Extracto
La iniciación, el crecimiento, la recidiva y metástasis de cabeza y carcinomas de células escamosas del cuello (CECC) han sido relacionado con el comportamiento de las células madre de cáncer (CSC) que pueden ser identificados por su--aldehído-deshidrogenasa isoforma 1 actividad (ALDH1). Hemos cuantificado y enriquecido ALDH1
+ células dentro de las líneas celulares HNSCC y posteriormente caracterizado sus propiedades fenotípicas y funcionales como la capacidad de invasión y la transición epitelio-mesenquimal (EMT). cultura esferoide enriquecido CSC a partir de cinco líneas celulares CECC por hasta 5 veces. En las células-esferoides derivados (SDC) y la línea celular monocapa derivado de los padres ALDH1, CD44, CD24, E-cadherina, α-SMA y vimentina expresión se comparó mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia, junto con el análisis de la proliferación y el ciclo celular. la actividad de la invasión se evaluó mediante el ensayo de Matrigel y la expresión de stemness relacionados con factores de transcripción (TF) Nanog, Oct3 /4, Sox2 y los genes relacionados con la EMT SNAIL1 y 2, y Twist de PCR en tiempo real. Todas las líneas celulares formaron esferoides que podrían auto-renovarse y estar en serie volverse a inocular. expresión ALDH1 fue significativamente mayor en SDC. ALDH1
+ células mostró un aumento de la formación de colonias. La proporción de células con un putativo CSC marcador constelación de CD44
+ /CD24
- fue altamente variable (0,5% a 96%) en monocapas y esferoides y se superponen en 0% -33% con el CD44
+ /CD24
- /ALDH1
+ subconjunto de células. SDC había un número significativamente mayor actividad invasora. mRNA de los genes relacionados con stemness-Sox2, Nanog, y Oct3 /4 fue significativamente mayor en SDC de todas las líneas celulares. Torsión fue significativamente mayor en dos mientras Snail2 mostró un aumento significativo en uno y una disminución significativa en SDC de dos líneas celulares. SDC tenía una proporción de la fase G0 superior, mostró una expresión de alto nivel de α-SMA y vimentina, pero disminuyó significativamente la expresión de cadherina E. HNSCC líneas albergan potencial CSC, caracterizado por ALDH1 y expresión TF marcador stemness así como propiedades como invasividad, la quiescencia, y EMT. CSC puede enriquecerse mediante técnicas de cultivo independientes de anclaje, que pueden ser importantes para la investigación de su contribución a la resistencia a la terapia, la recurrencia del tumor y la metástasis
Visto:. Chen C, Wei Y, Hummel M, Hoffmann conocimientos tradicionales, bruto M, Kaufmann AM, et al. (2011) La evidencia de la transición epitelio-mesénquima en el cáncer de células madre de cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas. PLoS ONE 6 (1): e16466. doi: 10.1371 /journal.pone.0016466
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Septiembre, 2010; Aceptado 20 de diciembre de 2010; Publicado: 27 de enero 2011
Derechos de Autor © 2011 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado en su totalidad por el dinero de Charité-Universitätsmedizin. No se utilizaron fuentes externas de financiación para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cuentas HNSCC aproximadamente el 6% de todos los casos de cáncer y de alrededor de 650.000 nuevos casos y 350.000 muertes en el mundo cada año [1], [2], [3]. Los avances en el tratamiento han mejorado la calidad de vida, pero las tasas de supervivencia han permanecido sin cambios durante las últimas décadas. La mortalidad de esta enfermedad sigue siendo alta debido al desarrollo de metástasis a distancia y la aparición de recurrencias locales y sistémicas resistentes a la quimioterapia y la radioterapia. Por tanto, es esencial desarrollar un entendimiento más profundo de la biología de esta enfermedad con el fin de desarrollar enfoques terapéuticos más eficaces.
La evidencia reciente ha ido acumulando para apoyar la hipótesis de que los tumores contienen una pequeña subpoblación de células madre de cáncer llamado células (CSC), que exhiben capacidades de auto-renovación y son responsables del mantenimiento y la metástasis tumoral [4]. CD44
+ /CD24
se han propuesto en primer lugar -Cells a exhibir propiedades de CSC en el cáncer de mama [5].
Posteriormente, CD133 se encontró para identificar CSC en los tumores cerebrales [6], carcinoma colorrectal [7], y el carcinoma de páncreas [8]. En CECC, Prince et al. demostró por primera vez que el CD44
+ población de células posee las propiedades de CSC [9], pero los números relativamente altos de estas células (& gt; 5.000 células) fueron necesarios para generar nuevos tumores en ratones inmunodeficientes en la que manifiesten una baja frecuencia de CSC o una baja especificidad de CD44 como CSC-marcador en CECC. Esta última hipótesis está apoyada por la observación de que CD44s y la expresión de CD44v6 no distingue normal a partir de epitelio benigno o maligno de la cabeza y el cuello. CD44s y CD44v6 eran abundantemente presente en la gran mayoría de las células en los tejidos de cabeza y cuello, incluyendo carcinomas [10]. Por lo tanto, la identificación de marcadores más específicos CSC para HNSCC es deseable. Recientemente, se demostró alta aldehído deshidrogenasa 1 (ALDH1, también conocido como ALDH1A1) para identificar la actividad del CSC en la CECC y otros cánceres epiteliales [11], [12], [13], [14], [15]. Sin embargo, en el cáncer de mama ALDH1
+ población muestra una sorprendentemente pequeña superposición con el anteriormente descrito CD44
+ /CD24
- fenotipo de sólo el 0,1-1,2%. Curiosamente, en el cáncer de mama las células que llevan ambos fenotipos parecen ser altamente tumorigénico, siendo capaz de generar tumores de tan sólo 20 células [15]. Queda por determinar si el mismo patrón fenotípico de las células madre en HNSCC está asociado con un potencial tumorigénico similar.
ensayos de esfera no adherentes se utilizan cada vez para evaluar la actividad de células madre en el tejido normal y putativo CSC. El neurosphere es el ensayo esfera mejor estudiado. las células del sistema nervioso central que crecen en superficies no adherentes dan lugar a neuroesferas que tienen la capacidad de auto-renovación y puede, en principio, generar todos los tipos celulares del cerebro [16], [17]. La capacidad de generación repetida de neuroesferas de células individuales es generalmente visto como una prueba de auto-renovación [18]. Recientemente, se ha descrito que las células-esferoide derivado (SDC) de líneas de células de gliosarcoma de rata poseen CSC capacidad [19]. Hasta el momento, se desconoce si los cultivos de esferoides de CECC pueden enriquecer de CSC.
Las células madre hematopoyéticas normales son capaces de auto-renovarse y dar lugar a todos los tipos de células sanguíneas. Son células no dividir o muy lentas y residen dentro de los nichos de la médula ósea en un estado latente. La capacidad para mantener esta condición no se dividen, o en otros términos, la estancia en la fase G0 del ciclo celular, se llama la quiescencia [20]. Se ha propuesto que la CSC comparte muchas cualidades con las células madre normales ya que la gran mayoría de ellos también debe permanecer en reposo y ser capaz de auto-renovación. Debido a que la mayoría de los fármacos anti-cancerosas diana células se dividen activamente (ciclismo), CSC reposo permanecen vivos y puede ser la causa de recaídas y la progresión del cáncer. antígeno Ki-67 se relaciona el ciclo celular prototípico proteína nuclear, expresada por la proliferación de células en todas las fases del ciclo celular activo (G1, S, G2 y la fase M), pero está ausente en células en reposo (G0).
Otra capacidad de CSC es llevar a cabo la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un paso clave durante la embriogénesis [21], [22], [23] y la cicatrización de heridas [24]. La evidencia reciente sugiere que los programas genéticos pertinentes para la EMT son también transitoriamente activadas en los cánceres epiteliales que juegan un papel en la progresión del cáncer, a través del cual los cánceres epiteliales invaden los tejidos y metástasis. Aunque el programa de EMT es necesario para el desarrollo normal, la activación aberrante de EMT contribuye a varias condiciones patológicas, incluyendo la fibrosis y carcinoma progresión [25], [26]. Durante EMT células epiteliales se descomponen célula-célula y célula-matriz contactos extracelular y migran a otros lugares en el cuerpo [27]. Durante la progresión del cáncer, EMT parece proporcionar células cancerosas con la capacidad para infiltrarse en el tejido circundante y, finalmente, metástasis a sitios distantes [28]. Recientemente, se ha informado de que la inducción de EMT en las células epiteliales diferenciadas inmortalizadas humanos mamarias condujo a la adquisición de la CD44
+ /CD24
- stem fenotipo de células [29]. Por otra parte, se ha demostrado que estos putativo CD44
+ /CD24
- CSC aisladas de tejidos de mama humana neoplásicas expresan altos niveles de ARNm que codifican los marcadores de EMT-asociado SNAIL1 (SNA), Snail2, y twist. Los tumores malignos se componen de células cancerosas y células huésped asociados a tumores, siendo este último el aumento del interés recientemente debido a su participación en la invasión tumoral y la metástasis, y la respuesta terapéutica [30], [31]. Los miofibroblastos son los componentes más importantes de la estroma tumoral. Sin embargo, el origen de estas células sigue siendo controvertido hasta ahora. La expresión de alfa-actina de músculo liso (α-SMA) se considera el marcador de los miofibroblastos totalmente diferenciadas. Nuevas pruebas muestra que los miofibroblastos se pueden derivar de las células epiteliales (tumor) a través de EMT [32], [33]. Esta noción está apoyada por la observación de que los esferoides compactos formados por las células de cáncer de ovario en el comportamiento contráctil pantalla ascitis, poseen la capacidad invasora de alta in vitro y la expresión de α-SMA, que también se asocia con una alta capacidad contráctil [34].
En el presente trabajo, hemos probado si las técnicas de cultivo de células independientes de anclaje permiten la generación de esferoide-culturas y si se enriquecieron estas culturas para las células con propiedades funcionales y fenotípicas que caracterizan CSC del CECC. En este caso, aportar pruebas de que los miofibroblastos se pueden derivar de los CECC utilizando un modelo de cultivo celular esferoide que enriquece a las células CSC-al igual que como se caracteriza por un alto porcentaje de positividad ALDH1, quiescencia proliferativa, y la capacidad invasiva.
Resultados
CECC líneas celulares contienen células con capacidad de auto-renovación que forman esferoides tumorales
Varios enfoques diferentes han sido utilizados para identificar CSC. La estrategia utilizada para nuestros experimentos fue el esferoide método de formación de colonias in vitro. Hemos investigado la posibilidad de cinco líneas celulares derivadas de CECC (UD-SCC1, UT-SCC22, UM-SCC11B, UT-SCC9, UT-SCC24A) de anclaje para crecer de forma independiente como esferoides-culturas. Las células se sembraron a una densidad de 20.000 /ml. Después del cultivo in vitro durante 5-10 días en medio libre de suero en condiciones no adherentes, todas las líneas celulares investigadas forman esferoides, que van desde 50 a 500 células por esferoide (Figura 1A). La capacidad de auto-renovación de estos esferoides tumorales se evaluó mediante el método publicado por Ghods et al [19]. Brevemente, se recogieron los esferoides y se disociaron en una suspensión de células que se sembró posteriormente a una densidad clonal de 1.000 células por ml. subspheroids tumorales que van de 20 a 40 células fueron evidentes después de 10 a 14 días (Figura 1B, C). En contraste, los cultivos de células monocapa parentales cultivadas en las mismas condiciones no se formaron esferoides si chapada a esta baja concentración, incluso después de 21 días. Cuando los esferoides se transfirieron de nuevo a un frasco de cultivo de tejido normal recubierto para el cultivo celular monocapa, los esferoides se adhirieron al matraz y las células crecieron fuera de la esferoide y formaron una monocapa confluente. El fenotipo de estas células era idéntica a las líneas celulares parentales (Figura 1D).
cuadros representativos de la línea celular UD-SCC1 se muestran. (A) La primera generación de esferoides. (B) A subspheroid formado después de la siembra a una concentración de 1.000 células /ml. (C) Un esferoide formado en la generación 21a. (D) esferoide adherirse y crecer hasta confluencia después de resiembra en matraces recubiertos de cultivo de tejidos. (E) de la línea celular parental cultivado de forma permanente como un cultivo en monocapa.
Caracterización fenotípica de SDC
La expresión del marcador de células madre putativa ALDH1 en SDC y la línea celular monocapa parental respectivo usado como control se comparó con el CD44
+ /CD24
- expresando población por multicolor FACS-análisis
Curiosamente, todos SDC había un mayor número de células ALDH1 positivos en comparación con las líneas celulares parentales. (Figura 2). La mayor proporción de ALDH1
+ células se encontró en esferoides generados a partir de la línea celular UD-SSC1 (46,4 ± 8,1%), que era 5 veces mayor que la línea celular parental correspondiente (9.4 ± 5.3%).
(A) Representante análisis FACS de dos líneas de células después de la tinción Aldefluor. La comparación de las frecuencias de células ALDH1 positivos en monocapa a SDC y el control DEAB. DEAB es un inhibidor específico de la ALDH1. (B) Los resultados representan la expresión de ALDH1 en células derivadas de cultivos esferoides (columnas cubiertas) en comparación con las células en monocapa (columnas abiertas). ALDH1 expresión del SDC generalmente se mejora de forma significativa (A, B). UD-SCC22, UT-SCC24A, y UM-SCC11B presentan un fenotipo mesenquimal parcial tienen expresión ya relativamente alta ALDH1 en líneas celulares de sus padres. (** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05)
Las células tumorales con un CD44
+ /CD24
- fenotipo se demostrado tener propiedades CSC en una variedad de tumores sólidos. [4]. por lo tanto, también se investigó comparativamente la expresión CD24 y CD44 en líneas celulares CECC y se encontró que la proporción de CD44
+ /CD24
- células es muy variable (0,5-97%). La superposición con ALDH1
+ células fue pequeño (0-2,2%) a excepción de las dos líneas de células UM-SCC11B y UT-SCC22 que tenían un solapamiento de aproximadamente el 33% y fueron compuestas a más del 95% de CD44
+ /CD24
- células. Curiosamente, la proporción de CD44
+ /CD24
- células no se enriqueció consistentemente mediante el método de cultivo de esferoides (Tabla 1). Este resultado plantea la cuestión de lo bien ALDH1 es adecuado para la identificación de células con propiedades de CSC en CECC. Para abordar esta cuestión, ALDH1 células positivas y negativas de los esferoides generados a partir de las líneas celulares UT-SCC9 y UD-SCC1 se separaron por FACS. Posteriormente, se evaluó su capacidad de formación de colonias. UT-SCC9 y UD-SCC1 se eligieron porque, en comparación con las otras líneas celulares que generan más esferoides con un mayor enriquecimiento de ALDH1
+ células. Los datos muestran que ALDH1
+ células pueden formar 3 a 4 veces más clones que ALDH1
- células (Figura 3). la observación microscópica de luz después de 2 semanas mostró que los clones formados por ALDH1
+ células en promedio contenían 197 células (197 ± 47) en comparación con 33 (33 ± 16) de las células en los clones generados a partir de ALDH1
- células (p & lt; 0,01). Nuestros datos también muestran que solo ALDH1
+ células significativamente mejor pueden regenerar un esferoide en un cultivo independiente de anclaje con medio libre de suero complementado con bFGF y EGF (UT-SCC9: 17,1%, UD-SCC1: 19,3%), mientras que en las mismas condiciones individuales ALDH1
- células regeneradas sólo en un caso un esferoide. (Tabla 2, Figura S1).
Dos mil células ALDH1-ordenados se sembraron y después de 14 días, se cuantificaron las colonias que se formaron. El ALDH1
+ subpoblación en líneas celulares UD-SCC1 y UT-SCC9 tienen una mayor eficiencia en la formación clon en comparación con el ALDH1
- subpoblación (** p & lt; 0,01).
En resumen, SDC generado a partir de líneas HNSCC expresar altos niveles del marcador CSC putativo ALDH1, la forma significativamente más clones, que también regenerar significativamente más a menudo en esferoides luego ALDH1
- células y que tienen un solapamiento varía con el CD44
+ /CD24
-.
población
Mostrar SDC aumento de la capacidad de invadir in vitro
Centro para la definición de CSC es la capacidad para iniciar y conducir el crecimiento de la tumor primario y de la invasión y la metástasis. Una estrecha relación entre el porcentaje de células con fenotipo CSC (CD44
+ /CD24
-) en el tumor primario y el desarrollo de la metástasis en el cáncer de mama se informó recientemente [35]. Además, la indicación para el potencial metastásico de las células con CSC-fenotipo en cáncer de mama proviene de la observación de que las células de cáncer de mama detectado en la médula ósea predominantemente mostraron este fenotipo [36].
En analogía con esta observación, preguntó si CSC derivada de las culturas esferoide de CECC mostrar un potencial invasivo similar. Mediante el uso de una cámara de invasión de Matrigel, se comparó la capacidad invasora de las células o bien planteadas en esferoide o monocapa cultura. SDC de las cinco líneas celulares ensayadas mostró un aumento significativo en la capacidad de invasión de 2.1 a 8.6 veces más que el control de los padres (Figura 4).
cámaras de invasión de Matrigel se utilizaron para comparar la capacidad invasora entre las células derivadas de esferoides (eclosionaron columnas) o monocapa (columnas abiertas). SDC de todas las líneas celulares investigados muestran una mayor actividad invasora in vitro que la monocapa de células derivadas. (** P & lt; 0,01, * p & lt; 0,05).
La sobreexpresión de los genes relacionados con stemness-SDC en
Se informó que Oct4, Sox2, y Nanog, que forman una núcleo de auto-organizada de factores de transcripción (TF), mantener la pluripotencia y auto-renovación de las células madre de embriones humanos [37], [38]. Quisimos saber si CSC también comparten esta característica de expresión TF con células madre embrionarias (ES). Para este propósito, que cuantitativamente comparó la expresión del ARNm de estos TF entre SDC y monocapa de células derivadas de los padres. Se encontró que los niveles de mRNA de Oct3 /4, Sox2, y Nanog fueron significativamente superiores en el SDC. Se observó el mayor aumento en UT-SCC22, donde se encontró un aumento de 52 veces en la expresión de Sox2 en esferoides. El cambio más pequeño fue encontrado en UT-SCC9, donde se encontró un aumento de 1,23 veces en Oct3 /4 expresión en esferoides. El TF clave involucrada en la EMT, Snail 1 también se incrementó significativamente en todos los SDC generado a partir de las cinco líneas celulares diferentes CECC. Curiosamente, otros dos TF involucrado en EMT, Snail2 y Twist, mostró un patrón de expresión de acuerdo con el estado de CD24. En UD-SCC1, UT-SCC9, y UT-SCC24A donde la mayoría de las células son CD44
+ /CD24
+, el nivel Snail2 disminuyó en esferoides, mientras que la torcedura no mostraron cambios significativos. Sin embargo, en UT-SSC22 y UM-SCC11B, que se compone de más del 95% de CD44
+ /CD24
- células Snail2 y Twist, mostraron un incremento significativo (Figura 5). Estos resultados implicaban que Snail2 y nivel de expresión de la torcedura se correlacionaron con el fenotipo CD24.
ARN mensajero aislado de esferoides y cultivos en monocapa se cuantificó la expresión de la TF indicado. Se da la relación de expresión en esferoide a monocapa células. Las diferencias significativas fueron * p & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01. El nivel de ARNm de stemness relacionados TF-Nanog, Oct3 /4, Sox2 y se incrementaron notablemente en esferoides. El TF clave en la EMT Snail 1 también se incrementó en todos los esferoides, pero otros dos TF involucrado en la EMT, Snail2 y Twist, mostró un patrón de expresión dependiendo del estado de CD44 /CD24.
SDC son más quiescente de su monocapa derivado de los padres homólogos
Para el análisis del ciclo celular mediante FACS, las líneas celulares de UT-SCC24A, UT-SCC9, UD-SCC1, UT-SCC22, y UM-SCC11B cultivadas en monocapa o esferoide de la cultura se tiñeron para Ki-67-FITC y el ADN se contratiñeron por yoduro de propidio. Las células que residen en el pico G1 /G0 que fueron negativos para Ki-67 tinción fueron considerados para ser la fracción de reposo (fase G0). En todas las líneas celulares, la proporción de células en la fase G0 mostró un aumento altamente significativo en SDC, lo que indica que SDC contiene una mayor proporción de células quiescentes que las células en monocapa derivado parentales (Figura 6).
(A ) doble tinción con Ki-67 y yoduro de propidio para la medición de la proliferación y el contenido de ADN celular. Las células individuales fueron cerrada en FL2-W y FL2-A. contenido de ADN y la expresión Ki-67 se evaluó por citometría de flujo análisis. (B) Las frecuencias de las células en reposo en comparación con SDC como monocapa de células derivadas. En todos los casos, las células derivadas de esferoides contienen un mayor porcentaje muy significativo de células quiescentes (G0). (** P & lt; 0,01).
Una subpoblación de células en esferoides haber adquirido características de miofibroblastos y puede haber sufrido EMT
Los miofibroblastos son componentes del estroma tumoral y puede tener una papel en la construcción de la CSC-nicho, que puede ayudar a preservar la troncalidad del CSC. Sin embargo, aún se desconoce el origen de estas células. Los miofibroblastos producen varios factores, que pueden estimular la proliferación de células de cáncer y facilitar la infiltración de tejido. En la literatura, esferoides no adherentes generados a partir de líneas celulares de cáncer se ha demostrado que contienen putativo CSC. Estos esferoides se podrían mantener en cultivo durante largos períodos de tiempo, lo que implica que los esferoides pueden proporcionar un nicho adecuado para el mantenimiento y crecimiento de CSC. Por lo tanto, nos preguntamos si existen i) miofibroblastos en el nicho creado por esferoides, ii) sean estos miofibroblastos derivados de las células epiteliales del tumor a través de la EMT, y iii) ¿Existen indicios de que este proceso es reversible?
Para hacer frente a este cuestión, se determinó la expresión de marcadores de miofibroblastos vimentina y α-SMA en SDC de las líneas 3 celulares que tienen diferentes niveles de expresión ALDH1 en cultivo en monocapa (bajo: UD-SCC1: 9,4 ± 5,3%, medio: UT-SCC22: 16,9 ± 4,1 %, alto: UT-SCC24A: 25,8 ± 3,0%). Se encontró que las diferentes líneas celulares y SDC generan a partir de estas líneas celulares variadas en la proporción de células que expresan vimentina y α-SMA (Tabla 3). UD-SCC1 no mostró células que expresan y débil (12,5 ± 2,5%) La expresión de vimentina de las células en el cultivo monocapa α-SMA. En contraste, las células en monocapa derivado de UT-SCC24A (Figura 7) y UT-SCC22 tenían una frecuencia relativamente alta de vimentina y α-SMA células que expresan lo que indica que estas líneas celulares tienen ambas características epiteliales y mesenquimales. Curiosamente, estas dos líneas celulares tienen un relativamente alto porcentaje de células en los cultivos en monocapa que son ALDH1 positivo (Tabla 3). Sin embargo, como cultivos de esferoides, todas las líneas celulares contenían más células α-SMA y vimentina positivas que las líneas celulares en monocapa parental correspondientes.
(A) La tinción de inmunofluorescencia de la monocapa (A1-3 y B1-3) y esferoide (C1-3 y D1-3) los cultivos de UT-SCC24A con anticuerpos dirigidos contra α-SMA (verde) y vimentina (rojo). Todo el SDC (panel C y D) muestran altos niveles de los marcadores mesenquimales a-SMA y vimentina en comparación con sus homólogos en monocapa. (B) Análisis de la expresión de E-cadherina por FACS. En comparación con sus homólogos en monocapa, esferoides mostró disminución de expresión de E-cadherina; dos poblaciones de células derivadas de UT-SSC24A se pueden separar de acuerdo con el nivel de expresión de E-cadherina, que indica que el SDC ha adquirido características miofibroblastos por la EMT.
EMT está también acompañado de la pérdida de los contactos célula-célula a las células epiteliales, que se caracteriza por una baja regulación de la expresión de E-cadherina. El número de E-cadherina en las células que expresan SDC y monocapas se cuantificó mediante FACS (Figura 7, Tabla 3). El SDC mostró un aumento significativo en el porcentaje de E-cadherina negativos a células que expresan bajos en comparación con sus homólogos monocapa derivados, lo que indica la pérdida de adhesión celular en esta subpoblación.
Por último, también a prueba la re-adhesión de esferoides de plástico de cultivo. Curiosamente, cuando los esferoides unidos al matraz y comenzaron a crecer como un cultivo en monocapa, la α-SMA y el nivel de vimentina disminuyó, y la mayoría de las células que crecieron a partir de los esferoides teñidas negativo para estos dos marcadores (Figura 8).
(a-C) imágenes mediante microscopía óptica de contraste de fases con forma esferoides UD-SCC1 re-colocación para cubrir las diapositivas durante el proceso de re-crecimiento a un fenotipo monocapa. (A) 24 h después de la reinserción, algunas células de huso como crecen hacia fuera de esferoides adheridas. (B) 72 h después de la reinserción, la mayor parte de la forma de las células unidas 'se parece a su homólogo monocapa parental (C). (D-E) la tinción de inmunofluorescencia indirecta de esferoides, adosada después de 24 h se tiñeron con DAPI (D1, E1), α-SMA (D2; verde), y vimentina (E2; rojo). Imágenes D3 y E3 muestran la superposición con la tinción nuclear. Las flechas representan las células outgrowing que irradian desde el esferoide. La expresión de α-SMA y vimentina disminuyó rebasar a las células (flechas) después de la reinserción y la mayor parte de la tinción se limita a esferoides mientras que la mayoría de las células cultivadas a partir de esferoides se mancha.
Discusión
se han hecho
En la biología del tumor muchos esfuerzos para explicar las características embrionarias, de células de cáncer transformadas. La capacidad de CSC para reconstruir el tumor de una sola célula podría explicar muchas de las diferencias que discriminan a las células tumorales de células somáticas diferenciadas como la inmortalidad, la quietud, la invasión que conduce a la metástasis y la recurrencia después del tratamiento. Prince et al [9], demostraron que una población minoritaria de CD44
+ células HNSCC poseen características CSC, lo que podría dar lugar a nuevos tumores in vivo (≈5,000 células inyectadas). Mack y sus colegas cuestionaron el uso de CD44 como un marcador CSC específico en HNSCC desde CD44 se expresa abundantemente en la mayoría de las células tumorales dentro de HNSCC (60% -100%) y por lo tanto no podría ser utilizado para distinguir normal a partir de epitelio benigno o maligno de la cabeza y el cuello [10]. ALDH1 ha demostrado recientemente ser un marcador más adecuado para identificar putativo CSC de HNSCC y otros cánceres epiteliales [11], [12], [13], [14], [15]. En HNSCC, Chen et al mostraron que 3000 ALDH1
+ células HNSCC de cinco pacientes en ratones xenotransplantado dieron como resultado en todos los casos en la generación de tumores visibles 6 semanas después de la inyección, mientras que 10
4 ALDH1
- células fallaron para generar tumores. [12], [39]. Se describe un método para la propagación y el enriquecimiento de ALDH1
+ cultivos de células de líneas celulares CECC. Las características similares a células madre de estas células se analizaron mediante la comparación de la expresión del antígeno de superficie y la expresión de TF embrionario así como las características funcionales de las líneas de células monocapa de los padres. La observación de que esferoide-cultivos no consisten en una población de células homogénea provocó más subanálisis que revelaron una población de células con expresión de EMT-marcadores. Esto puede indicar que estas células tienen un EMT-programa activado y demuestra un potencial estrecha relación entre el CSC y células con un programa de EMT activado que puede haber derivado de la CSC.
Esferoides son tridimensionales clusters (esféricas) de células tumorales cultivadas a partir de uno o varios clones de células. En comparación con los tiempos de duplicación de células medidos en cultivo en monocapa, la tasa y el patrón de crecimiento esferoide in vitro mejores correspondencias de la observada en los tumores in vivo [40]. el crecimiento independiente del anclaje se ha demostrado que ser una propiedad compartida por células de tejido normal que exhiben propiedades de células madre [41]. También CSC deriva de melanoma [42], cáncer de mama [43], y gliosarcoma [19] fueron capaces de ser propagadas de anclaje independiente y mostrar el fenotipo de esferoides no adherentes.
Como se ejemplifica en el cáncer de mama por ejemplo, putativo CSC (CD44
+ /CD24
-) se pueden enriquecer in vitro mediante el aislamiento de mammospheres de cultivos en suspensión [43], [44]. En nuestro estudio, encontramos que la frecuencia de CD44
+ /CD24
- células en líneas HNSCC a ser muy variable (de 0,5% a 97%). Por otra parte, no podían ser enriquecidas mediante el cultivo de esferoides. Por el contrario, no se encontraron células positivas ALDH1 ser altamente enriquecido en cultivos de esferoides de las cinco líneas celulares CECC. Si se sembraron a una densitiy muy baja, FACS ALDH1
+ células formadas significativamente más colonias después de la ALDH
- población, lo que indica una mayor capacidad proliferativa de esta subpoblación. Otros han demostrado, que ALDH1
+ o ALDH1
+ /CD44
+ /CD24
- las poblaciones de células aisladas de CECC-pacientes tienen un mayor potencial tumorigénico luego ALDH1
- células incluso si eran CD44
24
- si xwnotransplantado en ratones [12]
El cáncer y las células madre normales (SC) comparten propiedades proliferativas de auto-renovación, la quietud y la expresión de factores de transcripción (TF. ). Chickarmane et al. [45] estableció un ordenador de modelo para describir las combinaciones de factores de transcripción clave en SC y los altos niveles definidos de Oct3 /4, Sox2, y Nanog. Por otra parte, Ji et al. [46] compararon el papel de Oct3 /4 y Nanog en transformado (t-hPSCs), y las células madre pluripotentes humanas normales (hPSCs). A diferencia de lo normal SC, auto-renovación y la supervivencia de t-hPSCs se encontró que era independiente de Oct3 /4 expresión. Por el contrario, desmontables genética de Nanog causó la pérdida completa de la auto-renovación de forma concomitante con la apoptosis en las camisetas hPSCs. En nuestro estudio, la expresión de Oct3 /4, Sox2, y Nanog fue hasta reguladas en la COSUDE en las líneas celulares derivadas de cinco HNSCC. Esto implica que la COSUDE puede tener propiedades de células madre.
Los estudios que se ocupan de perfiles de expresión génica in vivo utilizando células invasoras o las células sometidas a EMT in vitro, reveló un interruptor de un estado proliferativo a un fenotipo invasivo. De acuerdo a esta observación, el marcador de proliferación celular Ki-67 se ha demostrado que la etiqueta sólo una pequeña minoría de las células en la parte delantera invasivo en comparación con la parte central más diferenciado del tumor, lo que sugiere que las células tumorales no proliferativas que han escapado la masa tumoral podría tener potencial metastásico [47]. En nuestro estudio, hemos encontrado que SDC había una mayor proporción de células Ki-67 negativos en comparación con los cultivos monocapa correspondientes. Esto indica que SDC son más quiescente de células derivadas de monocapa. También se encontró que la COSUDE tiene una mayor capacidad de invasión, lo que implica que estas células pueden tener una mayor capacidad de hacer metástasis.
Los miofibroblastos son un tipo de células mesenquimales que juega un papel clave en la invasión tumoral y la metástasis y la respuesta terapéutica. Pueden producir varios factores que pueden estimular la proliferación de células de cáncer y facilitar su infiltración [31]. Sin embargo, el origen de estas miofibroblastos no está claro. EMT se ha informado a desempeñar un papel importante en la iniciación de CSC [29]. En este estudio, hemos demostrado que las células parecidas a miofibroblastos son una subpoblación de SDC. Estos esferoides derivan exclusivamente de las células tumorales clonadas. Por lo tanto, puede concluirse que los miofibroblastos sólo podían salir de las células cancerosas epiteliales mediante la alteración del epitelio a un fenotipo mesenquimal través de EMT. Más importante, ya que nos encontramos, que más del 90% de SDC tiñe positivo para α-SMA y vimentina, mientras que el porcentaje de ALDH1
+ células varió del 37% al 46,4%. Una disminución significativa de la expresión de E-cadherina se pudo demostrar en el SDC, lo que indica una reducción del contacto célula-célula en cultivos de esferoides. Estas expresiones marcadores fueron reversibles en condiciones de cultivo, donde esferoides podrían adherirse y células crecieron radialmente hacia fuera para formar una monocapa.