Extracto
El empleo de anti-epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) anticuerpos representa una columna vertebral de la opciones terapéuticas para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico (CCRm). Sin embargo, esta terapia es poco eficaz o ineficaz en pacientes no seleccionados. Las mutaciones en los genes KRAS, BRAF, y PIK3CA han surgido recientemente como los mejores factores predictivos de respuesta de baja /ausente a la terapia EGFR. Debido a la necesidad de opciones de tratamiento eficaces para los pacientes con CCRm que llevan estas mutaciones, en este breve informe se examinó la actividad antitumoral del mesilato gabexate inhibidor de la proteasa, solo y en combinación con el cetuximab anticuerpo monoclonal anti-EGFR, en un panel de CRC humana líneas de células que albergan un patrón de expresión diferente de genes mutados KRAS, BRAF, y PIK3CA de tipo salvaje /. Los resultados obtenidos mostraron que el mesilato de gabexato inhibió significativamente el crecimiento, el potencial invasivo y la angiogénesis inducida por tumor en todas las células de CRC empleados en este estudio (incluyendo aquellos que albergan dual KRAS /PIK3CA o BRAF /mutación PIK3CA), mientras que cetuximab afectada estos parámetros sólo en CRC células con KRAS, BRAF, y PIK3CA de tipo salvaje. En particular, se encontró que la eficacia antitumoral de mesilato de gabexato y cetuximab en combinación para ser no superior a la observada con gabexate mesilato como agente único. En general, estos resultados preliminares sugieren que el mesilato de gabexato podría representar una opción terapéutica prometedora para los pacientes con CCRm, en particular para aquellos que albergan mutaciones de KRAS, BRAF y PIK3CA, ya sea como monoterapia o además de los regímenes de quimioterapia estándar. Más estudios para dilucidar mejor mecanismo gabexate mesilato de acción en las células CRC, por tanto, están garantizados
Visto:. Brandi G, S Tavolari, De Rosa M, Di Girolamo S, V Agostini, Barbera MA, et al. (2012) La eficacia antitumoral del inhibidor de la proteasa Gabexate Mesilate en células de cáncer de colon Albergar KRAS, BRAF, y PIK3CA mutaciones. PLoS ONE 7 (7): e41347. doi: 10.1371 /journal.pone.0041347
Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, Italia |
Recibido: 17 Febrero, 2012; Aceptado: 20 Junio 2012; Publicado: 24 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Brandi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
en los últimos quince años, la introducción de por lo por lo menos seis medicamentos clave (oxaliplatino, irinotecan, capecitabina, bevacizumab, cetuximab y panitumumab), después de la "era" de 5-fluorouracilo como agente único, se ha mejorado la supervivencia global media de cáncer colorrectal metastásico (CCRm) de los pacientes hasta 24 meses [ ,,,0],1], [2]. El empleo del receptor de factor de crecimiento anti-epidérmico (EGFR) anticuerpos panitumumab y cetuximab, ya sea como monoterapia o además de los regímenes de quimioterapia estándar, representa una cadena principal de las opciones terapéuticas para el tratamiento de cáncer colorrectal metastásico. Sin embargo, los ensayos controlados aleatorios han proporcionado pruebas convincentes de que la terapia EGFR es poco eficaz o ineficaz en pacientes con CCRm no seleccionados. En los últimos años, la activación de mutaciones en los codones 12 y 13 en el oncogén KRAS (KRAS
G12V y KRAS
G13D) se han convertido en los mejores factores predictivos de respuesta de baja /ausente a la terapia anti-EGFR en estos pacientes, ya sea en la primera línea o posteriores líneas de tratamiento [3] - [5]. Por esta razón, los pacientes con CCRm están perfiladas por la mutación KRAS y el empleo de cetuximab y panitumumab está actualmente restringido únicamente a aquellos que llevan el gen KRAS no mutado, según lo recomendado por la Agencia Médica Europea y la Sociedad Americana de Oncología Clínica [6] . Aunque la presencia de KRAS no mutado parece ser una condición para la respuesta a la terapia EGFR, hasta el 50-65% de los pacientes con CCRm no puede aprovecharse de este tratamiento, debido a los mecanismos intrínsecos de resistencia adicionales [7]. En este sentido, la participación de BRAF
V600E y PIK3CA
H1074R en el exón 20 mutaciones en el fracaso de este tipo de terapia ha surgido recientemente [7] - [11]. Debido a la falta de una efectiva terapia dirigida, el descubrimiento de nuevas opciones terapéuticas para los pacientes con CCRm con KRAS mutado genes, BRAF, y PIK3CA representa por lo tanto un área de intensa investigación.
La proteasa mesilato gabexate inhibidor se ha demostrado que ejercer una actividad antitumoral significativa en las células de CRC, tanto in vitro como in vivo [12]. Sin embargo, el efecto de este fármaco, solo o en combinación con cetuximab, en las células humanas CRC albergar un patrón de expresión diferente de la de tipo salvaje /KRAS, BRAF, y PIK3CA aún sigue sin resolverse. El presente estudio tiene como objetivo investigar esta hipótesis.
Resultados
preliminar seleccionado un panel de células CRC humanos que alberga un patrón de expresión diferente de la de tipo salvaje /KRAS mutado, BRAF y los genes PIK3CA. Para este fin, basado en el Catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer (cósmica) de base de datos (http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/) y en el estudio de Jhawer et al. [13], Caco-2, se eligieron SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y células HCT-116 CRC (véase la Tabla 1 para su correspondiente KRAS, BRAF y el estado PIK3CA). En particular, no se encontró una línea celular de CRC con co-produciendo mutaciones KRAS y BRAF y se incluye en el presente estudio, de acuerdo con informes anteriores que muestran un patrón de exclusividad mutua de KRAS y BRAF mutación en CRC humana [14]. El efecto de mesilato de gabexato, solo y en combinación con cetuximab, fue entonces investigó en células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y 116 HCT-crecimiento celular, la angiogénesis potencial y inducida por tumor invasivo , ya que representa tres procesos fundamentales en la aparición y progresión del cáncer.
como se muestra en la Figura 1, 24 y 48 horas de tratamiento con cetuximab (100 mg /ml) se encontraron para afectar la viabilidad celular sólo en CRC células que albergan de tipo salvaje KRAS, BRAF y los genes PIK3CA (Caco-2 y SW48), como se esperaba. Por el contrario, mesilato gabexate (0,1-1 mM) indujo una disminución considerable de tiempo y dependiente de la dosis de este parámetro en todas las líneas celulares de CRC incluidos en el estudio (Caco-2: IC
50 48 hrs = 0,31 ± 0,01; SW48 : IC
50 48 hrs = 0,33 ± 0,01; HT-29: IC
50 48 hrs = 0,55 ± 0,03 mm; Colo205: IC
50 48 hrs = 0,46 ± 0,02; SW480: IC
50 48 hrs = 0,45 ± 0,02 mm; SW620: IC
50 48 hrs = 0,39 ± 0,02; RKO: IC
50 48 hrs = 0,49 ± 0,01 mm; LS174T: IC
50 48 hrs = 0,59 ± 0,03; HCT-116: IC
50 48 hrs = 0,56 ± 0,0 3 mM). Hemos observado que el efecto sobre la viabilidad celular provocada por mesilato gabexate solo fue similar a la observada cuando este fármaco se administró en combinación con cetuximab 100 mg /ml (Figura 1).
Evaluación por ensayo de MTT de CACO-2 , SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y HCT-116 de la viabilidad celular después de 24 y 48 h de tratamiento con cetuximab 100 mg /ml y gabexate mesilato de 0,1 a 1 mM, solos y en combinación. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Para cada línea celular, el valor medio de las muestras sin tratar se asume como 100% y los valores medios de las células tratadas se representaron como porcentajes con respecto a sus controles emparejados. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilato. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,001; *** P:. No significativa
A continuación, se investigó el efecto de estos dos fármacos en células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y HCT- 116 invasividad. El tratamiento durante 6 horas con mesilato gabexate 1 mM disminuyó significativamente el potencial invasivo en todas las líneas celulares de CRC probados (CACO-02:53%; SW48:42%; HT-29:45%; Colo205:43%; SW480:55% ; SW620:69%; RKO: 63%; LS174T: 54%; HCT-116:52%) (Figura 2). Cabe destacar que, tal disminución no se debe a un efecto citotóxico de este medicamento, como se confirma por un experimento paralelo en el que no se observó ningún cambio significativo de la viabilidad celular entre el control y las células tratadas en este momento del tratamiento (datos no mostrados). Por el contrario, 6 horas de tratamiento con cetuximab 100 mg /ml no indujo cambios significativos en el potencial invasivo de células CRC, excepto en las células Caco-2 y SW48, donde se observó un 25% y 22% de inhibición, respectivamente. De nuevo, cuando este fármaco se emplea en combinación con mesilato de gabexato, el efecto suscitó fue similar a la observada con gabexate mesilato como agente único (Figura 2).
Evaluación por Boyden ensayo de cámara de invasión de células Caco-2, SW48 , HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y HCT-116 potencial invasivo después de 6 horas de tratamiento con cetuximab 100 mg /ml y gabexate mesilato 1 mM, solo y en combinación. Para cada línea celular, el valor medio de las muestras sin tratar se asume como 100% y los valores medios de las células tratadas se representaron como porcentajes con respecto a sus controles emparejados. Las fotografías de las células invasoras son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilato. Barra de escala: 50 micras. * P & lt; 0,05; *** P:. No significativa
Por último, se evaluó el efecto de cetuximab y gabexate mesilato sobre la angiogénesis inducida por el tumor. Se observó una muy fuerte efecto inhibidor sobre este parámetro cuando se examinó la acción de mesilato gabexate solo. De hecho, las 24 horas de incubación de las células EA.hy926 con el medio de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO acondicionado, células LS174T y HCT-116, previamente tratados durante 6 horas con este fármaco en el dosis de 1 mM, la diferenciación celular endotelial casi completamente inhibida en estructuras similares a capilares, como se indica por la presencia de una red interconectada de anastomosis de células en muestras de control y de células esféricas, aisladas o agregados de pequeños grupos, en tratados los (Figura 3 ). También en este parámetro, cetuximab solo (100 mg /ml) se encontró que era moderadamente eficaz sólo en líneas de CRC de células de tipo salvaje KRAS, BRAF y genes PIK3CA (inhibición del índice de formación de tubos, 22% y 20% en CACO-2 y células SW48, respectivamente). Debido a la fuerte inhibición de la angiogénesis inducida por tumor por mesilato gabexate solo a la dosis 1 mM, el efecto de la sola y en combinación con cetuximab este fármaco también se evaluó a la dosis de 0,1 y 0,5 mM. Sin embargo, también en estas dosis, el efecto anti-angiogénico mostrada por mesilato gabexate más cetuximab no fue superior a la observada con mesilato gabexate empleado como agente único (datos no mostrados).
Evaluación por angiogénesis in vitro Matrigel ensayo in EA.hy926 de la diferenciación de las células endoteliales en estructuras de tipo capilar después de 24 horas de incubación con el medio de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO acondicionado, células LS174T y HCT-116, previamente tratadas por 6 hrs con cetuximab 100 mg /ml y gabexate mesilato 1 mM, solos y en combinación. índice de la formación del tubo se evaluó como se describe en la sección Materiales y Métodos. Para cada línea celular, el valor medio de las muestras sin tratar se asume como 100% y los valores medios de las células tratadas se representaron como porcentajes con respecto a sus controles emparejados. Las fotografías son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilato. Barra de escala: 50 micras. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,001; *** P:. No significativa
En general estos resultados, además de confirmar la falta de respuesta a cetuximab en células con mutaciones KRAS CRC, BRAF, y PIK3CA, indican que el mesilato de gabexate es capaz de ejercer una significativa actividad antitumoral en células de CRC albergar ya sea de tipo salvaje o mutado genes KRAS, BRAF y PIK3CA, con una eficacia comparable a la observada cuando se utiliza en combinación con anticuerpos anti-EGFR.
Discusión
terapia personalizada representa una meta atractiva en oncología. Hasta la fecha, la secuenciación del genoma del cáncer se ha convertido en una herramienta poderosa para identificar las mutaciones relacionadas con el cáncer y para seleccionar a los pacientes que podrían beneficiarse de un régimen terapéutico específico. En este contexto, el análisis de la mutación KRAS ha aumentado rápidamente el índice terapéutico de la terapia EGFR en pacientes con CCRm, restringiendo este tratamiento sólo para aquellos que albergan KRAS de tipo salvaje. Aunque se requiere una validación adicional antes de una posible aplicación en la práctica clínica, se ha hecho evidente que BRAF y PIK3CA genotipado adicionales podrían mejorar significativamente la tasa de respuesta objetiva en estos pacientes. De hecho, la activación de KRAS, BRAF, y PIK3CA mutaciones son capaces de saltarse la inhibición farmacológica de EGFR, lo que resulta en una activación constitutiva de la proteína quinasa y Akt vías activadas por mitógenos, sabe que juega un papel central en la aparición y progresión del cáncer [15]. En términos de implicaciones terapéuticas, esto sugiere que también los pacientes con CCRm con genes BRAF y PIK3CA mutados deben tener poco o ningún beneficio de la terapia EGFR. En particular, KRAS, BRAF, y PIK3CA mutaciones se activan con frecuencia (hasta el 50-60% en su conjunto) en pacientes con CRC [14]. Por esta razón, el descubrimiento de nuevas opciones de tratamiento eficaz en pacientes con CCRm que llevan tales mutaciones representa actualmente un área de intensa investigación [11], [16] - [18].
La proteasa mesilato gabexate inhibidor es un medicamento rutinariamente empleado en la práctica clínica en Italia, Japón y Corea para el tratamiento de la pancreatitis aguda y la coagulación intravascular diseminada, junto con la profilaxis de post-endoscópica pancreatitis colangiopancreatografía retrógrada [19], [20]. En particular, las características toxicológicas mesilato gabexate ha sido probado en seres humanos y rara vez se han descrito efectos secundarios graves. Curiosamente, en estudios preclínicos anteriores, este fármaco ha demostrado una actividad antitumoral potente, incluyendo la inhibición de la CRC de crecimiento y metástasis hepáticas de tumores primarios en ratones nude [12].
Este estudio preclínico tuvo como objetivo investigar la eficacia antitumoral putativa de gabexate mesilato, solo y en combinación con el cetuximab anticuerpo monoclonal anti-EGFR, en un panel de líneas celulares de CRC humanos que albergan un patrón de expresión diferente del de tipo salvaje mutados genes /KRAS, BRAF y PIK3CA. Los resultados obtenidos (además de confirmar la falta de respuesta a cetuximab en las células de CRC que llevan tales mutaciones) mostraron que el mesilato de gabexato fue capaz de ejercer un amplio efecto antitumoral en tales células, pudiendo afectar de manera significativa la viabilidad celular, la angiogénesis potencial y inducida por tumor invasivo en todas las líneas celulares analizadas en este estudio, incluyendo aquellos que albergan doble KRAS /BRAF mutación PIK3CA o /PIK3CA. Se encontró que la eficacia de gabexate mesilato como agente único a ser comparable a la observada cuando este fármaco se usa en combinación con cetuximab, lo que indica que la eficacia antitumoral de estos fármacos en combinación no fue superior que la de mesilato gabexate empleado como agente único.
en particular, el crecimiento celular, la angiogénesis un alto potencial y inducida por tumor invasivo son tres procesos fundamentales para el desarrollo del cáncer y metastatisation, lo que representa un blanco atractivo para el tratamiento del cáncer. Como cuestión de hecho, muchas estrategias terapéuticas basadas en la integración de los inhibidores selectivos de estas vías están siendo ampliamente explorados en estudios preclínicos y clínicos. En este contexto, también teniendo en cuenta el buen perfil toxicológico, los resultados preliminares mostraron en este breve informe sugieren que el mesilato de gabexate podría representar una opción terapéutica prometedora para pacientes con CCRm, en particular para aquellos cojinete mutados genes KRAS, BRAF, y PIK3CA, ya sea como mono-terapia o además de los regímenes de quimioterapia estándar. Más estudios para dilucidar mejor mecanismo gabexate mesilato de acción en las células CRC, por tanto, están garantizados.
Materiales y Métodos
Células y cultivo celular
El CRC líneas celulares humanas HT-29 , LS174T y HCT-116, así como la línea celular endotelial EA.hy926-como inmortalizada humana, se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). RKO, Caco-2, SW480 y SW48, SW620 y líneas celulares humanas Colo205 CRC fueron un generoso regalo del Dr. Luigi Ricciardiello (Departamento de Medicina Clínica, Hospital Sant'Orsola-Malpighi Universidad de Bolonia, Bolonia, Italia) y el Prof. Massimo Derenzini (Departamento clínico de Radiología y Ciencias histopatológicos, Sant'Orsola-Malpighi hospital de la Universidad de Bolonia, Bolonia, Italia), respectivamente. Todas las líneas celulares se cultivaron en Dulbecco medio de Eagle modificado con 4,5 g /l de glucosa (Euroclone, Milán, Italia), suplementado con 10% (v /v) de FBS (Euroclone), inactivado por calor 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.). Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 y rutinariamente passaged usando tripsina-EDTA 0,025% (Sigma-Aldrich). Para cada línea celular empleada en este estudio, una prueba de autenticación línea celular mediante la evaluación de repetición corta de ADN se realizó en tándem (STR) de perfil, con el fin de excluir una contaminación o una identificación errónea con otras líneas celulares.
Gabexate mesilato (Foy, Sanofi Aventis, Milán, Italia) y cetuximab (Erbitux, (Merck, Darmstadt, Alemania) se diluyeron en el medio para obtener la concentración final requerida antes de cada experimento. para ambos fármacos, las dosis empleadas (100 g /ml para el cetuximab y 0,1-1 mM durante mesilato gabexate) fueron elegidos de acuerdo a estudios previos in vitro [12], [13], [21], [22]. Como se ha informado mesilato gabexate para ser parcialmente degradado por albúmina de suero [23], todos los experimentos se llevaron a cabo en medio libre de suero. en experimentos llevados a cabo con el medio de líneas celulares de CRC acondicionado, las células se trataron con fármacos, solos y en combinación, durante 6 horas y luego se recogió el medio acondicionado, centrifugaron a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para eliminar las células y restos, y se congelaron a -80 ° C hasta su uso.
viabilidad celular Ensayo
experimentos de viabilidad celular se realizaron por 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo. Brevemente, CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y células HCT-116 (1 × 10
4 células /pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos por cuadruplicado y se dejó adherir durante 24 hrs. Luego, las células se trataron con cetuximab y concentraciones crecientes de mesilato gabexate durante 24 y 48 hrs. Al final de la incubación, se añadió MTT a cada uno de las células así y se incubaron a 37 ° C durante 4 horas. cristales de formazán se disolvieron después de la adición de DMSO. entonces absorbancia se midió a 570 nm en un espectrofotométrico microplacas de 96 pocillos lector (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Para cada línea celular, el IC
50 valor se calculó por análisis de regresión no lineal utilizando el software PRISM 5.01 versión (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.).
quimioinvasión Ensayo
La potencial invasivo de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y células HCT-116 se evaluó mediante el ensayo de quimioinvasión [24]. En pocas palabras, los filtros de policarbonato libres de polivinilpirrolidona (Millipore, Co. Cork, Irlanda) con 12 micras poros fueron recubiertas con Matrigel (Sigma-Aldrich). DMEM fresco suplementado con inactivado por calor 10% de FBS se colocó en la cámara inferior como quimioatrayente y 1 × 10
5 células a continuación se sembraron en la cámara superior y se incubaron durante 6 horas con mesilato de gabexato y cetuximab, solos y en combinación, a 37 ° C en 5% humidificado de CO
2. Al final de la incubación, las células no invasoras se eliminaron de la superficie superior de los filtros. células invasoras en la superficie inferior se fijaron durante 1 min en etanol 95% y se tiñeron durante 10 minutos con 0,5% w /v azul de toluidina. En el ensayo de migración, se siguió el mismo procedimiento de ensayo de invasión, excepto que los filtros se recubrieron con gelatina (Sigma-Aldrich). Las fotografías fueron tomadas con un microscopio Olympus CKX41 invertido (Olympus Italia, Milán, Italia), equipado con una cámara Olympus C5060-ADU (Olympus Italia). Para cada muestra, se analizaron cuatro campos ópticos aleatorios en × 200 de ampliación total y el número medio de células invasoras se calculó como sigue:. El número medio de células invasoras /número medio de células que migran correspondiente
angiogénesis in vitro ensayo
angiogénesis in vitro se evaluó mediante la diferenciación de las células endoteliales en estructuras de tipo capilar en Matrigel. Brevemente, factor de crecimiento enriquecido con Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EE.UU.) se colocó en una placa de 24 pocillos enfriado en hielo y se deja polimerizar durante 1 h a 37 ° C. células endoteliales EA.hy926 (1,2 × 10
5 /pocillo) a continuación, se sembraron y se incubaron durante 24 horas con una cantidad igual de células Caco-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T y HCT -116 medio acondicionado, obtenido como se describe anteriormente en la sección material y Métodos. células del cáncer de medio acondicionado es de hecho utiliza comúnmente en ensayos de angiogénesis in vitro para imitar lo que ocurre durante la angiogénesis tumoral en vivo [25]. Al final de la incubación, se observó una organización tridimensional a través de un microscopio de luz de contraste de fase invertida. Las fotografías de cuatro campos representativos de cada muestra se obtuvieron a 200 × ampliación total con un microscopio Olympus CKX41 invertido (Olympus Italia), equipado con una cámara Olympus C5060-ADU (Olympus Italia). Se realizó una medición semicuantitativa de estructuras de tipo capilar (tubo de índice de formación) como se ha descrito anteriormente [26].
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como porcentaje de la media ± S.D.. Los datos fueron analizados por ANOVA seguido por el test post hoc de Bonferroni, usando PRISM versión de software 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Reconocimientos
Los autores agradecen al Centro de Investigación Biomédica Aplicada (CRBA, Hospital Sant'Orsola-Malpighi Universidad de Bolonia, Bolonia, Italia. ) para proporcionar las instalaciones para el presente estudio y el Dr. Carla Bini (Departamento de Medicina y Salud Pública, Universidad de Bolonia, Bolonia, Italia) para la autenticación línea celular.