Sistemas
Extracto
Los microARN (miRNA) son cortas ($ ~ $ 22 nucleótidos) ARNs reguladores que pueden modular la expresión génica y son aberrantemente expresado en muchas enfermedades incluyendo el cáncer. Estudios anteriores han demostrado que miRNAs inhiben la traducción y facilitan la degradación de sus ARN mensajeros (ARNm) dirigidos haciéndolos candidatos atractivos para su uso en la terapia del cáncer. Sin embargo, la utilidad clínica potencial de miRNAs en la terapia del cáncer se basa en gran medida de nuestra capacidad para comprender y predecir con exactitud las consecuencias de las fluctuaciones en los niveles de miRNAs en el contexto de las células tumorales complejas. Para evaluar la capacidad de predicción de los modelos actuales, se midieron los niveles de miRNAs y sus ARNm específicos en las células (LCM) láser capturado microdiseccionadas de cáncer de ovario epitelial (CEPI) y se comparan con los niveles presentes en las células epiteliales de la superficie del ovario (OSE). Se encontró que la correlación inversa entre predicho cambios en los niveles de miRNAs y los niveles de mRNA de sus objetivos mantenidos por sólo ~ 11% de los ARNm objetivo previsto. Se demuestra que esta baja correlación inversa entre los cambios en los niveles de miRNAs y sus ARNm diana
in vivo
no es simplemente un artefacto de predicciones inexactas miARN pero la probable consecuencia de procesos celulares indirectos que modulan los efectos reguladores de miRNAs
in vivo.
Nuestros resultados ponen de relieve las complejidades de la regulación mediada por miRNA
in vivo
y la necesidad de comprender la base de estas complejidades en las células cancerosas antes de que el potencial terapéutico de miRNAs se hagan plenamente efectivos .
Visto: Shahab SW, Matyunina LV, Mezencev R, Walker LD, NJ Bowen, Benigno BB, et al. (2011) La evidencia de la complejidad de la regulación microRNA mediada en Cáncer de ovario: Un enfoque de sistemas. PLoS ONE 6 (7): e22508. doi: 10.1371 /journal.pone.0022508
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Marzo, 2011; Aceptado: June 27, 2011; Publicado: 21 de julio 2011
Derechos de Autor © 2011 Shahab et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto del cáncer de Ovario, La Fundación de ovario ciclo, la Fundación de la Familia Robinson, The Nash Fondo de Dotación Willingham Deborah, la Fundación Cascada y Salud de la Mujer OBNET. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son miembros de una clase abundante de pequeños ($ ~ $ 22 NTS) ARN regulador cree que desempeñan un papel importante en una variedad de procesos biológicos y enfermedades en plantas y animales [1]. De reciente interés, es la posible contribución de miRNAs expresadas aberrantemente a la iniciación del cáncer y el desarrollo [2], [3]. Numerosos
in vitro
estudios han demostrado que miRNAs son capaces de inhibir la traducción y /o facilitar la degradación de [4], [5], [6], [7] de sus mRNAs específicos haciéndolos candidatos atractivos para uso potencial en la terapia del cáncer [8], [9]. Sin embargo, la utilidad clínica potencial de miRNAs en la terapia del cáncer se basa en gran medida de nuestra capacidad para comprender y predecir con exactitud las consecuencias de las fluctuaciones en los niveles de miRNAs en el contexto de las células tumorales
in vivo
. La expectativa general de que los cambios en los niveles de miRNAs se correlaciona inversamente (IC) con los cambios en los niveles de mRNA de sus objetivos [10], [11], [12], [13], [14] Aún no se han probado de manera concluyente dentro de el contexto de células tumorales
in vivo.
Por ejemplo, las estimaciones independientes anteriores de los niveles relativos de los genes miARN en los cánceres de ovario controles frente a menudo han sido inconsistentes, posiblemente debido a diferencias en el tipo de muestra (
por ejemplo
., muestras de tejido grueso vs células micro-disecados, etc.), la variabilidad biológica entre los diferentes tipos de cáncer y sub-muestras de pacientes individuales (
por ejemplo
., [15], [16], [17], [18], [19], [20]) o debido a imprecisiones en la predicción de los objetivos de mRNA [21], [22].
en un esfuerzo por reducir la variación que pueden oscurecer las tendencias de importancia biológica, microarray hemos llevado a cabo (Affymetrix) el análisis de miRNAs y mRNAs de las mismas células epiteliales de cáncer de ovario (CEPI) aisladas a partir de muestras de pacientes por captura láser micro-disección (LCM). Hicimos un seguimiento de las diferencias en los niveles de expresión de los genes miARN entre las células del epitelio superficial del ovario (OSE) y la CEPI (obtenidos de ovarios de pacientes normales) con los niveles de expresión de mRNA de sus objetivos putativo según lo determinado por diversos algoritmos de predicción y la validación experimental. Mientras que los cánceres de ovario pueden surgir de o bien el epitelio fimbrial del oviducto o OSE, recientemente se ha demostrado que ambas clases de células son parte de un epitelio de transición de origen común y por lo tanto ya sea puede servir como un precursor de CEPI [23]. Desde OSE se puede cosechar a partir de la superficie de los ovarios con un mínimo de contaminación, que fueron seleccionados como controles apropiados en nuestro estudio
Se encontró que sólo ~ 11% de los objetivos de mRNA se presentan significativa. (P & lt; 0,005) cambios en los niveles de expresión en CEPI relativa a la normalidad eran IC con los cambios en los niveles de sus miRNAs de regulación (p & lt; 0,01). Los niveles de la mayoría (~79%) de ARNm diana se mantuvieron sin cambios en CEPI mientras que el resto (~ 10%) de los objetivos de mRNA muestra los cambios en los niveles de una correlación positiva (PC) con sus respectivos miRNAs regulación. Llegamos a la conclusión de que la baja previsibilidad de miARN efectos reguladores en CEPI aisladas de muestras de pacientes se debe a la complejidad de los genes miARN función
in vivo
.
Resultados
La mayoría de los miRNAs diferencialmente expresado en CEPI relativa a OSE están regulados arriba-
Sin supervisión de la agrupación jerárquica de los perfiles de expresión de miRNAs detectado en el miRChip (Asuragen Inc, Austin, TX) se realizó en tres CEPI y tres muestras de pacientes de OSE (Figura 1; véase la Tabla 1 para obtener información clínica con respecto a las muestras). El miRChip contiene un total de 13.349 sondas incluyendo 467 miRNAs humanos anotados (Sanger miRBase V9.2 [24], [25], [26]), 455 miRNAs anotados en varias otras especies y 12.894 (exploratorio) sondas de predicción, sino como aún no validados /miRNAs anotados. Utilizando un umbral de cambio 2 veces o más, se encontraron 42 sondas de genes miARN que se expresó diferencialmente (p & lt; 0,01) entre las muestras de cáncer y de control. De estos, 33 fueron reguladas y 9 de las reguladas en el CEPI relativa a OSE, incluyendo 12 miRNAs humanos anteriormente anotado (9 hasta reguladas y 3 abajo reguladas). Un mapa de calor de las 42 sondas miARN expresados diferencialmente se presenta en la Figura 2a (las secuencias de genes miARN de estas 42 sondas, registro
2 diferencia entre CEPI y OSE, y los valores de p de la prueba t se proporcionan en la Tabla S1). Para probar de forma independiente de la validez de los diferenciales miARN patrones de expresión determinados por microarray, hemos realizado mediciones de los niveles de genes miARN utilizando reacción cuantitativa (en tiempo real) cadena de la polimerasa (qPCR). Cinco (
miR-141, miR-429, miR-205, miR-383 y miR-320
) de los 12 miRNAs humanos anteriormente anotado demostrado que se expresa diferencialmente por microarrays fueron seleccionados para el análisis qPCR en tres cáncer y tres muestras de control. Los resultados qPCR confirmaron las diferencias detectadas en el estudio de microarrays (Figura 2b).
Una agrupación jerárquica sin supervisión de las muestras CEPI y OSE se realizó utilizando todos los probesets detectados en la matriz Ambion miRChip, independientemente de la expresión diferencial. Probesets con desviación estándar & lt; 0,5 en todas las muestras se retiraron antes de la agrupación. El agrupamiento muestra que las muestras de CEPI y OSE se agrupan en grupos separados, lo que sugiere la varianza entre los grupos es mayor que dentro de los grupos.
(A) La agrupación jerárquica de las muestras normales y de pacientes de cáncer de base en miRNAs expresados diferencialmente entre las células y las células de OSE CEPI (P & lt; 0,01, ≥2fold cambiar). El dendograma de la izquierda muestra que las sondas se agrupan en dos grupos correspondientes a los miRNAs hasta reguladas y las reguladas expresados diferencialmente entre normal y el cáncer. IDs de sondas seleccionadas se dan a la derecha (incluyendo los miRNAs humanos anotados, véase el cuadro S1 para obtener una lista completa). Clave: hsa-miR-x: miRNAs humanos anotados; HSA-asg /cand-x: candidato predijo miRNAs humanos; ppy-:
Pongo pygmaeus
miARN; bración:
C. elegans
miARN. (B) La confirmación de los patrones de expresión de miRNAs seleccionados por qPCR. La expresión relativa de cada uno de los genes miARN en unidades logarítmicas en las células a partir de 3 pacientes con cáncer se muestra en comparación con células de 3 ovarios normales después de la normalización para RNU6B (método ΔΔCt). Estos resultaron ser estadísticamente significativa mediante la herramienta de software de expresión relativa (Rest®) por un método de asignación al azar. La aleatorización se realizó 5000 veces. En consonancia con los resultados de microarrays, miR-141, miR-205 y miR-429 se confirmaron a ser significativamente hasta reguladas en el cáncer, mientras que miR-320 y miR-383 se encontró que eran significativamente las reguladas. Las barras de error representan el error estándar de la media.
A diferencia de algunos estudios anteriores [15], [16], [18], [19], [20], nuestros resultados indican que la mayoría de los miRNAs que muestran diferencias significativas en los niveles de expresión entre CEPI y OSE están regulados en el cáncer de ovario. La base de esta discrepancia es desconocida, pero puede ser debido a diferencias en el tipo de muestra (por ejemplo, muestras de tejido a granel vs células microdiseccionadas, etc.) y /o la variabilidad biológica entre las muestras de pacientes individuales. Nuestra conclusión de que la mayoría de los miRNAs son hasta regulado en el cáncer de ovario es consistente con el hecho de que los genes miARN objetivos son considerablemente enriquecido (distribución hipergeométrica, p & lt; 0,05) entre los ARNm-regulado en nuestras muestras de cáncer, mientras que los genes regulados hasta tienen relativamente unos objetivos miARN (Figura S1; mapas de calor que muestran la agrupación jerárquica de las muestras utilizando todos los probesets se presenta en la Figura S2 y utilizando solamente los ARNm expresados diferencialmente en la figura S3, una lista de todos los ARNm expresados diferencialmente se presenta en la Tabla S2). Una posible explicación biológica de por qué los miRNAs están regulados en CEPI puede radicar en el hecho de que a diferencia de otros tipos de cáncer [27], [28], la transición de la OSE CEPI se postula para involucrar a los cambios de una menos diferenciada a un mayor estado diferenciado [29], [30], [31].
Entre los 12 miRNAs anteriormente anotado que muestran un cambio significativo en los niveles en las muestras de CEPI, miR-205, miR-141 y miR-429 son todos significativamente hasta reguladas consistentes con estudios previos que unen estos miRNAs con el mantenimiento de las células en el estado epitelial diferenciado [32]. De los miRNAs que son regulados hacia abajo en CEPI relativa a OSE, miR-320 y miR-383 se localizan en regiones asociadas con las pérdidas de número de copias de ADN frecuente en el cáncer de ovario [19]. miR-320 ha sido previamente identificado como un inhibidor de la proliferación de carcinoma de pulmón [33]. Su baja regulación en CEPI sugiere que puede actuar como un supresor tumoral en el cáncer de ovario también.
Sólo ~ 11% de los mRNA objetivos previstos de miRNAs expresados diferencialmente entre la CEPI y OSE visualizar el patrón inverso esperado del cambio en la expresión génica
los estudios anteriores han establecido que los miRNAs humanos reprimen la expresión génica mediante el emparejamiento con secuencias complementarias situadas dentro de 'regiones no traducidas (3' UTR) el 3 de ARNm específicos que resultan en la represión de traducción y de la degradación de ARNm [6 ], [7]. Sobre la base de estos resultados, los cambios en los niveles de expresión de miRNAs generalmente se prevé que se correlaciona inversamente con los cambios en los niveles de expresión de sus ARNm específicos [10], [11], [12], [13], [14]. Para probar esta hipótesis en el contexto de las células aisladas a partir de muestras de pacientes, se compararon los cambios en los niveles de los miRNAs humanos anteriormente anotado con los niveles de sus ARNm objetivo previsto en nuestras muestras CEPI relativos a los controles de OSE. Los objetivos de mRNA putativos de estos miRNAs humanos anotado anteriormente se identificaron inicialmente mediante el algoritmo de Miranda [34], [35], [36]. Los resultados indican que sólo ~ 11% de los cambios en la expresión de ARNm entre CEPI y OSE se correlaciona inversamente (IC) con los cambios observados en los niveles de miARN (Tablas 2 & amp; S3). Estudios anteriores de los niveles de miRNAs y sus ARNm específicas en una serie de líneas celulares informaron hallazgos similares [13], [37], [38]. La expresión de la mayoría (sin cambios, Carolina del Norte: ~79%) de los mRNA objetivos previstos no fue significativamente diferente (p & gt; 0,005 y /o doble cambio & lt; 2) entre las muestras CEPI y OSE, mientras que ~ 10% de la mRNAs dirigidos cambios que se muestran una correlación positiva (PC) con sus miRNAs regulación supuestamente.
para determinar si el inesperadamente bajo porcentaje de cambios de CI puede ser un artefacto computacional de nuestro uso del algoritmo de Miranda para predecir los ARNm específicos , se repitió el análisis de forma independiente utilizando los PicTar (www.pictar.org) y TargetScan (www.targetscan.org) miARN algoritmos de predicción de destino. En ambos casos, los resultados fueron consistentes con nuestra constatación inicial de que sólo una minoría de los cambios en la expresión de ARNm entre CEPI y OSE están inversamente correlacionada (IC) con los cambios observados en los niveles de miARN (PicTar: IC 9.4%, PC 10,1%, NC 80,5%; TargetScan: IC 10,4%, 10,3% de PC, Carolina del Norte 79,3%; véanse los cuadros 3, S4 & amp; S5). Para aumentar la rigurosidad de las predicciones de destino, reanalyzed los datos utilizando sólo los genes miARN objetivos que fueron comúnmente predichas por los tres algoritmos (intersección). Hemos encontrado que mediante la superposición de los tres algoritmos de predicción independientes, cada uno de los genes miARN tenían un menor número de objetivos previsto, sin embargo, el uso de estos objetivos comunes previstos, sólo se encontraron ~ 7% de los cambios de ARNm entre CEPI y OSE a estar inversamente correlacionados (IC) con los cambios observados en miARN niveles (Tabla 4). También se analizaron los datos mediante intersecciones de las predicciones de los dos algoritmos en un momento (Miranda + TargetScan, Miranda + PicTar, y PicTar + TargetScan), y de nuevo se encontró que los cambios en niveles de sólo el 6-9% de los objetivos de mRNA fueron predichos inversamente correlacionado con cambios en los niveles de miRNA (Cuadros S6, S7 y S8).
validación experimental se considera actualmente el método más riguroso para validar los genes miARN objetivos [39], [40]. Por lo tanto, para poner a prueba aún más la posibilidad de que la baja correlación inversa entre los cambios en los niveles de miRNA y ARNm diana observados en las muestras de tejido no era más que un reflejo de la limitada precisión de los algoritmos de predicción objetivo, llevamos a cabo una serie de experimentos de transfección utilizando dos miRNAs que eran significativamente hasta reguladas en CEPI (miR-7 y miR-128) para identificar objetivos validada experimentalmente de estos miRNAs en CEPI.
Una serie de experimentos de transfección independientes se llevó a cabo con el miR-7, miR-128 y un conjunto combinado de miRNAs de control negativo en una línea celular de cáncer de ovario bien establecida (EY) [41]. Para determinar la eficacia de nuestras transfecciones (controles positivos), que supervisó los niveles de expresión de dos mRNA objetivos previamente confirmados de miR-7 (epidérmico receptor del factor de crecimiento, EGFR [42] y miR-128 (linfoma B de Mo-MLV región de inserción 1 homólogo .., IMC1 [43]) la regulación los resultados confirman la eficacia de ambas transfecciones (Figura S4) de ARN se recogió de las células después de la transfección y los niveles relativos de ARNm presentes fueron determinados por Affymetrix análisis de microarrays (HG-U133 Plus 2.0; Tablas S9 y S10).
de acuerdo con los resultados de las muestras de tejido CEPI, se encontró que sólo una minoría de mRNA objetivos previstos a reducirse de forma significativa (IC) después de miR-7 o miR-128 transfección (Tabla 5). La predijo mRNA objetivos que fueron significativamente las reguladas en estos experimentos de transfección se tomaron como "validada experimentalmente" mRNA objetivos de miR-7 y miR-128, respectivamente. Utilizando sólo estos objetivos, reanalyzed los datos de microarrays de las muestras de tejido y se encontró que sólo ~ 8% (rango 0-18%) de los objetivos de mRNA "validada experimentalmente" muestra los cambios en la expresión de IC con los cambios en el miR-7 y la expresión de miR-128 en CEPI (Tabla 6). En conjunto nuestros resultados indican que la baja correlación inversa entre los cambios en los niveles de miRNAs y sus ARNm diana
in vivo
no es simplemente un artefacto del objetivo predicciones inexactas, sino más bien un reflejo de la complejidad de la función de los genes miARN en las células cancerosas.
Discusión
es bien sabido que los genes y sus productos de ARNm están sujetos a una amplia gama de controles reglamentarios. La contribución relativa de mal funcionamiento en estos controles para el inicio y la progresión de enfermedades, como el cáncer, puede ser variado y complejo [44]. miRNAs y otros pequeños ARN no codificantes recientemente se han demostrado ser importantes reguladores de la expresión génica, y la interrupción de la expresión de los genes miARN se ha implicado en muchas enfermedades incluyendo el cáncer [3], [45], [46], [47], [ ,,,0],48]. A pesar de que está bien establecido que los miRNAs pueden servir como biomarcadores útiles para el diagnóstico y la estadificación de una variedad de cánceres humanos (por ejemplo, [2], [49], [50]), la forma y el grado en que los miRNAs contribuir a los procesos cáncer subyacente sólo se está empezando a ser entendido [2], [45]. Por ejemplo, la función de regulación de miRNAs se creía inicialmente para operar exclusivamente en el nivel de traducción [51], [52], pero los hallazgos más recientes han demostrado que estos pequeños RNAs de regulación también juegan un papel en la modulación de la estabilidad del ARNm y que estos dos modos de control pueden estar relacionados entre sí [7], [53]. Todavía no descartamos la posibilidad de que la regulación de algunos genes diana puede ocurrir a nivel de traducción sin cambios significativos en el nivel de ARNm, y por lo tanto puede haber sido ignorado en nuestros análisis.
Amplia
in vitro
y
in vivo
estudios previos han demostrado que los miRNAs humanos pueden reprimir la expresión génica mediante el emparejamiento con secuencias localizadas dentro de las regiones 3 'no traducidas de los ARN mensajeros (ARNm específicos) que resulta en la represión de traducción y posterior degradación de ARNm [1 ], [6], [7]. Hasta el momento, hay pocos ejemplos de miRNAs que aumentan la transcripción o traducción de genes diana [54], [55], lo que resulta en una correlación positiva entre miRNAs y mRNAs objetivo. Por lo tanto, una expectativa general llevada a cabo es que los cambios en los niveles de expresión de ARNm se correlaciona inversamente con los cambios en los niveles de sus dirigidos miRNAs [56]. Sin embargo, el hecho de que los miRNAs individuales pueden tener como objetivo múltiples ARNm y que los ARNm individuales pueden ser el blanco de múltiples miRNAs crea el potencial de una red compleja de interacciones en las células cancerosas repletos de una variedad de circuitos de retroalimentación positivos y negativos [57], [58] . Además, el hecho de que miRNAs son bien conocidos a los mRNAs que codifican una variedad de factores de transcripción celulares y otras proteínas reguladoras aumenta la probabilidad de que los efectos de regulación directa de miRNAs pueden ser moduladas por efectos indirectos o "corriente abajo" en el contexto de Células cancerígenas. Esto no quiere decir que los mecanismos demostraron que la base de la regulación de los genes miARN
in vitro ¿Cuáles son inoperantes
in vivo
, sino más bien que las consecuencias funcionales de estos mecanismos pueden estar enmascarados y /o modulada por la complejidades reguladoras que caracterizan a las células cancerosas. La medida en que estas complejidades pueden mitigar nuestra capacidad para predecir con exactitud la consecuencia molecular de los cambios en los niveles de miRNAs en el contexto de las células de cáncer tiene relevancia para el uso potencial de miRNAs en la terapia del cáncer
.
El objetivo de nuestra estudio fue evaluar el grado en que las consecuencias moleculares de cambios en los niveles de genes miARN en las células cancerosas aisladas a partir de tejidos del paciente se pueden predecir a partir de los modelos actuales de la función de los genes miARN. El hecho de que los esfuerzos previos para la obtención de perfiles de expresión de miRNAs y sus objetivos de mRNA se llevaron a cabo típicamente en muestras obtenidas de diferentes pacientes y /o de tejidos mixtos (a granel) han contribuido a resultados inconsistentes (por ejemplo, [15], [16], [17], [18], [19], [20]). En un esfuerzo para reducir la variación experimental, que analizaron los cambios en los niveles de miRNAs y sus mRNAs específicos en las células de cáncer de ovario aislados de los mismos pacientes de LCM. Nuestros resultados indican que sólo ~ 11% de los cambios en los niveles de ARNm son IC con los cambios en los niveles de sus miRNAs regulan en el mismo cáncer de ovario (CEPI) células. Para eliminar la posibilidad de que nuestros resultados no son más que un artefacto de mRNA objetivos identificados incorrectamente de la regulación de los genes miARN, repetimos nuestros análisis utilizando objetivos previsto por una variedad de algoritmos de predicción, así como, objetivos validada experimentalmente en una serie de experimentos de transfección realizada en una línea bien documentada de ovario de células cancerosas (HEY). Nuestros resultados apoyan consistentemente la conclusión de que el CI se esperaba entre los cambios en los niveles de miARN y sus niveles de ARNm diana se produce con poca frecuencia en las células de cáncer de ovario aisladas a partir de muestras de pacientes y que esta baja correlación inversa no es simplemente un artefacto de predicciones inexactas miARN. Por el contrario, nuestros resultados indican que la baja correlación inversa entre los cambios en los niveles de miRNA y sus niveles de ARNm diana son las posibles consecuencias de los procesos celulares que modulan indirectos o enmascaran los efectos reguladores de miRNAs
in vivo
. Nuestros resultados ponen de relieve las complejidades de la regulación mediada por miRNA
in vivo
y la necesidad de comprender mejor la base de estas complejidades en las células cancerosas antes de que el potencial terapéutico de miRNAs se hagan plenamente efectivos.
Materiales Métodos y
Las muestras de tejido
muestras de tumores de ovario se recogieron en el hospital Northside (Atlanta, GA) durante la cirugía y se congelaron en nitrógeno líquido dentro de 1 minuto de la salida de los pacientes. Todas las muestras de tumor de ovario utilizados en este estudio fueron de pacientes con diagnóstico de carcinoma epitelial de ovario seroso papilar. Cepillados de las células epiteliales de ovario normales de superficie (OSE) se conservaron inmediatamente en RNAlater (Ambion, Austin, TX). Se obtuvo el consentimiento del paciente y la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional de Instituto de Tecnología de Georgia y el Hospital Northside. El consentimiento por escrito y el protocolo (# H09227) fueron aprobados por el IRB. información clínica detallada para cada paciente utilizada en este estudio se proporciona en la Tabla 1.
captura láser microdisección (LCM)
tejidos congelados frescos de los tumores se cortaron en secciones de siete micras, aplicado a las diapositivas no cargados, luego se fija en el 75% de etanol durante 30 segundos, se tiñeron y se deshidrataron mediante el HistoGene LCM congelados Sección kit de tinción (Arcturus, Mountain View, CA). LCM se realizó con un sistema de captura de microdisección láser AutoPix automatizado con los tapones de macro CaPSURE (Arcturus). Aproximadamente 10.000 células fueron capturados en cada uno de 5-6 tapas por muestra. miARN fue extraído de células capturadas utilizando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion). Se aisló el ARNm a partir de células de los mismos pacientes utilizando el kit de aislamiento de ARN PicoPure (Arcturus).
La extracción de RNA a partir de células epiteliales superficiales de ovario
Para miARN y qPCR microarray, células epiteliales de ovario normales eran superficiales se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de lisis del kit de aislamiento mirVana miARN (por pequeña enriquecimiento ARN), siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante (Ambion). cDNA para qPCR se sintetizó a partir de ARN (10 ng) utilizando el TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Para mRNA qPCR y microarray extracción de RNA total de OSE se llevó a cabo usando el RNA PicoPure Kit de aislamiento, siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante (Arcturus). Debido a un número limitado de las células recogidas del cepillado epiteliales superficie, OSE ARN fue extraído a partir de 5 pacientes con ovarios no malignas para microarrays de ARNm y a partir de dos
diferentes
conjuntos de tres pacientes con ovarios no malignas para miRNA (una destinados para miARN microarrays, otro para qPCR) (véase el cuadro 1 para más detalles sobre la información del paciente).
cuantitativa (en tiempo real) PCR
El ARN total (10 ng) extraído de LCM capturado ovario las células tumorales y las células normales de OSE se convirtió a cDNA amplificado por qPCR. TaqMan miARN ensayos (Applied Biosystems) se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante para hsa-miR-141, hsa-miR-429, hsa-miR-205, hsa-miR-320, hsa-miR-383 y para el control endógeno RNU6B utilizando el StepOnePlus en tiempo real de la máquina PCR (Applied Biosystems). Las especificidades de cebadores para estos miRNAs se han demostrado previamente [58] - [63] y RNU6B es un control previamente establecido para el tejido de ovario humano (http://www.ambion.com/techlib/tn/151/3.html; http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_044972.pdf). La significación estadística se determinó a través de la herramienta de expresión relativa de Software (REST; [59])
Para ARNm qPCR, el ARN total (1-5 g) extraído de células fue convertido a cDNA utilizando la síntesis de la primera cadena Superíndice III. entonces el sistema (Invitrogen). cDNA fue purificado utilizando el kit de purificación de PCR Qiagen (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. qPCR experimentos se llevaron a cabo para el EGFR, Bmi1 y GAPDH genes utilizando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). los cebadores específicos de secuencia utilizados para los ensayos de verde SYBR son los siguientes: EGFR-forward: GGAGAACTGCCAGAAACTGACC, EGFR-inverso: GCCTGCAGCACACTGGTTG, GAPDH-forward: GGTCTCCTCTGACTTCAACA, GAPDH-inverso: AGCCAAATTCGTTGTCATAC, IMC1-forward: ACTTCATTGATGCCACAACC, IMC1-inverso:. CAGAAGGATGAGCTGCATAA El cebadores EGFR fueron como se ha diseñado por [60] y los cebadores GAPDH fueron como se ha diseñado por [61]. cebadores Bmi1 se obtuvieron de la base de datos de imprimación qPCR RTPrimerDB [62]. las eficiencias de cebadores GAPDH se calculó en ~ 1. la especificidad de la otra cebadores se pueden obtener de la publicaciones /base de datos pertinente. Todas las reacciones de qPCR (por ARNm y miRNA) fueron optimizados con los controles sin plantilla y RT- (menos transcriptasa inversa) controla antes del experimento. GAPDH fue elegida como control endógeno, ya que muestra un cambio mínimo en las líneas transfectadas con el miR-NC y miR-7/128 en microarrays.
Todas las reacciones de qPCR se llevaron a cabo con al menos 2 repeticiones biológica y para cada biológica replicar al menos 3 repeticiones técnica.
cultivo de células y transfecciones celulares
HEY células fueron proporcionados por Gordon B. Mills, Departamento de Biología de Sistemas, la Universidad de Texas, MD Anderson Cancer Center. Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA) suplementado con 10% v /v de suero de ternera fetal inactivado por calor (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 mM L-glutamina (Mediatech), tampón HEPES 10 mM (Mediatech ), penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml). Aproximadamente 12 h antes de la transfección, estas células (duplicados o triplicados por transfección, 1,5 × 10
5 por pocillo) se sembraron en placas de seis pocillos en medio de crecimiento y se deja que se adhieran durante la noche a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera. El día siguiente después de lavar los pocillos con PBS y sustituir el medio de crecimiento con Opti-MEM (Invitrogen), las células fueron transfectadas con los genes miARN [hsa-miR-7 miRIDIAN imitan, miRIDIAN miRNA imitan control negativo#1 (miR-NC, una
C. elegans
miARN, cel-miR-67, con un mínimo confirmado la identidad de secuencia en los seres humanos), o HSA-miR-128 miRIDIAN mímica (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO)] utilizando Lipofectamine 2000 agente de transfección ( Invitrogen) según las instrucciones del fabricante en una concentración final de 25 nM. Las células se incubaron durante cuatro horas en este medio de suero reducido para optimizar la transfección, se lavaron con PBS, y después se incubaron a 37 ° C y 5% de CO
2 durante 44 h (en total 48 h) después de la adición de medio de crecimiento fresco a los pocillos . La eficacia de transfección se estimó a partir del derribo relativa de los objetivos previamente validados (EGFR para miR-7 y el IMC-1 para el miR-128 [42], [43]), con base en las recomendaciones del fabricante de los reactivos ARNip /miARN (Thermo Fisher Científico). experimentos de cultivo celular se llevaron a cabo usando al menos dos de tres réplicas biológicas independientes.
Microarray
microarrays mRNA de tejidos.
Biotina cRNA marcado, se sintetizó, se hibrida con Affymetrix HG U133 Plus 2,0 arrays de oligonucleótidos y se analizaron con un escáner GeneChip 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA).
HEY el aislamiento de ARN celular y ARNm microarrays.
el ARN total fue aislado utilizando el RNeasy Mini ARN kit de aislamiento (QIAGEN, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. La integridad del RNA se verificó utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer (1,8-2,0; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). ARNm se convirtieron en doble cadena (ds) -cDNA y amplificados utilizando Aplausos 3'-Amp System (NuGen, San Carlos, CA). Este ADNc fue luego marcado con biotina y fragmentado por el uso de biotina Encode Module (NuGen). El cDNA marcado se hibrida con Affymetrix HG-U133 Plus arrays de oligonucleótidos 2.0 y se analizaron con un escáner GeneChip 3000 (Affymetrix).
análisis de datos de microarrays
Tejido de análisis de datos de microarrays miARN.
las muestras para nuestros miARN perfiles de estudio fueron tratados por los servicios Asuragen (Austin, TX), de acuerdo con los procedimientos estándar de operación de la empresa. Una costumbre-fabricado Affymetrix GeneChip ® de Ambion fue diseñado para sondas derivadas del miARN Sanger miRBase e informes publicados [24], [25], [26], [63], [64], [65]. señal de fondo se estima a partir de secuencias de la sonda antigenómico proporcionados por Affymetrix y derivados de un conjunto mayor de controles utilizados en la matriz de exón humano Affymetrix. Espiga-en los controles externos de referencia se basa en sondas de control no-miARN que carecen de homología con el genoma humano. Las matrices dentro de un experimento de análisis específico se normalizaron de acuerdo con el método de estabilización varianza se describe en [66]. Se utilizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para determinar las llamadas de detección de la señal de la sonda miARN en comparación con la distribución de señales de GC-contenido coincidente sondas anti-genómicas.
Una prueba t de dos muestras, con la asunción de igualdad de la varianza, se aplicó para las pruebas de hipótesis estadísticas. Esta prueba definida que las sondas se consideran significativamente expresados diferencialmente basa en un valor de p de 0,01 log
2 ≥1 diferencia. Las intensidades de señal de estas sondas fueron expresados diferencialmente puntuación z normalizaron antes de la agrupación jerárquica.
Agrupación jerárquica sin supervisión de las muestras se realizó mediante Spotfire DecisionSite para el análisis de microarrays (DSMA) sobre la base de valores de la señal Z-score transformado de todos los probesets excepto aquellos con desviación estándar & lt; 0,5.