD163 (Novacastra) se utilizó a una dilución de 1:100, y se utilizó anti-NOS2 anticuerpo policlonal (Abcam) a una dilución de 1:50. Las diapositivas se counterstained con hematoxilina.
Para la evaluación, las diapositivas fueron examinadas bajo microscopio de luz. La tinción inmunohistoquímica se evaluó como la zona más representativa en el frente invasivo y evaluó como no /débil (puntuación 1), moderada (puntuación 2), fuerte /robusta (puntuación 3) y la infiltración masiva (puntuación 4) de acuerdo con Forssell et al. [18]. Las muestras se evaluaron dos veces por el mismo observador, y los casos discordantes fueron revisados tercera vez, seguido por una sentencia concluyente. Para immunoflourescense, se utilizó anticuerpo monoclonal anti-CD163, anti-NOS2 anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo anti-CD68 policlonal de conejo (GeneTex Inc) a una dilución de 1:50, y se utilizó anti-CD68 anticuerpo monoclonal de ratón (Dako) a una dilución de 1:400. Por bloque, las secciones de tejido se trataron con PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y 0.4% de Triton X-100 durante 20 minutos, seguido de lavado en tampón de lavado (PBS; 0,2% Triton X-100; 0,2% albúmina de suero bovino). A continuación, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo primario (en PBS; 0,1% Triton X-100) durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual se lavaron en tampón de lavado. Los portaobjetos se incubaron adicionalmente con DAPI a una dilución de 1:1000 y secundario anti-IgG de conejo Alexa®488 y anticuerpos IgG Alexa®555 anti-conejo (Invitrogen) diluido 1:400 (en PBS; 0,1% Triton X-100) durante 1 hora. Después de lavados adicionales, los portaobjetos se montaron en Vectashield medio (Vector Laboratories) de montaje y vistos usando un microscopio confocal Nikon D-Eclipse C1 con aceite de inmersión y un 40 × objetivo.
MSI estado de detección y el estado CIMP
estado de la detección de MSI se determinó por inmunohistoquímica, como se describe anteriormente [39]. Un estado positivo de cribado MSI (MSI) se asigna a las muestras de tejido con células tumorales que carecen de tinción nuclear para una o más de las proteínas MLH1, MSH2, MSH6, o PMS2, esta en contraste con un estado de selección negativa (MSS), donde tumor positivo los núcleos se presente expresar los cuatro marcadores. CIMP estado se determina de acuerdo con la hipermetilación de un panel de ocho genes (
CDKN2A
,
MLH1
,
CACNA1G
,
Neurog1
,
RUNX3
,
SOCS1
,
IGF2
,
y CRABP1
) por el método MethyLight (cuantitativa en tiempo real PCR) con secuencias de cebadores y sondas descritos anteriormente [39] , [40]. El siguiente número de genes hypermethylated define CIMP-negativos tumores, genes 0; CIMP-bajo tumores, 1-5 genes; y CIMP tumores de alto, 6-8 genes.
Los análisis estadísticos
Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS Statistics 18 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.). Las tabulaciones cruzadas se analizaron con la prueba y relaciones lineales exacta de Fischer con la prueba de asociación lineal por lineal exacta. Se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para estimar la supervivencia específica del cáncer, y las comparaciones entre grupos se realizaron con la prueba de log-rank. supervivencia cáncer específica se definió como la muerte con conocidos diseminada o enfermedad recurrente. Los análisis de supervivencia multivariante se realizaron mediante el uso de modelos de riesgos proporcionales de Cox.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Expresión de marcadores de macrófagos M1 y M2
NOS2 fue seleccionado como marcador de macrófagos con un fenotipo M1 y CD163 como marcador de los macrófagos con un fenotipo M2. Para validar si NOS2 y CD163 eran marcadores, capaz de separar entre poblaciones distintas de macrófagos, las muestras de 10 pacientes con CRC se seleccionaron al azar y la distribución de NOS2 y CD163 se analizó por tinción doble immunoflourescent seguido por microscopía confocal. NOS2 y CD163 se encontró que se expresa principalmente por diferentes poblaciones de macrófagos (Figura 1A). Un pequeño exceso de vuelta sin embargo pudo ser identificado, el cual está en consonancia con la naturaleza plástica de los macrófagos. Los macrófagos que expresan altamente uno de los marcadores, sin embargo, consistentemente no expresaron el segundo marcador. Esto verifica NOS2 y CD163 como marcadores que pueden ser utilizados para distinguir entre diferentes subpoblaciones de macrófagos que presentan principalmente fenotipos M1 o M2, respectivamente. Por otra parte, la expresión de NOS2 y CD163 se encuentra en las células que expresan también el marcador macrófago CD68 (Figura 1B y C).
Confocal imágenes de tinciones immunoflourescent en el CCR de (A) NOS2 (rojo) y CD163 (verde) , (B) CD68 (rojo) y CD163 (verde) y (C) NOS2 (rojo) y CD68 (verde). Los núcleos se revelaron mediante tinción con DAPI (azul), y la superposición se recoge flourescense por todos los canales.
La expresión de NOS2 y CD163 se evaluó semi-cuantitativamente en muestras de 485 pacientes con CCR mediante inmunohistoquímica según un anterioridad documentado escala de cuatro graduada [18]. tinciones representativas de la infiltración de NOS2
+ macrófagos
+ o CD163 se muestran I Figura 2. Aproximadamente el 70% de todos los tumores muestra una modesta a la infiltración masiva de NOS2
+ y CD163
+ células (puntuación 2 -4), mientras que el restante mostró débil o ninguna infiltración (puntuación 1). La mayoría de la expresión de NOS2 y CD163 se encuentra en las células situadas en el estroma del tumor, con la densidad más alta a lo largo de la parte delantera tumor invasivo.
representativos imágenes microscópicas de luz de tinciones inmunohistoquímicas de NOS2 y CD163 en las secciones consecutivas del mismo CRC muestra de tumor.
La relación entre NOS2
+ y CD163
+ macrófagos
Las frecuencias de la infiltración de NOS2
+ macrófagos
+ y CD163 en la parte delantera del tumor se presentan en la tabla 1. los macrófagos infiltrantes que expresan CD163 NOS2 o están altamente correlacionados positivamente (
P Hotel & lt; 0,0001). Las cantidades de CD163
+ células en la parte delantera del tumor, sin embargo, eran con frecuencia más alta que la de NOS2
+ células.
Asociación entre la infiltración de NOS2
+ y CD163
+ macrófagos y parámetros clínico y molecular
Las puntuaciones de la infiltración de NOS2
+ y CD163
+ macrófagos en las muestras de CRC se correlacionaron con las variables clinicopatológicas diferentes (Tabla 2). Al incluir todos los tumores, sin relación de NOS2
+ o CD163
+ infiltración de macrófagos se encontró con el género, la edad, el grado, el patrón de crecimiento, la quimioterapia adyuvante o radioterapia preoperatoria. Una tendencia lineal débil se encontró para el aumento de la infiltración de NOS2
+ macrófagos del cecal al recto (
P = 0,043
). Aunque no se encontró una asociación significativa de la expresión de NOS2 con el tipo de tumor, se encontró una asociación significativa con el tipo de tumor para la expresión de CD163 (
P
= 0,005), con CD163 se infiltró en los tumores con mayor frecuencia que tiene una histología no mucinoso. Una fuerte asociación inversa con el estadio del tumor fue encontrado tanto para NOS2
+ (
P Hotel & lt; 0,0001) y CD163
+ (
P Hotel & lt; 0,0001). Infiltración de macrófagos
al relacionar la infiltración de NOS2
+ o CD163
+ macrófagos en los parámetros moleculares (Tabla 3), hay una correlación de NOS2
+ o CD163
+ infiltración de macrófagos se encontró que era ya sea el estado de detección de MSI o el estado CIMP. Al combinar el estado de detección de MSI con el estado CIMP sin embargo, CD163 se encontró
+ infiltración de macrófagos a ser significativamente menor en los tumores CIMP-altos en comparación con los tumores CIMP-negativos o CIMP-bajo entre el grupo de los tumores del SMS (
P
= 0,042).
importancia pronóstica de la infiltración de NOS2
+ y CD163
+
Para evaluar el impacto pronóstico de la infiltración de macrófagos, que comparó el cáncer en general la supervivencia en pacientes con específicos de diferentes puntuaciones de la infiltración de NOS2
+ macrófagos
+ o CD163. La Figura 3 muestra gráficos de Kaplan-Meier de la supervivencia específica del cáncer en pacientes Crums con diferentes niveles de la infiltración de NOS2
+ macrófagos
+ y CD163. Un aumento de la infiltración de NOS2
+ macrófagos en la parte delantera del tumor fue muy significativamente asociada con un mejor pronóstico (Log-rank
P = 0,0003
) (Figura 3A). Una asociación similar se observó también para CD163
+ macrófagos (Log-rank
P Hotel & lt; 0,0001) (Figura 3D). En CRC potencialmente resección curativa (es decir, con exclusión de los pacientes con metástasis a distancia o la cirugía no radical) la importancia de la asociación entre la NOS2
+ se perdió la infiltración de macrófagos y el pronóstico (Log-rank
P = 0,132
). Sin embargo, en este grupo la importancia de NOS2
+ infiltración de macrófagos y el pronóstico fue restaurado al separar los casos de cáncer de colon de los cánceres de recto, Log-rank
P = 0,008
de colon en comparación con el log-rank
P
= 0.881 en el recto (figura 3B y C). Para el análisis correspondiente de CD163
+ infiltración de macrófagos en los CRC resección curativa se encontró una tendencia similar (Log-rank
P = 0,034
en todos los CRC; Log-rank
P = 0,059
en el colon;. Log-rank
P = 0,236
en el recto) (Figura 3E y F)
casos de CCR se anotó para la NOS2 (a-C) y CD163 (D-F) la expresión , la puntuación de 1-4. Se muestran los gráficos de Kaplan-Meier de la supervivencia específica del cáncer en (A y D) todos los CRC, (B y E) cánceres de colon potencialmente resección curativa, y (C y F) cánceres de recto potencialmente resección curativa. log-rank pruebas se utilizaron para calcular
P
valores.
Debido a la fuerte correlación entre el estadio del tumor y la expresión de NOS2 y CD163 se realizó modelos de riesgo proporcional de Cox multivariado incluyendo la las variables de género, edad, localización, estadio tumoral y un marcador de macrófagos, respectivamente. Los cocientes de riesgos instantáneos (CRI) tanto para la NOS2 (HR 0,67, IC del 95%: 0,40 a 1,12,
P
= 0,12) y CD163 (HR 0,66, IC del 95%: 0,42 a 1,06,
P =
0,087) indicaron un efecto protector, pero no alcanzó significación estadística, haciendo hincapié en la dependencia etapa.
también se analizó el posible efecto de las variaciones en la relación de NOS2 /CD163 en la supervivencia del paciente. No se observaron diferencias significativas en la supervivencia específica del cáncer en el CCR en relación con la proporción NOS2 /CD163, ni en todos los casos de CCR (Figura 4A) ni en el grupo seleccionado de los cánceres de colon potencialmente resección curativa (Figura 4B). Por otra parte, la relación de NOS2 /CD163 no se asoció significativamente con la supervivencia en el análisis multivariante (datos no mostrados).
La supervivencia cáncer-específica de los casos de CCR anotó para la relación de NOS2 /CD163. Se muestran los gráficos de Kaplan-Meier de la proporción NOS2 /CD163 en (a) todos los CRC, o (B) cánceres de colon potencialmente resección curativa. log-rank pruebas se utilizaron para calcular
valores de p.
pronóstico importancia de la infiltración de NOS2
+ macrófagos
+ y CD163 acuerdo con el estado de detección de MSI y el estado CIMP
a fin de analizar el valor pronóstico de la infiltración de macrófagos, se comparó la supervivencia específica del cáncer en general dentro de los diferentes subgrupos de CRC definidas por el estado de detección de MSI y el estado CIMP.
MSI casos de CCR se encuentran a tienen un pronóstico ligeramente mejor en comparación con los casos del SMS [33]. se encontró la infiltración de macrófagos a ser un factor pronóstico en los subgrupos de los dos casos del SMS (Figura 5B y E) MSI (Figura 5A y D) y. El valor pronóstico de la NOS2
+ infiltración de macrófagos no alcanzó significación en los casos de MSI (log-rank
P = 0,256
), pero lo hizo en el caso del SMS (log-rank
P
= 0,002). CD163
+ infiltración de macrófagos era importante para el pronóstico tanto en MSI (Log-rank
P
= 0,009) y el SMS casos (
P = 0,003
log-rank). Al combinar el estado de detección de MSI con baja (puntuación 1-2) o alto (puntuación 3-4) infiltración de NOS2
+ o CD163
+ macrófagos, se encontraron efectos significativos en el pronóstico tanto para NOS2
+ ( log-rank
P
= 0,005) y CD163
+ (log-rank
P = 0,0004
) la infiltración de macrófagos (Figura 5 C y F). El pronóstico más favorable se ha encontrado en los casos de MSI altamente infiltrados por los macrófagos, en particular, por NOS2
+ macrófagos. casos del SMS con una baja infiltración de macrófagos muestran el peor pronóstico (Figura 5C y F). No se encontraron diferencias significativas en el pronóstico entre los casos de MSI y SMS dentro de los subgrupos de baja o alta infiltración de NOS2
+ macrófagos
+ o CD163.
Los subgrupos de CRC se organizan de acuerdo a la condición de detección y MSI anotó para NOS2 (a-C) y CD163 (D-F) la expresión, la puntuación de 1-4. Se muestran los gráficos de Kaplan-Meier de la supervivencia específica del cáncer en (A y D) MSI casos, (B y E) casos del SMS, y (C y F) de estado de detección de MSI combinado y NOS2 o CD163, puntuación de 1-2 o 3- 4, respectivamente. log-rank pruebas se utilizaron para calcular
P
valores.
infiltración de macrófagos ha demostrado ser de importancia pronóstica en todos los subgrupos CIMP (Figura 6A-C y E-G). NOS2
+ infiltración de macrófagos mostró un efecto significativo sobre la supervivencia específica del cáncer en los casos CIMP-bajo (
P = 0,011
). Los macrófagos que expresan CD163 mostraron efectos significativos en el pronóstico en CIMP-neg (Log-rank
P
= 0,006) y los casos CIMP-alta (
P = 0,022
Log-rank). Al combinar el estado de detección CIMP con baja (puntuación 1-2) o alto (puntuación 3-4) la infiltración de macrófagos que expresan CD163 o NOS2, se encontraron efectos significativos en el pronóstico tanto para NOS2 (Log-rank
P =
0,015) y CD163 (Log-rank
P
= 0,001) la infiltración (Figura 6D y H). El pronóstico más favorable se encuentra en subgrupos CIMP altamente infiltrados (Figura 6D y H). subgrupos CIMP con baja infiltración de NOS2
+ o CD163
+ células en comparación mostraron un peor pronóstico. No se encontraron diferencias significativas en el pronóstico entre CIMP-negativas, CIMP-bajo o CIMP-alta casos dentro de los subgrupos de baja o alta infiltración de NOS2
+ macrófagos
+ o CD163.
Los subgrupos de CRC se ordenaron de acuerdo a la condición de CIMP y anotó para NOS2 (a-D) y CD163 (e-H) la expresión, la puntuación de 1-4. Se muestran los gráficos de Kaplan-Meier de especímenes de (A y E) de los casos CIMP-negativas, (B y F) casos CIMP-bajo, (C y G) casos CIMP-alta, y (D y H) Estado CIMP combinado y NOS2 o CD163, la puntuación de 1-2 o 3-4, respectivamente. log-rank pruebas se utilizaron para calcular
P
valores.
Discusión
El microambiente de acogida sufre cambios dramáticos durante la progresión del cáncer, que afecta a las células del estroma, la matriz composición, la angiogénesis y la respuesta inmune, que a su vez puede tener efectos significativos sobre el crecimiento tumoral y la diseminación [41]. Un microambiente tumoral inflamatoria se ha sugerido como el séptimo sello distintivo de la progresión del cáncer [42]. Análisis de la contextura inmune - es decir, la ubicación, la densidad y la orientación funcional de las células inmunes - y la forma en que se integra con tumor características moleculares pueden proporcionar información importante sobre el pronóstico del paciente así como la predicción de la respuesta a las diversas terapias de tratamiento [43], [ ,,,0],44]. Los macrófagos juegan un papel importante en la parte delantera del tumor, los factores secretores de que en muchos aspectos pueden afectar tanto el tumor como que rodea las células del estroma, incluyendo otras células del sistema inmune.
Hemos demostrado previamente en un relativamente gran cohorte clínica que una alta infiltración de células que expresan el marcador CD68 de macrófagos en la parte delantera del tumor en los resultados de la CRC en un mejor pronóstico [18]. Aquí, se evaluó la distribución de los macrófagos con un fenotipo M1 o M2
in situ
en esta cohorte para analizar la importancia de los diferentes subtipos de macrófagos en CRC pronóstico del paciente. Para este estudio, NOS2 y CD163 se seleccionaron como marcadores para separar entre macrófagos que muestran principalmente M1 o M2 fenotipos, respectivamente. Tanto NOS2 y CD163 se han utilizado por otros como marcadores para definir M1 o M2 fenotipos de macrófagos en los cánceres humanos [10], [45] - [57]. Nosotros aquí confirmó con tinción immunoflourescent doble y análisis confocal que estos marcadores en gran medida hacen por separado entre dos subpoblaciones celulares diferentes que son del linaje de macrófagos (Figura 1). Sin embargo, parece que hay un pequeño número de células que expresar tanto NOS2 y CD163, pero más a menudo en cantidades reducidas, lo que sugiere que a veces se produce un fenotipo mixto. subtipos de macrófagos que expresan altamente ya sea NOS2 o CD163, sin embargo muy raramente expresan el marcador para el subtipo opuesto. La definición distinta de los macrófagos en las poblaciones de subtipos M1 y M2 es probable que sea una ligera simplificación, ya que los macrófagos son células altamente plástico y puede mostrar un espectro de fenotipos [58]. Sin embargo, los marcadores de M1 y M2 macrófagos todavía se pueden usar para reconocer el fenotipo principal o función de diferentes poblaciones de macrófagos. A pesar de que encontramos que NOS2 y CD163 se expresan por diferentes poblaciones de macrófagos, todavía hay un riesgo de que no todos los macrófagos M1 o M2 expresan estos marcadores y que por lo tanto podrían perder partes de las poblaciones de macrófagos en nuestro estudio. Se necesitan más estudios para verificar los fenotipos M1 y M2 y para encontrar marcadores más específicos que permitan distinguir entre las poblaciones de macrófagos M1 y M2.
Cuando correlacionada con características clínico (Tabla 2), se encontró una débil tendencia lineal para una mayor infiltración de macrófagos M1 del cecal hasta el recto, el cual está en línea con la teoría del continuo colorrectal propuesto por Yamauchi et al [59], [60]. En su estudio, CIMP-alta, MSI-alto y
se encontraron mutaciones de BRAF
aumentar gradualmente desde el recto hasta el colon ascendente. No se encontraron cánceres Ceacal para representar un subtipo único que no siguió la tendencia de linealidad. Sin embargo, para la infiltración de macrófagos cánceres Ceacal no fueron excluidos de la linealidad. La expresión de NOS2 y CD163 inversamente correlacionado con el estadio del tumor, lo que indica que los tumores de etapas superiores en mayor medida han escapado del sistema inmunológico. Además, NOS2 y la expresión de CD163 correlacionan bien a la expresión del marcador CD68 de macrófagos (
P
& lt; 0,0001)., Que apoya que NOS2 y CD163 son expresados por células del linaje de macrófagos
En muchos estudios clínicos se ha observado que una alta infiltración de TAM se correlaciona con un mal pronóstico y TAM son por lo tanto sugiere que sea de M2 fenotipo que promover la progresión tumoral. Sin embargo, nosotros y otros han visto recientemente que altas cantidades de TAM en el CCR imparten un mejor pronóstico y la supervivencia tasa [17] - [20], [52]. Este es el primer estudio, a nuestro entender, en donde se utilizan marcadores para los subtipos de M1 y M2 macrófagos juntos en el propósito de comparar la distribución de los diferentes fenotipos de macrófagos y su relación con el pronóstico en el CCR. Pudimos observar una correlación estadística significativa entre la cantidad de NOS2
+ y CD163
+ macrófagos (
P Hotel & lt; 0,0001), lo que demuestra la presencia de macrófagos en paralelo con ambos fenotipos M1 y M2 en el frente invasivo del tumor (Tabla 1). Además, un aumento de la infiltración de ambos NOS2
+ y CD163
+ macrófagos en la parte delantera del tumor se correlaciona con un pronóstico mejorado significativamente (Figura 3). Se encontró que esta correlación también en un subgrupo de cánceres de colon resección curativa, pero no en un subgrupo de cánceres de recto resección curativa. Una posible explicación de esta diferencia podría ser que, en contraste a la mayoría de pacientes con cáncer de colon, muchos (60%) de los pacientes con cáncer rectal recibieron radioterapia preoperatoria, que se sabe que causa una reacción inflamatoria reducida [61]. Sin embargo, no se encontraron diferencias en la infiltración de macrófagos entre los tumores en pacientes que habían recibido radioterapia preoperatoria y los que no lo había hecho (Tabla 2).
La relación entre la infiltración de macrófagos M2 de fenotipo y el pronóstico en el CCR se ha analizado anteriormente en algunos estudios. De acuerdo con Nagorsen et al., Al igual que en nuestro estudio, la infiltración del estroma de CD163
+ M2 macrófagos en el CCR se correlacionó con una mejora significativa de supervivencia [52]. Estos autores no obstante evaluar la presencia paralela de macrófagos M1. Algars et al. encontrado una correlación positiva de peritumoral CLEVER-1 /Stabilin-1
+ M2 macrófagos y la supervivencia en los CRC [17]. Encontraron además que una baja relación M1 /M2 resultó en una enfermedad más recurrente. Sin embargo, en su estudio macrófagos M1 fueron considerados como los macrófagos que no expresan Clever-1 /Stabilin-1. Se han propuesto los macrófagos M1 que tiene actividad tumoricida, y como se esperaba, los pacientes que albergan tumores con alta infiltración de NOS2 fueron encontrados
+ macrófagos tener un pronóstico significativamente mejor que aquellos con poca o ninguna infiltración NOS2 (Figura 3A). Al igual que en nuestro estudio, Gufaa et al.