Extracto
En este estudio se evaluó la prevalencia, la distribución y el tumor histoanatomical importancia biológica de la proteína diana y madre de cáncer LGR5 marcador de células Wnt en tumores del tracto gastrointestinal humano. Expresión diferencial de LGR5 se estudió en la transcripción (reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real) y nivel de traducción (inmunohistoquímica) en tejidos malignos y correspondiente no malignas de 127 pacientes que comprende seis sitios de tumor primario diferente, es decir, esófago, estómago, hígado, páncreas, colon y el recto. El significado clínico-patológica de expresión LGR5 se estudió en 100 pacientes con carcinoma gástrico (CG). No neoplásico del tejido normalmente albergaba muy pocas LGR5
+ células dispersas. Los correspondientes carcinomas del esófago, estómago, hígado, páncreas, colon y recto mostraron significativamente más LGR5
+ células, así como los niveles significativamente más altos de LGR5-mRNA en comparación con el tejido no neoplásico correspondiente. experimentos doble tinción reveló una coexpresión de LGR5 con los marcadores de células madre putativas CD44, Musashi-1 y ADAM17. A continuación se probó la hipótesis de que los cambios secuenciales de la carcinogénesis gástrica, es decir, la gastritis crónica atrófica, metaplasia intestinal y carcinoma invasivo, se asocian con una reasignación de la LGR5
+ células. Curiosamente, la distribución espacial de LGR5 cambió: en la mucosa del estómago no neoplásico, LGR5
+ se encontraron células predominantemente en la región del cuello mucosa; en la metaplasia intestinal LGR5
+ células fueron localizados en la base cripta, y en GC LGR5
+ células estaban presentes en la superficie luminal, el centro del tumor y el frente de invasión. La expresión de LGR5 en el centro del tumor y la invasión frente a GC significativamente correlacionado con el crecimiento local del tumor (T-categoría) y la diseminación ganglionar (N-categoría). Por otra parte, los pacientes con LGR5
+ GC tuvieron una supervivencia media más corta (28,0 ± 8,6 meses) que los pacientes con LGR5
- GC (54,5 ± 6,3 meses). Nuestros resultados muestran que LGR5 se expresa de forma diferente en los cánceres gastrointestinales y que la distribución espacial de histoanatomical LGR5
+ células tiene que considerarse cuando se busca su tumor biológica importancia
Visto:. Simon E, D Petke, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) La distribución espacial de LGR5
+ células se correlaciona con la progresión del cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10.1371 /journal.pone.0035486
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2011; Aceptado: March 16, 2012; Publicado: 18 de abril 2012
Copyright: © 2012 Simon et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinomas gastrointestinales se encuentran entre las neoplasias más comunes y son una causa principal de muerte en todo el mundo el cáncer [1], [2]. Las razones de los pronósticos desfavorables son complejos: muchos cánceres del tracto gastrointestinal se diagnostican en estadios avanzados con exclusión de tratamiento curativo, no hay marcadores tumorales fiables que pueden permitir el diagnóstico o la detección de poblaciones de alto riesgo antes de tiempo. Las opciones de tratamiento son limitadas en enfermedad localmente avanzada y metastásica, y un número significativo de los tumores recurrentes a pesar de la respuesta terapéutica inicial [3]. Una explicación putativa de una terapia ineficaz es la presencia de células madre de cáncer (CSC). La hipótesis CSC postula que un tumor es un conglomerado de poblaciones de células heterogéneas. Sólo una subpoblación de este conglomerado mantiene la capacidad de formación de colonias, y por lo tanto la recurrencia y la diseminación metastásica. CSC son más resistentes a la quimioterapia, lo que lleva a la recurrencia del tumor, la progresión y la muerte en última instancia paciente [4], [5]. Mientras que el CSC-modelo se acepta cada vez más, la identificación y confirmación de los llamados marcadores de células madre en el tejido humano nativo es difícil y en gran parte que falta. Recientemente, la, G-proteína rica en leucina receptor (GPCR) y gen diana Wnt acoplado
LGR5
fue identificado como un nuevo marcador de células madre del intestino delgado, colon y en los folículos pilosos de ratones [6] . La expresión de LGR5 en varios otros órganos indica que puede representar un marcador global de las células madre adultas. Sin embargo, poco se sabe sobre su expresión en el tracto gastrointestinal de hepato-humanos.
En este estudio tuvo como objetivo llenar este vacío de información y prueba la hipótesis de que el LGR5 marcador de células madre de cáncer tiene pronóstico y biológica del tumor importancia.
Materiales y Métodos
los sujetos
fijado en formol e incluido en parafina malignas y no malignas de tejidos de 127 pacientes que comprende seis localizaciones anatómicas del correspondiente hepato-intestinal vías (es decir, esófago, estómago, hígado, páncreas, colon y recto) fueron recuperados de los archivos de los Institutos de Patología de la Christian Albrecht-Universidad de Kiel y el hospital Universitario Charité de Berlín (tanto en Alemania). Todos los pacientes fueron operados, ya sea en el Hospital Universitario de Schleswig-Holstein (1997-2009) o el Hospital Universitario Charité de Berlín (1995-2008; Tabla 1). tejido congelado sin fijar, fresco estaba disponible a partir de 105 de estos pacientes con ocho tipos diferentes de tumores, es decir, de adenocarcinoma de Barrett (9 pacientes) y carcinoma de células escamosas (7) del esófago, intestinal (19) y difusa (21) de tipo cáncer gástrico, adenocarcinoma del colon (19) y el recto (20), carcinoma hepatocelular (HCC; 4), y colangiocarcinoma (CC; 6). Las características de los pacientes se resumen en la Tabla 1.
Una serie independiente de 487 pacientes con cáncer gástrico fue recuperado del archivo del Instituto de Patología de las Christian Albrecht-Universidad (Tabla 2 y Tabla 3) . Estos pacientes habían sido sometidos a una gastrectomía total o parcial de los adenocarcinomas de estómago o de la unión oesophago-gástrica. Cada pieza de resección se había sometido a examen histológico por los patólogos quirúrgicos entrenados. Se obtuvo el momento de la muerte del paciente
Registro de Cáncer Epidemiológico
del estado de Schleswig-Holstein, Alemania. Los datos de seguimiento de los pacientes siguen vivos fueron recuperados de los registros hospitalarios y poniéndose en contacto con los médicos de cabecera.
Declaración de Ética
Todas las muestras de tejido se obtuvieron como parte de un diagnóstico o cirugía terapéutica llevada a cabo después de que el paciente firmó el consentimiento informado. Los pacientes que ofrecen muestras para el estudio se analizaron pseudonimizados y de forma anónima, por lo que no hay datos relacionados con individuales están contenidas en la base de datos. El estudio fue aprobado por el comité de ética local del Hospital de la Universidad de Kiel, Alemania (ref. D número 453/10).
-transcriptasa reversa reacción de polimerasa en cadena
El ARN total fue aislado a partir de células cultivadas y tejidos crioconservados utilizando el kit de Ambion mirVana miARN Aislamiento (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania), seguido por un tratamiento con DNasa con el kit de turbo-ADN libre (Ambion). la calidad del ARN se evaluó en un gel de agarosa al 1,5%. Para la síntesis de ADNc, 2 g de ARN total fue transcrito invertir usando Transcriptor primer capítulo de síntesis de cDNA Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). cebadores específicos de genes fueron sintetizados por Biomers.net (Ulm, Alemania) (Tabla S1). reacción en cadena de la transcriptasa inversa de la polimerasa en tiempo real (Real-time RT-PCR) se llevó a cabo usando el LightCyler® 480 Sondas Master (Roche) y el Sistema LightCycler® 480 (Roche). Los valores de Ct comparativos se normalizaron a la de los tres genes de limpieza:
Homo sapiens complejo succinato deshidrogenasa, subunidad A, flavoproteínas (Fp) (SDHA), Homo sapiens calpaína 2 (CAPN2)
y
La ciclofilina C ( CYCC)
. No hay controles de plantilla (sin cDNA en la PCR) se llevaron a cabo para cada gen para detectar la amplificación inespecífica o genómica y la dimerización de cebador. Todos los experimentos se realizaron en los duplicados.
Generación y purificación de un anticuerpo anti-LGR5 en anticuerpos
Los antisueros policlonales se generaron contra la cola carboxi-terminal del receptor de LGR5 humano. Se inmunizaron conejos con tres diferentes péptidos de la identidad de SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (llamado Cterm), RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (llamado 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (llamado 12) por Pineda-abservice (Berlin, Alemania). Monoespecífico IgG se purificó por cromatografía líquida rápida de proteínas con el sistema ÄKTAprime ™ (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) usando una proteína A-columna (GE Healthcare). Para todos los análisis posteriores, es decir, inmunofluorescencia, inmunocitoquímica, Western blot e inmunohistoquímica, la fracción IgG monoespecíficos fue purificado por afinidad contra los péptidos inmunizantes por la Pineda-abservice. En los análisis de transferencia puntual e investigaciones inmunohistoquímicas, el anticuerpo IgG monoespecíficos anti-LGR5-11b muestra una alta afinidad junto con inmunotinción fuerte y específica. Por lo tanto, se usó este anticuerpo largo de este estudio. La reactividad y la especificidad del anticuerpo monoespecífico se caracterizó por transferencia de Western; inmunofluorescencia y ensayos inmunocitoquímicos.
construcción plasmídica
construcción de expresión para LGR5 se generó mediante la amplificación de toda la secuencia de codificación de humano
LGR5
(NM_003667.2) por PCR (Tabla S1 ). Para facilitar la subclonación del fragmento amplificado en el vector de expresión pcDNA3.1 (-), el cebador directo contenía un sitio de restricción NheI adaptador y el cebador inverso contenía un sitio BamHI y una etiqueta c-Myc para verificar la transfección exitosa. fragmentos de PCR y el pcDNA3.1 (-) vector de expresión se digirieron por separado con NheI y BamHI antes de la ligación con T4-ligasa (Roche). El plásmido se verificó mediante digestión con NheI y BamHI y secuenciación de ADN usando equipos de reacción ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready, versión 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Alemania).
Cultivo de células y transfección
la línea celular de cáncer gástrico humano MKN74 se obtuvo de la investigación de la ciencia Banco japonés de Salud de recursos (Osaka, Japón), y MKN45 de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (Braunschweig, Alemania). Las células HEK293 EBNA fueron comprados por Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (MKN74, MKN45) o medio Eagle modificado de Dulbecco (HEK293) suplementado con 10% (MKN74, HEK293) o 20% (MKN45) de suero bovino fetal, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml estreptomicina (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria). transfección de ADN de HEK293 EBNA, MKN74 y MKN45 células se realizó usando el reactivo Lipofectamine LTX (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se cultivaron en placas de seis pocillos. Se realizó la transfección estable de MKN74 y MKN45 con plásmidos de expresión como [7] se describe anteriormente. Para la transfección transitoria de células HEK293 se diluyeron 1 mg de ADN plásmido y 5 l de reactivo Lipofectamine LTX en 500 l de Eagle modificado por Dulbecco sin suero, respectivamente. Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, la mezcla se añadió a células HEK293. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células transfectadas y se aislaron ARN o proteínas. Las células transfectadas con el vector pcDNA3.1 (-) solo y sin transfectar células sirvieron como controles negativos
inmunofluorescencia
Veinticuatro horas después de la siembra en CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica),. las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, se fijaron en 07:03 acetone:methanol (20 minutos, -20 ° C) y, posteriormente, se permeabilizaron con 0,1% Triton-X (5 minutos, temperatura ambiente). Los portaobjetos se incubaron después con anticuerpo monoclonal de ratón c-Myc (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.) durante la noche a 5 ° C en una cámara húmeda, seguido de un anti-ratón de Alexa Fluor 555 de anticuerpo secundario conjugado (Invitrogen). Para detectar la transfección exitosa de LGR5, las células se incubaron con anti-LGR5-anticuerpo seguido por un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 488 (Invitrogen), cada uno durante una hora a temperatura ambiente. La omisión de los anticuerpos primarios en LGR5 transfectaron células HEK293 EBNA sirvieron como control negativo. El montaje y la contratinción se realizó con Vectashield Hard-Set incluyendo DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EE.UU.).
inmunocitoquímica
La tinción inmunocitoquímica se realizó en fijado en formol e parafina incrustado células MKN45 de cáncer gástrico. Para este propósito, las células MKN45 fueron incorporados en pequeñas perlas de agarosa como se describe anteriormente [8]. El tratamiento posterior y la inmunotinción con anti-LGR5-anticuerpo (dilución 1:1000) se llevó a cabo de acuerdo con el análisis inmunohistoquímico de secciones de tejido humano (véase más adelante). La omisión del anticuerpo primario en LGR5 transfectaron células MKN45 sirvieron como control negativo, mientras que la especificidad de la tinción anti-LGR5-anticuerpo se confirmó por incubación del anticuerpo con el péptido inmunizante bloqueo.
Western blotting
proteína lisados se obtuvieron incubando el tejido gástrico humano y células gástricas cultivadas con ProteoJET ™ de células de mamífero reactivo de lisis (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania) y cóctel inhibidor de proteasa (Complete sin EDTA, Roche). Las muestras de proteína se desnaturalizaron en tampón de Laemmli (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% de dodecil sulfato de sodio, 10% de glicerol, 5% β-mercaptoetanol y 0,01% de azul de bromofenol) por calentamiento a 95 ° C durante diez minutos y fueron posteriormente cargado en 4% a 16.5% en geles de SDS poliacrilamida y se visualizaron por tinción con azul de Coomassie. Después de la separación, las proteínas en geles de poliacrilamida no teñidas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham, Freiburg, Alemania), a inmunotransferencia con el anticuerpo anti-LGR5-anticuerpo (dilución 1:20,000) y un anti-β-actina-anticuerpo (1:10,000; clonar AC-15, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) para asegurar cantidades iguales de carga. Membrana HRP marcado unido anticuerpos secundarios (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) fueron detectados por un aumento de quimioluminiscencia usando el sistema ECL (Amersham). La omisión del anticuerpo primario sirve como control negativo, mientras que la especificidad de la tinción anti-LGR5-anticuerpo se confirmó por incubación del anticuerpo con el péptido inmunizante bloqueo.
Histología
Para los análisis histológicos, tejido las muestras fueron fijadas en 10% formalina neutralizada y embebidos en parafina. Deparaffinized secciones fueron teñidas utilizando hematoxilina y eosina (H & amp; E). carcinoma gástrico se clasificó de acuerdo a la clasificación de la OMS [9]. La etapa pTNM se determinó de acuerdo con el 7
ª edición de la Internacional Union Against Cancer [10].
Tejido micro matriz construcción
fijados con formalina y muestras de tejidos incluidos en parafina fueron utilizado para generar micro matrices de tejido como se describe anteriormente [11]. Cuatro secciones micrométricas del tejido tumoral bloque de micro matriz resultante se cortaron para el análisis adicional. transferencia exitosa de tejido tumoral se confirmó microscópicamente mediante H & amp;.
secciones
La inmunohistoquímica
Para la inmunohistoquímica E-manchada, se utilizaron fijado en formol y embebidos en parafina secciones. La inmunotinción se llevó a cabo con el anti-LGR5-anticuerpo (dilución 1:1000), un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD44 (1:200; Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle, GB) y anticuerpos policlonales dirigidos contra comerciales LGR5 (LGR5
com , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, EE.UU.), ADAM17 (dilución 1:50; Sigma-Aldrich) y Musashi-1 (1:500; Chemicon International Inc., Temecula, CA, EE.UU.). Tras 20 minutos de bloqueo con el bloque de peróxido de hidrógeno (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), el tratamiento 5 minutos con V Bloque Ultra (Thermo Scientific) y la incubación con el anticuerpo primario se realizó en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las láminas fueron lavadas entre las etapas con solución salina tamponada con Tris (TBS). Inmunoreacciones se visualizaron con el n-Histofine simple mancha de Sistema MAX PO (Nichirei Bioscience, Tokio, Japón) y sustrato DAB (Linaris, Wertheim-Bettingen, Alemania). Para la doble tinción de LGR5 con CD44, ADAM17 y Musashi-1, los sitios de unión libres se bloquearon con IgG de ratón y el control de conejo-IgG (Abcam) diluido en diluyente de anticuerpo (ZYTOMED Systems, Berlín, Alemania) después de DAB-tratamiento. Las muestras se contratiñeron con hematoxilina. La omisión del anticuerpo primario sirvieron como controles negativos. No neoplásico estómago humano (CD44) y el tejido cerebral (LGR5
com, LGR5 y Musashi-1) sirvieron como controles positivos.
Evaluación de la inmunotinción
La inmunotinción del epitelio no neoplásico y las células tumorales se obtuvieron mediante la aplicación de un sistema de puntuación inmunoreactividad (IRS). En pocas palabras, la categoría A documentó la intensidad de la inmunotinción como 0 (sin inmunotinción), 1 (débil), 2 (moderada) y 3 (fuerte). Categoría B documentado el porcentaje de células inmunorreactivas como 0, 1 (células dispersas positivos; ≤1%) (negativo), 2 (2-10% de células positivas), 3 (11-50%), 4 (51 a 80%) y 5 (& gt; 80%). La adición de la categoría A y B dio lugar a un IRS que va de 0 a 8 para cada caso individual. Los cambios en la distribución de LGR5
+ células en 100 secciones de todo el montaje de cáncer gástrico de tipo intestinal se puntuó de la siguiente manera: el número de células inmunorreactivas se clasificó como 0 (negativo), 1 (& lt; 10 células positivas), 2 (10 -50 células positivas) y 3 (& gt; 50 células positivas por separado) para la superficie luminal, el centro del tumor y el frente de invasión
los análisis estadísticos
los análisis estadísticos se realizaron utilizando el SPSS Statistics 18. (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Las comparaciones entre grupos se analizaron mediante el uso de la prueba exacta de Fisher. La correlación de la expresión LGR5 dentro de un grupo se estableció mediante la correlación tau orden de rango de Kendall. Las curvas de supervivencia fueron equipados con el método y las diferencias en la supervivencia evaluados por la prueba de log rank de Kaplan-Meier. La importancia de las correlaciones de expresión LGR5 en tumores primarios y tejido no maligno correspondiente se evaluó mediante la prueba de Wilcoxon. En tiempo real RT-PCR datos, que fueron evaluados con una prueba t de dos caras emparejado, consiguieron logarithmized para obtener datos de una distribución aproximadamente normal. P-valores. & Lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo
Resultados
LGR5-ARNm se expresan diferencialmente en los carcinomas hepato-intestinal
LGR5 según los informes, se expresa en las células madre de murinos las criptas intestinales [12] y con frecuencia se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer de colon [13]. Para investigar su expresión en los tejidos humanos no neoplásico y neoplásicas, evaluamos la expresión transcripcional de LGR5 en muestras clínicas humanas compuestos de una amplia gama de carcinomas hepato-gastrointestinal. En tiempo real el análisis RT-PCR se llevó a cabo en una serie de 105 pacientes que comprenden el tejido no maligno maligno y correspondiente, obtenido a partir de los mismos pacientes, de los ocho tipos de tumores diferentes: esófago [adenocarcinomas de Barrett (9 pacientes) y carcinomas de células escamosas ( 7)], el estómago [intestinal (19) y el tipo difuso (21) carcinomas gástricos], el hígado [HCC (4), CC (6)], colon (19) y el recto (20; Tabla 1)
LGR5-mRNA fue significativamente expresados diferencialmente en adenocarcinomas de esófago (p = 0,007), el estómago [tipo intestinal (p = 0,006) y el tipo difuso (p = 0.013)], el hígado [CC (p = 0,022)], colon (p & lt; 0,001), así como el recto (p = 0,002) en comparación con el tejido no neoplásico emparejado. Sin embargo, ninguna expresión diferencial fue encontrado en carcinomas de células escamosas de esófago (p = 0,503) y los HCC en comparación con los correspondientes tejidos no neoplásicos (p = 0,545; Figura 1).
Boxplots que representan la distribución general de LGR5 comparar maligno frente a tejido no maligno adyacente en (a) adenocarcinoma de Barrett y (B) el carcinoma de células escamosas del esófago, (C) el cáncer gástrico de tipo intestinal, (D) el cáncer gástrico de tipo difuso, (e) carcinoma hepatocelular, (F) colangiocarcinoma, (G) y de colon (H) carcinoma de recto.
Un anti-LGR5-anticuerpo policlonal detecta LGR5 humano se transfectaron en células HEK293 y MKN45
Para explorar más a fondo la distribución histoanatomical de LGR5 en los tejidos humanos y para investigar su significado clínico-patológica, se planteó un anticuerpo-LGR5 específica, ya que los anticuerpos disponibles en el mercado no cumplen con nuestras demandas (Figura 2A). Para excluir la reactividad cruzada del anticuerpo recién generado con los LGRS más estructuralmente similares, LGR4 y Lgr6, se realizó un alineamiento de secuencias con el
Centro Nacional de Información de Biotecnología
herramienta de alineación de antemano (datos no mostrados). No homología de secuencia se encontró con LGR4 o Lgr6 en la región del péptido LGR5 se utilizó para la inmunización. Para la selección de un anticuerpo altamente específico contra LGR5, ADNc de longitud completa clonado se transfectó en células HEK293 EBNA y se utiliza como un inmunofluorescencia realizar objetivo positivo. El cDNA LGR5 fue etiquetado directamente con un myc-epítopo, lo que permitió la evaluación de la transfección con un anticuerpo anti-etiqueta myc. El uso de inmunofluorescencia, la unión de la etiqueta de anticuerpos anti-myc se encontró después de la incubación con células LGR5 /HEK293, pero no en células vacías transfectadas con vector (vector /HEK293), células HEK293 no transfectadas, o en el control negativo de células LGR5 /HEK293 incubaron con diluyente de anticuerpo en lugar del anticuerpo primario. Se obtuvo el mismo resultado cuando se utilizó el anti-LGR5-anticuerpo (Figura 3), lo que demuestra un etiquetado específico de LGR5
.
Imágenes representativas de la tinción inmunohistoquímica para LGR5
com (A) y LGR5 (B) en una muestra de cáncer gástrico. Después de la tinción separado para ADAM17 (C) y LGR5 (D), así como de doble tinción para ADAM17 (color rojo) y LGR5 (color marrón; E) en una sección en serie de la mucosa gástrica sana. La comparación de la mucosa del estómago sano (F, G) y tejido gástrico neoplásica (H), MSH-1
+ /LGR5
- (color rojo), MSH-1
- /LGR5
+ (marrón el color; F), así como MSH-1
+ /LGR5
+ células (G) están presentes. Predominantemente CD44
+ /LGR5
+ células en experimentos de doble tinción para CD44 (color rojo) y LGR5 (color marrón) en sanos (I) y neoplásicas (J) de la mucosa gástrica. células positivas dobles se indican con flechas, puntas de flecha marcan las células teñidas individuales dispersas. magnificaciones originales × 400 (A-J); × 600 (E).
La tinción de inmunofluorescencia de las células HEK293 EBNA con LGR5 anticuerpo específico (verde) y la etiqueta de anticuerpos anti-myc (rojo). Las células se contratiñeron con DAPI para mostrar el núcleo de la célula (azul). Las células transfectadas con el myc-etiquetados LGR5 ADNc (primer panel) en comparación con las células control, transfectadas con el vector vacío (control de vector vacío); dejando sin transfectar (control no transfectadas); o incubada sin los anticuerpos primarios, respectivamente. magnificaciones originales × 400.
La especificidad de LGR5-immunolabelling fue validado utilizando células de cáncer gástrico MKN45 incluidos en parafina y fijados en formalina. Se prepararon las células y se tiñeron en una manera que es paralela a la de procesamiento de muestras de tejido humano clínicos. Los análisis inmunocitoquímicos en secciones de parafina revelaron una tinción positiva de anticuerpos anti-LGR5-anticuerpo sobre MKN45 células transfectadas de forma estable con ADNc LGR5 (LGR5 /MKN45). En su lugar, vacíos células MKN45 transfectadas con vector (vector /MKN45), así como el control negativo (omisión del anticuerpo primario) y el péptido control (pre-incubación del anticuerpo con su péptido bloquea inmunizante) de células LGR5 /MKN45 mostraron no unión del anticuerpo (Figura S1).
proteína LGR5 se detecta específicamente por anti-LGR5-anticuerpo en humanos transfectados MKN74 células
las líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN74, conocido por poseer una expresión moderada LGR5-mRNA (datos no mostrados) y el estómago no neoplásico humano, exhibiendo expresión muy bajo LGR5 (Figura 1) fueron elegidos para caracterizar la reactividad y especificidad de la anti-LGR5-anticuerpo en el nivel de proteína.
en análisis de transferencia Western, la proteína LGR5 fue reconocido específicamente por el anti-LGR5-anticuerpo monoespecífico a una dilución de 1:20,000. Se identificó una banda con un peso molecular aparente de 100 kDa en lisados de células MKN74 (Figura 4), que coincide con la masa molecular calculada de la proteína LGR5. Por el contrario, no se detectó ninguna banda en lisados de tejido del estómago no neoplásico humano, que excluye una reactividad cruzada de anticuerpos anti-LGR5-anticuerpo con las proteínas celulares. En línea con los datos de expresión de ARNm, se observó fuerte expresión de la proteína en LGR5 MKN74 células transfectadas de forma estable con ADNc de LGR5, en comparación con las células control MKN74 transfectadas con el vector vacío. expresión de la proteína LGR5 en la mucosa del estómago no neoplásico humano estaba más allá del límite de detección de transferencia Western, se presentan ninguna banda. La omisión de la incubación anti-LGR5-anticuerpo o anterior del anticuerpo inmunizante con su bloqueo de péptidos no muestra bandas de proteína, respectivamente. La detección de la proteína β-actina (aproximadamente 43 kDa; Figura 4) sirvió como control de carga y confirmada uniformemente cargado cantidades de proteína en todos los carriles
tinción con azul de Coomassie (Coomassie) representa la calidad de cargados total de lisados de proteínas.. En el análisis de transferencia Western anti-LGR5-anticuerpo (1:20,000) detecta una sola banda de proteína en lisados de MKN74 células transfectadas de forma estable, que sobreexpresan LGR5 (MKN74 + LGR5), una banda más débil de las células transfectadas con el vector vacío de control (MKN74 + vector vacío), y ninguna banda en lisados de la mucosa del estómago no neoplásico humano, respectivamente. En una transferencia paralela no hay bandas de destino son visibles cuando el anti-LGR5-anticuerpo se preincubó con el bloqueo de péptido (péptido de bloqueo) su inmunizante. Las bandas superiores (100 kDa, flecha) muestran la proteína LGR5, mientras que las bandas inferiores (~43 kDa, flecha) representan β-actina, que se utiliza como control de carga.
LGR5 se expresa en la no tejido -neoplastic y neoplásicas del tracto gastrointestinal hepato-
la distribución expresión y histoanatomical de LGR5 se estudió posteriormente por inmunohistoquímica en una serie de 127 diapositivas de tejido obtenidos a partir de correspondiente tejido no neoplásico y neoplásica de la hepato-gastrointestinal tracto, que comprende el esófago (14 pacientes), estómago (32), el hígado (24), páncreas (17), colon (20), y el recto (20; Tabla 1). Fuera de esta cohorte neoplásica y las correspondientes muestras de tejidos no tumorales de 105 pacientes también fueron estudiados en el nivel transcripcional (véase más arriba).
LGR5 expresión de la cohorte global fue positivo en 65 casos (51%) de todos los tejidos no malignos y 103 casos (81%) de todos los tejidos de cáncer. La localización de la expresión LGR5 se observó como principalmente citoplasmática, mientras que también se produjo una membrana o núcleo de la membrana expresión acentuado esporádica. Un LGR5-inmunoreactividad se encuentra en todos los componentes del tejido, es decir, células del estroma, células endoteliales, células en el epitelio no neoplásico y en las células cancerosas (Figura 5). se observó LGR5-inmunoreactividad en células de estroma en 49 (39%) de todos los tejidos no malignos y en 80 casos (63%) de todos los tejidos de cáncer. Se observó una inmunorreactividad endotelial de LGR5 en 42 casos (33%) de todos los tejidos.
expresión LGR5 en mucosa normal del colon (A), membranosa (B) y la tinción citoplásmica (C) en las células de cáncer de colon correspondientes. Flechas marca dispersos células inmunorreactivas dentro de la base cripta. El asterisco (*) marca el sitio luminal. Variable LGR5-inmunorreactividad de las células endoteliales se encontró en el tejido de cáncer: La presencia de células endoteliales LGR5-immunonegative (D) fue confirmada por CD34 (E) mediante secciones en serie. Nota fuerte LGR5-inmunoreactividad endotelial en otro caso de cáncer de colon (F). (G) Expresión de LGR5 en células de estroma desmoplásico. magnificaciones originales × 200 (A); × 400 (B-G).
En el epitelio no maligno, LGR5 se encuentra generalmente en pocas células dispersas cerca de la membrana basal de la unidad de la mucosa gástrica, conductos pancreáticos, y las criptas colorrectales . LGR5 no se encontró en el epitelio escamoso del esófago, los conductos biliares intrahepáticos, y los hepatocitos (Figura 6). Para todos los tipos de tejidos aparte de tejido esofágico el valor medio de IRS fue significativamente mayor para el tejido tumoral con respecto al tejido no maligno emparejado, lo que confirma nuestros hallazgos sobre el nivel transcripcional (Tabla 1).
Expresión de LGR5 en mucosa normal del esófago (a) en comparación con un adenocarcinoma (B) y un carcinoma de células escamosas (C). expresión LGR5 en el hígado normal (D) en comparación con carcinoma hepatocelular (E), normal (F) y malignos de epitelio (G) del conducto biliar, así como no neoplásico (H) y neoplásicas (I) tejido pancreático. magnificaciones originales × 400.
LGR5 está presente en las células dispersas de la mucosa gástrica normal
La existencia de células madre multipotentes en el estómago murino fue demostrado por estudios de marcado clonales. La identificación definitiva de estas células hasta el momento no debido la falta de disponibilidad de marcadores endógenos específicos [14]. El uso de secciones seriadas obtenidas a partir de una muestra de la manga de resección, que por lo general se obtiene para el tratamiento del sobrepeso, y no mostró signos histológicos de cáncer gástrico o gastritis crónica, se realizaron búsquedas de LGR5
+ células epiteliales. Se encontraron LGR5
células Curiosamente, dispersos + en la región del cuello entre la mucosa y las glándulas foveolas (Figura 7).
Patrones de distribución de LGR5
+ células de la mucosa gástrica sana (A, E) , una metaplasia intestinal (B, F), y un adenocarcinoma gástrico (C, G), con su frente invasivo (D). El panel superior muestra la tinción inmunohistoquímica representativa con un anti-LGR5-anticuerpo en secciones completas de montaje de tipo intestinal cánceres gástricos. El panel inferior muestra el modelo de esquema correspondiente de los cambios en la distribución en las diferentes etapas de la génesis de tumores gástricos. Las flechas marcan LGR5
+ células. El asterisco (*) marca el sitio luminal. La línea de negro destaca la interfaz de host del tumor (frente de invasión). aumentos x 200 originales.
LGR5 se coexpresan con otros posibles marcadores celulares de células madre progenitoras gástrica o
Las células madre de tejido no neoplásico y células madre cancerosas suelen ser identificados y validados por la expresión de más de un solo marcador de células madre [15]. El uso de inmunohistoquímica, se analizaron siguiente la coexpresión de LGR5 con otros marcadores putativos de CSC, es decir ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 fue seleccionado, ya que los estudios anteriores identificaron ADAM17 como un marcador de células madre putativa del estómago [8]. La inmunotinción (ya sea doble tinción o tinción de secciones en serie) se llevó a cabo en una muestra de cáncer gástrico y en la mucosa gástrica uninflammed saludable obtenida por gastrectomía en manga. En general, sólo pocas células dispersas mostraron inmunotinción positiva para uno y /o el otro marcador de células madre putativa.