Extracto
El cáncer colorrectal es la tercera causa de muerte por cáncer en el mundo - la causa principal de muerte por cáncer colorrectal es metástasis hepáticas, que se pueden tratar con la perfusión hepática aislada (PHI). La búsqueda de los enfoques más relevantes clínicamente para el tratamiento de la enfermedad metastásica colorrectal mediante perfusión hepática aislada (PHI), desarrollamos la aplicación de oxaliplatino de forma concomitante con la hipertermia y la muerte del receptor humanizado 4 (DR4) mapatumumab anticuerpo (MAPA), y se investigaron los mecanismos moleculares de esta tratamiento multimodalidad en líneas celulares de cáncer de colon humano CX-1 y HCT116, así como las células madre de cáncer de colon humano Tu-12, Tu-21 y Tu-22. Mostramos aquí, en este estudio, que el efecto sinérgico de la apoptosis inducida por tratamiento multimodalidad era caspasa muerte dependiente y activada la señalización a través tanto de la ruta apoptótica extrínseca y la vía intrínseca. la señalización de la muerte fue activado por la señalización de c-Jun N-terminal quinasa (JNK) que dio lugar a la fosforilación de Bcl-XL en la serina 62, la disminución de la actividad anti-apoptótica de Bcl-XL, lo que contribuyó a la vía intrínseca. La regulación a la baja de FLICE celular proteína inhibidora isoforma larga (c-FLIP
L) en la vía extrínseca se logra a través de la ubiquitinación en el residuo lisina (K) 195 y la inhibición de la síntesis de proteínas. La sobreexpresión de c-FLIP
L mutante (K195R) y mutante Bcl-XL (S62A) anuló completamente el efecto sinérgico. El éxito de este estudio apoya la aplicación de la estrategia multimodal de pacientes con metástasis hepáticas colorrectales que no responden a la quimioterapia estándar que se dirige mayormente a la vía apoptótica mitocondrial
Visto:. Canción X, Kim SY, Lee YJ ( 2013) La evidencia de dos modos de sinérgica inducción de apoptosis por mapatumumab y oxaliplatino en combinación con la hipertermia en células de cáncer de colon humano. PLoS ONE 8 (8): e73654. doi: 10.1371 /journal.pone.0073654
Editor: Raffaele Un Calogero, Universidad de Turín, Italia |
Recibido: 31 de mayo de 2013; Aceptado: July 30, 2013; Publicado: 27 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Song et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la siguiente subvención: fondo de subvención del NCI (CA140554). Este proyecto utiliza el Fondo para la UPCI Core y fue apoyado en parte por el premio P30CA047904. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal, que causa aproximadamente el 10% de las muertes por cáncer en los Estados Unidos, es la tercera causa de muerte por cáncer en el mundo; la muerte suele ser resultado de la enfermedad metastásica no controlada. Por desgracia, sólo el 10-15% de las metástasis hepáticas de cáncer colorrectal iniciales son considerados resecables [1,2]. Los casos no resecables de la enfermedad metastásica del hígado pueden ser tratados con perfusión hepática aislada (PHI), que implica un método de aislamiento vascular completa del hígado para permitir el tratamiento multimodalidad de tumores en el hígado [3-6].
mapatumumab (Mapa) es una IgG1 anticuerpo monoclonal totalmente humano agonístico, que se dirige exclusivamente y activa del receptor de muerte 4 (DR4) con una alta especificidad y afinidad [7-9]. Brevemente, Mapa se une a la superficie celular de DR4 y desencadena la apoptosis vía extrínseca, principalmente a través de la activación del iniciador de pro-apoptótica caspasa-8. Sin embargo, los ensayos de fase II mostraron poca o ninguna actividad clínica de agente único MAPA en pacientes con cáncer colorrectal avanzado resistente o cáncer de pulmón de células no pequeñas [10,11]. Se han sugerido varios mecanismos moleculares posibles incluyendo la mutación /defectos en los receptores de muerte, el complejo de señalización inductor de la muerte, capsases, proteínas proapoptóticos o la sobreexpresión de moléculas anti-apoptóticas [12-14]. Por lo tanto, hay una necesidad continua y significativa para desarrollar estrategias aplicables para aumentar la eficacia de Mapa.
hipertermia, un tratamiento a menudo se usa con la perfusión hepática aislada (PHI), maximiza el daño tumor preservando al mismo tiempo el tejido normal circundante [5, 6,15]. El oxaliplatino, un agente quimioterapéutico usado comúnmente para el cáncer de colon, se piensa que es desencadenar la muerte celular principalmente mediante la inducción de aducto platino-DNA [3,16-18]. Anteriormente desarrolló un tratamiento multimodal mediante tratamiento previo con oxaliplatino en combinación con el MAPA y la hipertermia para tratar el cáncer de colon humano [19]. Sin embargo, el PHI entregar altas dosis de quimioterapia o terapia biológica regional requiere una técnica estándar operativa, monitoreo de fugas intraoperatoria continua, y un circuito de bypass veno-venosa externa [20]. Por lo tanto el tratamiento previo con oxaliplatino no es alcanzable en el procedimiento de la PHI en las clínicas, y todos los componentes del procedimiento de la multimodalidad es necesario realizar de forma simultánea.
En este estudio, se investigó el potencial terapéutico de la pauta de tratamiento multimodalidad clínicamente relevante oxaliplatino e hipertermia en combinación con el Mapa en líneas celulares de cáncer de colon humano y las células madre del cáncer de colon. Presentamos aquí que el tratamiento multimodal puede sensibilizar a las células de cáncer de colon humano a la apoptosis inducida por el Mapa de multiples mecanismos moleculares de acción tanto a través de la vía apoptótica intrínseca y la ruta extrínseca.
Materiales y Métodos
Los cultivos de células
células de carcinoma colorrectal humano CX-1, que se obtuvieron de Dr. JM Jessup (Institutos nacionales de Salud) [21], se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco BRL) que contiene 10% de bovino fetal suero (Hyclone). Las líneas de células HCT116 de carcinoma colorrectal humano proporcionado amablemente por el Dr. B. Vogelstein (Universidad Johns Hopkins) se cultivaron en medio 5A de McCoy (Gibco-BRL) que contiene 10% de suero bovino fetal [22]. Las células madre de cáncer de colon humanos, Tu-22, Tu-12 y Tu-21 [23], fueron establecidos por el Dr. E. Lagasse (Universidad de Pittsburgh) y se cultivaron en medio DMEM /F12 (Gibco BRL) que contiene 0,5% de bovino fetal suero (Hyclone) y 1% de insulina, transferrina y selenio (ITS, Fisher Scientific). Todas las células se mantuvieron en un incubador humidificado 37 ° C con 5% de CO
2.
Reactivos y anticuerpos
El oxaliplatino, se obtuvieron MG132, cicloheximida (CHX) y cóctel inhibidor de la proteasa de Sigma Chemical Co. mapatumumab (Mapa) era de Human Genome Sciences (Rockville, MD, EE.UU.). inhibidor de JNK (SP6001125) y G418 eran de Calbiochem. Anti-Flag, anti-caspasa 8, anti-caspasa 9, anti-caspasa 3, anti-ubiquitina, anti-PARP, JNK anti-fosforilada /JNK y el anticuerpo anti-Bcl-XL eran de Señalización Celular. Anti-p-Bcl-XL (S62) de anticuerpos fue de Chemicon /Millipore. anticuerpo anti-FLIP (NF6) era de Enzo Life Sciences. anticuerpo anti-actina fue de Santa Cruz.
Tratamiento
Las células fueron expuestas a la hipertermia (42
° C) en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino durante 1 h, y luego se incubaron a 37
° C durante 3 h o 23 h. Por hipertermia, las células se sellaron con parafilm y se colocaron en un baño de agua circulante (Thomas Scientific), que se mantuvo dentro de 0,02
° C de la temperatura deseada.
Transfección transitoria y transfección estable
Para la transfección transitoria, las células fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen), y se trataron 48 h después de la transfección. Para la transfección estable, las células de forma estable sobreexpresan HA-Bcl-xL de tipo salvaje (WT) o tipos mutantes se prepararon mediante la transfección de células CX-1 con HA-Bcl-XL-WT, HA-Bcl-XL-S62A (Ser62Ala), y HA-Bcl-xL-S62D (Ser62Asp) y se mantuvo en 500 mg /ml de G418. células S62A-Bcl-xL CX-1 se transfectaron con plenti-Flag-FLIP
L y los clones estables se seleccionaron con blasticidina (10 mg /ml). Piscinas de 3 clones se utilizaron en el experimento.
MTS [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) 2H- tetrazolio, MTS] ensayos
p
MTS estudios se llevaron a cabo utilizando el Promega CellTiter 96 Solución acuosa Un Ensayo de proliferación celular (Promega). células CX-1 se cultivaron en placas de 96 pocillos recubiertos con cultivo de tejido y se trataron como se describe en los resultados. Las células se trataron entonces con la solución de metosulfato /fenazina MTS durante 1 hora a 37 ° C. La absorbancia a 490 nm se determinó usando un lector de placa de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas.
Anexina V vinculante
Las células se calentaron en la ausencia o presencia de Mapa y cosechadas por tripsinización, se lavaron con suero medio libre, y se suspenden en tampón de unión (Anexina V-FITC kit de tinción, PharMingen). Esta suspensión de células se tiñeron con anticuerpos Anexina V ratón anti-humano y PI e inmediatamente se analizó mediante citometría de flujo.
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR)
El ARN total se extraído y purificado a partir de células cultivadas utilizando el Kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El RNA se cuantificó mediante la determinación de la absorbancia a 260 nm. Dos g de ARN total de cada muestra fue transcrita invertir en cDNA utilizando la alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit (Life Technologies, Inc.) en un volumen de 20 l. PCR cuantitativa (qPCR) se llevó a cabo usando Applied Biosystems inventariados ensayos TaqMan (20X Primer Mezcla de sondas) correspondiente a CASP8 y el regulador de la apoptosis FADD-como (CFLAR; ensayo ID Hs00153439_m1), y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; ensayo ID Hs02758991_g1 ). Todas las reacciones se llevaron a cabo con 2 X TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems) en un Sistema de PCR de Applied Biosystems StepOne Plus en tiempo real de acuerdo con protocolos estándar.
inmunoprecipitación
resumen, las células fueron se lisaron en tampón de lisis CHAPS con cóctel inhibidor de la proteasa (Calbiochem). 0,5-1 mg de lisado se incubó con 1,5 g de anti-Flag /anticuerpo ubiquitina o IgG de conejo (Santa Cruz) en 4
° C durante la noche, seguido de la adición de perlas de proteína A-agarosa (Santa Cruz) y la rotación a temperatura ambiente durante 2 h seguido de análisis de inmunotransferencia.
El análisis por inmunotransferencia
Las células se lisaron con tampón de lisis de Laemmli y se hirvieron durante 10 min. El contenido de proteína se midió con BCA Protein Assay Reagent (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.), separados por SDS-PAGE y se transfirieron electroforéticamente a membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se bloqueó con leche en polvo desnatada al 5% en PBS-Tween-20 (0,1% v /v) durante 1 h y se incubaron con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 2 h. peroxidasa de rábano picante conjugada anti-conejo o anti-IgG de ratón se utilizó como anticuerpo secundario. proteína inmunorreactiva se visualizó mediante el protocolo de quimioluminiscencia (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, EE.UU.). Las densidades de las bandas fueron analizados mediante la aplicación del gel-pro de la cibernética medios de comunicación. Algunas de las transferencias de Western en los mismos paneles no se hayan producido a partir de los mismos borrones y fueron despojados y se volvió a sondear con anticuerpo anti-actina para normalizar las diferencias en la carga de proteínas para garantizar la igualdad de proteínas de carga.
[
35S ] incorporación de metionina análisis
las células se trataron con medio que contiene 4 Ci de [
35S] -L-metionina y se expusieron a hipertermia (42
° C) en presencia /ausencia de oxaliplatino (10 g /ml) durante 1 h, y después se incubaron a 37
° C durante 3 h. Las células se solubilizaron con 1 ml de NaOH 0,25 N y completamente lisaron pipeteando suavemente. [
35S] metionina incorporación se analizó mediante Wallac 1409 contador de centelleo Líquido (PerkinElmer, MA, EE.UU.). [
35S] niveles de incorporación -L-metionina se calcularon mediante la normalización de la [
35S] -L-metionina conteos por minuto, corregidos para el fondo no específica, a los niveles de proteína total.
Site- mutagénesis dirigida
Lys 106 a Arg (K106R) y las mutaciones K195R del plásmido pCR3.V64-Met-Flag-FLIP
L, que fue un regalo del Dr. Jurg Tschopp (Universidad de Lausana), se introdujeron en el c-FLIP gen
L usando cebadores mutagénicos complementarios totalmente (QuickChange dirigida al sitio kit de mutagénesis de Agilent Technologies). Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos mutagenizantes: sentido 5'-GAGATTGGTGAGGATTTGGATAGATCTG-ATGTGTCCTCATTAAT-3 'y antisentido 5'-ATTAATGAGGACACATCAGATCTAT-CCAAATCCTCACCAATCTC-3' para el mutante K106R, el sentido 5'-CAAGCAGCAATCCA-AAAGAGTCTCAGGGATCCTTCAAAT-3 'y antisentido 5'-ATTTGAAGGATCCCTGAG-ACTCTTTTGGATTGCTGCTTG -3 'para K195R mutante. Los mutantes se confirmaron por análisis de secuencia.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad INSTAT 3 Software (GraphPad Software). Los datos que muestran las comparaciones entre los dos grupos se evaluaron mediante la prueba t de Student. Las comparaciones entre más de dos grupos se realizaron mediante ANOVA con la prueba post hoc apropiado. La significación estadística se marca con asteriscos (*, P & lt; 0,05 y **, p & lt; 0,01).
Resultados
El tratamiento multimodal de oxaliplatino /Mapa /hipertermia activa ambas vías intrínseca y extrínseca en las células de cáncer de colon humano
En este estudio, hemos tratado de desarrollar la terapia multimodal clínicamente relevante para la enfermedad metastásica colorrectal que puede ser entendido por el PHI. Las líneas celulares usadas incluyen: colorrectal metastásico humano HCT116 carcinoma de células y CX-1, las células madre y cáncer de colon humano, Tu-12, Tu-21 y Tu-22, que fueron establecidos por el Dr. E. Lagasse (Universidad de Pittsburgh) desde el hígado de pacientes con cáncer de colon metastásico y se cultivaron dentro de los pasajes 10-30 [23]. Las células madre del cáncer (CSC) son capaces de auto-renovación, son tumorigénicos, y son capaces de producir los linajes heterogéneas de células cancerosas que componen el tumor. CSC no sólo debe estar afiliado a la iniciación del tumor y el crecimiento, pero es probable que sean responsables de la metástasis, así [24,25]. Para investigar el efecto del tratamiento multimodalidad de oxaliplatino citotoxicidad /inducida por hipertermia Mapa /, la viabilidad celular se determinó por el ensayo de MTS. Como se muestra en la Figura 1A y 1B, se observó un efecto sinérgico en oxaliplatino /Mapa /hipertermia en comparación con cualquier otro tratamiento único o tratos bi en ambas líneas celulares (P & lt; 0,01). La Figura 1C muestra claramente que la inducción sinérgica de la muerte apoptótica se produjo durante el tratamiento con oxaliplatino /Mapa /hipertermia. Se obtuvieron resultados similares en las células madre de cáncer de colon humano Tu-12, Tu-21 y Tu-22 (Figura 1F). Estos efectos sinérgicos se debieron a un aumento en la activación de caspasas (Figura 1D). La Figura 1D muestra que 100 ng /ml Mapa resultó en una pequeña cantidad de la caspasa 8 y 3 de activación, y por lo tanto la escisión de PARP (la función de sello de apoptosis). Curiosamente, la hipertermia promueve la activación de caspasa 8, mientras que el oxaliplatino promueve la caspasa 9 de activación. Por otra parte, el efecto sinérgico del tratamiento multimodalidad fue bloqueado por Z-IETD-FMK (caspasa 8 inhibidor), Z-LEHD-FMK (caspasa 9 inhibidor), y Z-DEVD-FMK (caspasa 3 inhibidor) en ambas líneas celulares ( Figura 1E), lo que indica que ambas vías jugaron un papel importante en el efecto sinérgico del tratamiento multimodal.
(a, B) células CX-1 y HCT116 se expusieron a 42 ° C condiciones normothermic o hipertermia () durante 1 h en la presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino y después se incubaron durante 23 horas a 37 ° C en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino. La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de MTS. Las barras de error representan la DS de tres experimentos. Asterisco ** representa una diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,01). las células (C) CX-1 fueron expuestos a hipertermia (42 ° C) durante 1 h en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino y después se incubaron durante 3 horas a 37 ° C en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino. Después del tratamiento, las células se tiñeron con isotiocianato de fluoresceína (FITC) -Annexin V y yoduro de propidio (PI). La apoptosis se detectó mediante el ensayo de citometría de flujo. (D) Después del tratamiento, la escisión de la caspasa 8, caspasa 9, caspasa 3, o PARP se detectó por inmunotransferencia. Actina se utilizó para confirmar la cantidad igual de proteínas cargados en cada carril. (E) células CX-1 y HCT116 se trataron con o sin 20 mM Z-IETD-FMK (caspasa 8 inhibidor), Z-LEHD-FMK (caspasa 9 inhibidor), y Z-DEVD-FMK (caspasa 3 inhibidor) para μmin seguido de oxaliplatino /Mapa /hipertermia y la escisión de PARP se detectó por inmunotransferencia. (F) células madre de cáncer de colon humano, Tu-12, Tu-21 y Tu-22, se expusieron a (42 ° C) Condiciones de normotérmica o hipertermia por 1 h en la presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino a la concentración indicada y después se incubaron durante 23 horas a 37 ° C en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino. PARP se detectó por inmunotransferencia. Actina se utilizó como control de carga.
respuestas a las dosis de oxaliplatino y la hipertermia sobre la apoptosis inducida por Mapa
Hemos observado que como las dosis de Mapa y oxaliplatino aumentaron, la caspasa 8/9 /3 activación de PARP división y se han mejorado, lo que indica que el efecto sinérgico de la apoptosis inducida por el tratamiento multimodal era dependiente de la dosis (Figura 2A). Además, nuestros resultados sugieren que tanto las vías de apoptosis intrínsecos y extrínsecos estaban involucrados en el efecto sinérgico del tratamiento multimodalidad. se obtuvieron datos similares en las células HCT116 (Figura 2B).
(A) CX-1 y (B) las células HCT116 se expusieron a hipertermia (42 ° C) durante 1 h en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino y se incubaron durante 3 horas a 37 ° C en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino. Después del tratamiento, la escisión de la caspasa 8, caspasa 9, caspasa 3, o PARP se detectó por inmunotransferencia. Actina se utilizó para confirmar la cantidad igual de proteínas cargados en cada carril. (C) las células CX-1 fueron expuestos a hipertermia (42 ° C) durante 1 h en presencia /ausencia de 100 ng /ml Mapa y 10 g /oxaliplatino ml y después se incubaron durante 3 horas a 37 ° C en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino. Después del tratamiento, las células se sometieron a inmunotransferencia con anti-fosfo-JNK /JNK, anticuerpos anti-fosfo-Bcl-XL /Bcl-XL y anti-FLIP. (D) células CX-1 fueron expuestos a hipertermia (42 ° C) durante 1 h en presencia /ausencia de mapa (100 ng /ml-1 000 ng /ml) y oxaliplatino (10 mg /ml-100 mg /ml) y se incubaron durante 3 horas a 37 ° C en la presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino. Después del tratamiento, fosfato JNK /JNK, fosfo-Bcl-XL /Bcl-XL y FLIP
L se detectaron por inmunotransferencia. Actina se utilizó para confirmar la cantidad igual de proteínas cargados en cada carril. (E) las células HCT116 se expusieron a hipertermia (42 ° C) durante 1 h en presencia /ausencia de mapa (10 ng /ml-100 ng /ml) y oxaliplatino (10 mg /ml-100 mg /ml) y luego se incubaron durante 3 horas a 37 ° C en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino. Después del tratamiento, fosfato JNK /JNK, fosfo-Bcl-XL /Bcl-XL y FLIP
L se detectaron por inmunotransferencia. Actina se utilizó para confirmar la misma cantidad de proteínas cargados en cada carril.
activación de JNK inducida por el tratamiento multimodalidad, la fosforilación de Bcl-XL y la reducción de c-FLIP
L nivel
Para comprender mejor los mecanismos de cómo las vías intrínseca y extrínseca estaban involucrados en la apoptosis inducida por el tratamiento multimodal, examinamos Bcl-xL, así como c-FLIP. La Figura 2C muestra que no hubo ningún cambio en la cantidad de proteína Bcl-xL, pero la fosforilación de Bcl-xL aumentó de manera espectacular, acompañado por la fosforilación de JNK. Además, el nivel de c-FLIP
L disminuyó significativamente durante el tratamiento multimodalidad en las células CX-1. La figura 2D muestra que JNK se activó y Bcl-xL se fosforiló en la serina 62 de una manera dependiente de la dosis en las células CX-1. Curiosamente, el nivel de c-FLIP
L disminuyó dramáticamente cuando oxaliplatino se combinó con la hipertermia. se obtuvieron datos similares en las células HCT116 (Figura 2E).
La cinética de tratamiento multimodalidad en CX-1 y células HCT116
Hemos observado que el efecto del tratamiento multimodalidad aumentó a medida que pasaba el tiempo en CX-1 (Figura 3A) y células HCT116 (Figura 3B). la activación de JNK alcanzó el máximo a las 4 h después del tratamiento inicial y poco a poco disminuyó durante el tratamiento multimodal. Los datos de inmunotransferencia y gel de imágenes análisis muestran que la fosforilación de Bcl-XL alcanzó el pico de alrededor de 12 h después del tratamiento indica que la activación de JNK fue un evento temprano y podría regular la fosforilación de Bcl-XL. En CX-1 en las células, el nivel de c-FLIP
L se redujo drásticamente en 4 h después del tratamiento de oxaliplatino combinación con la hipertermia, mientras que en las células HT116, alcanzó mínimo 24 h después del tratamiento.
CX -1 (a) y células HCT116 (B) fueron expuestos a hipertermia (42 ° C) las condiciones de 1 h en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino y se incubaron a 37 ° C en presencia /ausencia de Mapa y oxaliplatino para 3 h, 7 h, 11 hy 23 h. Después del tratamiento, la escisión de la caspasa y PARP 8/9/3, fosfato JNK /JNK, fosfo-Bcl-XL /Bcl-XL y FLIP
L se detectaron por inmunotransferencia. Actina se utilizó para confirmar la misma cantidad de proteínas.
El requisito de la activación de JNK y la fosforilación de Bcl-XL en el tratamiento multimodalidad la apoptosis inducida por
inhibidor de JNK SP6001125 parcialmente reducido oxaliplatino /mapa /hipertermia inducida por la escisión de PARP en células CX-1, lo que indica que la vía de JNK fue crucial para la apoptosis inducida por el tratamiento multimodal (Figura 4A). Notablemente, SP6001125 altamente redujo el nivel de la fosforilación de Bcl-xL en las células CX-1, que proporciona una fuerte evidencia de que inducida por el tratamiento multimodalidad fosforilación de Bcl-xL requiere la activación de JNK. Zhao et al. informó de que la activación de JNK media c-FLIP downregulation [26]. Esta posibilidad se examinó en la Figura 4A. Hemos observado que no restauración de c-FLIPL ocurrió durante el tratamiento con SP6001125. Esta observación fue consistente con los informes de otros investigadores [27,28]
.
Las células (A) se trataron previamente con inhibidor de JNK 25 M SP6001125 seguido de oxaliplatino /Mapa /hipertermia y immunoblotted con anti-PARP, anti-fosfo -Bcl-xL y el anticuerpo anti-Bcl-xL. (B) Los transfectantes con el plásmido de control (pcDNA), de tipo salvaje Bcl-XL (Bcl-XL-WT), Ser62 /Ala fosfo-defectuosa mutante Bcl-XL (Bcl-XL-S62A), o Ser62 /Asp fosfato imitar Bcl-xL mutante (Bcl-xL-S62D) fueron tratados con oxaliplatino /Mapa /hipertermia y la inmunotransferencia con anticuerpo anti-PARP o anti-Bcl-xL. Actina se utilizó para confirmar la misma cantidad de proteínas cargados en cada carril.
Para evaluar el efecto de la fosforilación de Bcl-XL en Ser62 en su actividad anti-apoptótica, establecimos celular derivada-CX-1 líneas estable overexpressing de tipo salvaje Bcl-xL (Bcl-xL-WT), Ser62Ala fosfo-defectuosa Bcl-xL mutante (Bcl-xL-S62A), Ser62Asp fosfato imitar Bcl-xL mutante (Bcl-xL-S62D), o el vector vacío correspondiente (pcDNA). Como era de esperar, la sobreexpresión de Bcl-XL-WT impidió oxaliplatino /Mapa /PARP división hipertermia inducida. Curiosamente, la sobreexpresión de Bcl-XL-S62D mejorada de escisión de PARP, mientras que la de Bcl-xL-S62A inhibió la escisión de PARP (Figura 4B). Estos datos sugieren que el nivel de Bcl-XL y su fosforilación en S62 juegan un papel importante en la apoptosis inducida por la multimodalidad.
Reducción de c-FLIP
L nivel siguiente hipertermia y oxaliplatino en el CX-1 células
c-FLIP es el principal inhibidor de la apoptosis vía extrínseca a través de inhibición de la activación de la caspasa-8, y se observó que el nivel de c-FLIP
L se redujo después de hipertermia a 42 ° C durante 1 h en las células CX-1 como se muestra en la Figura 5A. Sin embargo, c-FLIP
L fue restaurado al nivel normal después de 3 h de incubación a 37 ° C, que era consistente con nuestro trabajo previo [24]. Oxaliplatino (10 g /ml, 4H) solo no redujo el nivel de c-FLIP
L. Curiosamente, el nivel de c-FLIP
L se mantuvo a un nivel reducido cuando la hipertermia se combina con oxaliplatino
.
Las células (A) se expusieron a 37 ° C o 42 ° C durante 1 h en presencia /ausencia de 10 mg de oxaliplatino /ml y después se recogieron inmediatamente o 3 h después de incubación a 37 ° C. c-FLIP
L se examinó por análisis de transferencia Western. (B) Las células se expusieron a 37 ° C o 42 ° C durante 1 h en la presencia /ausencia de 10 mg de oxaliplatino /ml y después se incubaron durante 3 horas a 37 ° C. Cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (QRT-PCR) se realizó para medir el nivel relativo de ARNm de c-FLIP. El gráfico de barras que representa los valores medios (± DE) de tres experimentos. (C) Las células se expusieron a 37 ° C o 42 ° C durante 1 h en presencia /ausencia de 10 mg de oxaliplatino /ml y después se incubaron durante 3 horas a 37 ° C. La síntesis de proteínas se midió por [
35S] metionina incorporación. (D) Las células fueron tratadas con 30 mg /ml CHX, o expuestos a la hipertermia en la presencia o ausencia de CHX. Los niveles de c-FLIP
L y actina control de carga se midieron mediante análisis de transferencia Western. (E) Las células se expusieron a la hipertermia durante 30 o 60 min en presencia /ausencia de MG132. muestras de lisados se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-ubiquitina y la proteína G-Sepharose. La FLIP ubiquitinated se detectó por Western blot con el anticuerpo anti-FLIP. (F) Las células fueron transfectadas transitoriamente con 4 g de plásmido que contiene mock, K106R (106 residuo de lisina se sustituyó por arginina), K195R, o de tipo salvaje (WT) c-FLIP
L. Después de 48 h de incubación, las células fueron expuestas a la hipertermia a 42 ° C durante 1 h. El nivel de c-FLIP
L fue detectado por el anticuerpo anti-FLIP. Actina se utilizó como control interno. (G) Las células fueron transfectadas transitoriamente con Bandera de etiquetado c-FLIP
L WT o plásmido K195R; 48 h después, las células se sometieron a la hipertermia a 42 ° C durante 1 h. Los niveles de ubiquitinada c-FLIP
L se detectaron por IP con el anticuerpo anti-Flag, seguido de transferencia de Western usando anticuerpo anti-ubiquitina. La presencia de transfectada c-FLIP
L en los lisados se verificó por transferencia de Western. Actina se muestra como un patrón interno. (H) Las células fueron transfectadas transitoriamente con c-FLIP
L WT, K106R, K195R o plásmido; 48 h después, las células se calentaron a 42 ° C durante 1 h en presencia /ausencia de mapa (100 ng /ml) y oxaliplatino (10 g /ml) y después se incubó a 37
° C durante 3 h. Los lisados que contienen cantidades iguales de proteína se inmunotransfirieron con anti-PARP y el anticuerpo anti-FLIP. Actina se muestra como un patrón interno. (I) Las células fueron transfectadas transitoriamente con c-FLIP
L WT, K106R, K195R o plásmido; 48 h después, las células se calentaron a 42 ° C durante 1 h en ausencia o presencia de mapa (100 ng /ml) y oxaliplatino (10 g /ml), y después se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. La viabilidad celular se analizó mediante el ensayo de MTS. Las barras de error representan la DS de tres experimentos. El asterisco * representa una diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,05).
Quantitative RT-PCR mostró que ninguna inhibición significativa de la expresión de c-FLIP en el nivel de mRNA era evidente después de la hipertermia, oxaliplatino, o la combinación (Figura 5B). Hemos observado en la Figura 5C que el 25% de la síntesis de proteínas se inhibió de hipertermia, mientras que hubo un 46% de inhibición de la síntesis de proteínas en oxaliplatino en combinación con la hipertermia. La figura 5D muestra que la reducción de c-FLIP
L nivel de 42 ° C durante 1 h calefacción sola era más que eso por 30 g de cyclohexmide que inhibe la síntesis de proteínas en un 99% [28]. Estos resultados sugieren que la inhibición de la síntesis de proteínas por sí sola no es un factor importante para la regulación a la baja de FLIP
L por hipertermia. Sorprendentemente, c-FLIP
L se recuperó durante 3 h de la condición normotérmica, lo que indica que el c-FLIP
L se resynthesized. Sin embargo, la recuperación se retrasó por tratamiento con hipertermia y oxaliplatino, como la síntesis de proteínas fue significativamente inhibida.
Figura 5E muestra que la ubiquitinación de endógeno c-FLIP
L aumentó a tratamientos de hipertermia. Por otra parte, el inhibidor de proteasoma MG132 bloquea la degradación de c-FLIP
L, lo que confirma la existencia de degradación proteasomal mediada de la proteína después de la hipertermia.
El software en línea UbPred, que predice los sitios de ubiquitinación de proteínas, mostró que lisina 106 y 195 tenían las puntuaciones más altas. Hemos sustituido 106 y 195 de lisina por arginina y puesto a prueba la estabilidad de los de larga duración c-FLIP
L que lleva la mutación puntual resultante. Como se muestra en la Figura 5F, en el grupo de la transfección, c-FLIP
L K106R era fácilmente degradadas cuando se somete a la hipertermia mientras K195R fue refractario a la degradación por hipertermia. Figura 5G confirma que c-FLIP
L de tipo salvaje (WT) se ubiquitinated eficiente pero no el mutante K195R, que se encontró prácticamente sin ubiquitinación. Hemos observado que el c-FLIP
células que expresan L K195R fueron los más resistentes a la muerte celular por apoptosis inducida por el tratamiento multimodal (Figura 5H y 5I). Estos resultados sugieren que la degradación de la hipertermia mediada transitoria de c-FLIP
L ubiquitinación involucrado de K195, y el mutante K195R resistencia conferida por la muerte apoptótica inducida por tratamiento multimodal.
Abrogación de el efecto sinérgico por la sobreexpresión de c-FLIP
L K195R y Bcl-xL-S62A en el CX-1 y células HCT116
Finalmente, se comparó el efecto del tratamiento multimodal en el CX-1 y células HCT116 sobreexpresa con c-FLIP
L WT, Bcl-xL-S62A, Bcl-xL-S62A + c-FLIP
L WT (Figura 6A y 6B) y c-FLIP
L K195R, Bcl-xL-S62A, Bcl- xL-S62A + c-FLIP
L K195R (Figura 6C y 6D). Hemos observado que la c-FLIP
L WT /K195R o Bcl-XL-S62A bloqueado parcialmente el efecto del tratamiento multimodalidad. Es de destacar que la apoptosis inducida por el tratamiento multimodal fue casi completamente bloqueado por la sobreexpresión de c-FLIP tanto
LWT /K195R y Bcl-XL-S62A (Figura 6A y 6C), lo que indica c-FLIP
L y Bcl xL fueron factores independientes que contribuyen al efecto sinérgico del tratamiento multimodalidad. Se obtuvieron resultados similares en el ensayo de viabilidad celular (Figura 6B y 6D). Nuestros resultados sugieren que (a) la reducción de c-FLIP
nivel de L y (b) la fosforilación de Bcl-XL en Ser62 son ambos responsables de la inducción de la apoptosis sinérgico del tratamiento multimodal clínicamente relevante.
( A) Las células CX-1 de forma estable sobreexpresa con pcDNA, c-FLIP
L WT, Bcl-xL-S62A y c-FLIP
L WT + Bcl-xL-S62A, y tres clones estables se agruparon, y las células se calentaron a 42 ° C durante 1 h en presencia /ausencia de mapa (10 ng /ml) y oxaliplatino (10 g /ml) y después se incubó a 37
° C durante 3 h. La escisión de PARP, y el nivel de c-FLIP
L y Bcl-xL se detectaron por análisis de transferencia Western. viabilidad (B) de la célula se analizó mediante el ensayo de MTS 24 h después del tratamiento. Las barras de error representan la DS de tres experimentos. Asterisco ** representa una diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,01). células HCT116 (C) se transfectaron transitoriamente con la misma cantidad de plásmido que contiene mock, c-FLIP
L K195R, Bcl-xL-S62A y c-FLIP
L K195R + Bcl-xL-S62A. Después de 48 h de incubación, las células se calentaron a 42 ° C durante 1 h en presencia /ausencia de mapa (10 ng /ml) y oxaliplatino (10 g /ml) y después se incubó a 37
° C durante 3 h.