Extracto
Objetivo
En las células de cáncer de próstata humano, una agonista selectivo Epac, 8-CPT-2Me-cAMP, regula al alza la proliferación celular y la supervivencia a través de la activación de Ras-MAPK y PI- cascadas-3-quinasa Akt mTOR señalización. Aquí examinamos el papel de los mediadores de la inflamación en la proliferación celular inducida por Epac1 mediante la determinación de la expresión de los marcadores proinflamatorios p-cPLA2, la COX-2 y PGE
2 en células de cáncer de próstata tratados con 8-CPT-2Me- cAMP.
Métodos
Hemos empleado los inhibidores de la COX-2, mTORC1 y mTORC2 para sondear las vías dependiente de AMP cíclico en células de cáncer de próstata humano. IARN Epac1, Raptor, y Rictor también fue empleada en estos estudios.
Resultados
tratamiento de 8 CPT-2Me-cAMP causó un aumento 2-2,5 veces de p-cPLA2
S505, la COX-2, y PGE
2 niveles en líneas celulares de cáncer de próstata humano. El pretratamiento de las células con el inhibidor de la COX-2 SC-58125 o el antagonista de EP4 AH-23848, o con un inhibidor de mTORC1 y mTORC2, Torin1, redujo significativamente el aumento Epac1 dependiente de p-cPLA2 y COX-2, p-S6 -kinase
T389, y p-AKT
S473. Además, Epac1 inducida de proteínas y la síntesis de ADN se redujeron en gran medida de pretratamiento de las células con inhibidores de la COX-2, ya sea, EP4, o mTOR. La transfección de células de cáncer de próstata con Epac1 dsRNA, Raptor ARN de doble cadena, o Rictor dsRNA redujo profundamente aumenta Epac1-dependientes en p-cPLA2 y COX-2.
Conclusión
Se demuestra que Epac1, una aguas abajo efector de cAMP, funciona como un modulador de pro-inflamatoria en células de cáncer de próstata y promueve la proliferación celular y la supervivencia por la regulación positiva de Ras-MAPK, y la señalización de PI 3-quinasa Akt-mTOR
Visto:. Misra Reino Unido, Pizzo SV (2013) La evidencia de un Pro-proliferativa bucle de realimentación en el cáncer de próstata: El papel de Epac1 y COX-2 dependiente de Caminos. PLoS ONE 8 (4): e63150. doi: 10.1371 /journal.pone.0063150
Editor: Irina U. Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Enero, 2013; Aceptado: March 29, 2013; Publicado: 30 de abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Misra, Pizzo. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
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Introducción
El cáncer de próstata es el tumor maligno más frecuentemente diagnosticado de los hombres [1]. Hay varios factores que promueven el crecimiento y la progresión del cáncer de próstata. Existe una asociación conocida entre la adquisición de crecimiento independiente de andrógenos y una potencialmente mayor probabilidad de metástasis [2]. También hay evidencia creciente de que los cambios inflamatorios en los tumores de próstata pueden promover el crecimiento [3] - [8]. Aproximadamente el 15-20% de todas las muertes por cáncer en todo el mundo están vinculados a la infección y la inflamación [9]. Mientras que estas muertes se pueden atribuir principalmente a estos procesos, patológicos, molecular, y los estudios epidemiológicos apoyan la hipótesis de que la inflamación crónica está vinculada a la progresión del cáncer [10]. El microambiente inflamatorio de los tumores se caracteriza por la presencia de leucocitos de acogida tanto en el estroma y tumorales áreas de apoyo [11]. Además, el medio contiene tumor mediadores inflamatorios tales como citoquinas, quimioquinas, especies reactivas de oxígeno, y las prostaglandinas [3] - [8]. El desarrollo del cáncer en la presencia de inflamación crónica implica la ciclooxigenasa-2 (COX-2), y la activación de varios factores de transcripción NFkB incluyendo, STAT3, activador de la proteína-1, y la hipoxia 1α de factores inducibles [3] - [8].
prostaglandinas y los leucotrienos son moduladores clave que median la interferencia entre células epiteliales y sus células del estroma que rodean [3] - [7]. El ácido araquidónico (AA) es un ingrediente importante de la grasa animal y los lípidos biológicamente activos derivados de este sustrato tiene un papel crucial en la inflamación crónica y el cáncer. Tras la estimulación celular, AA es liberado de los fosfolípidos de membrana por p-cPLA2 y luego se convierte a diferentes prostaglandinas (PGs) por enzimas específicas [6], [12]. COX-2 es la isoforma inducible de la enzima limitante de la velocidad que convierte AA en prostaglandinas proinflamatorias. Entre estos PGE
2 juega un papel preponderante en la promoción del crecimiento del tumor. PGE
2 eleva la expresión de la proteína antiapoptótica Bcl2 y activa la generación de AMPc [13]. PGE
2 aumenta la expresión de EPAC, Rap1 de activación y fosforilación de Akt [14], [15]. En condiciones normales, la COX-2 expresión es baja o no se detecta en la mayoría de los tejidos; sin embargo, su sobreexpresión junto con la activación de PLA2 citosólica por fosforilación es una característica de las reacciones inflamatorias [16]. Varias vías de transducción de señales regulan COX-2 incluyendo la expresión de genes Ras-MAPK, PKA, PKC y [17] - [20]. La sobreexpresión de COX-2 se produce en mama, pulmón, colon, y cánceres de próstata [3] - [8].
in vitro
, líneas de cáncer de próstata humano PC-3, DU145, y LNCaP expresan la COX-2 [6], [12]. La inhibición de la COX-2 ralentiza la proliferación y /o regula al alza la apoptosis tanto en cultivos de células de cáncer de próstata humano andrógeno-dependientes e independientes. El tratamiento de las células LNCaP con el NS398 inhibidor de COX-2 o celecoxib induce apoptosis y disminuye la expresión de Bcl2,
in vivo, España y la inhibición de Cox-2 suprime la invasividad de DU-145 y las células PC-3 [12 ]. El tratamiento de ratones PC-3-tumor de cojinete con NS-398 suprime la proliferación de células tumorales e induce la regresión del tumor [21]. Un efecto adicional es que los inhibidores de COX-2 suprimen la regulación positiva de VEGF que es importante para la angiogénesis del tumor [3] - [7], [12]. La inflamación asociada a la agresividad histológica en los cánceres de próstata se correlaciona con un aumento en los niveles de PSA [22]. En los ensayos clínicos de pacientes con cáncer de próstata, los inhibidores de la COX-2 causan una disminución en los niveles de antígeno prostático específico (PSA) y de células tumorales tiempo de duplicación. Además, la COX-2 de activación y aumento de los niveles de PGE
2 se producen en pacientes tumorales [23] - [26]. PGE
2 actúa a través de cuatro receptores de la superficie celular conocidas como EP1, EP2, EP3, EP4 y [27] - [31].
PGE
2 receptores expresados por líneas de cáncer de próstata humano son de la EP2 y EP4 subtipos [28]. La unión de PGE
2 a EP2 está acoplado a proteínas G que activan la adenilato ciclasa que conduce a un aumento de cAMP intracelular. Esto activa quinasas tales como PKA, EPAC, PI 3-quinasa, y GSKβ3. PGE
2 aumenta ARNm del receptor EP2, aumenta los niveles de cAMP, y aumenta la proliferación celular. Expresión de EP2 y EP4 receptores se incrementa significativamente durante la progresión del cáncer de próstata y la expresión ectópica de estos receptores en las células LNCaP aumenta la producción de PSA [32]
.
El objetivo de mamífero de la rapamicina (mTOR) es una Ser /Thr quinasa que integra las señales de los estímulos externos [33] - [39] regula muchos procesos, incluyendo la proliferación celular. existe mTOR en dos complejos distintos, mTOR1 y mTORC2. Varios estudios recientes demuestran que los PGE
2 regula al alza mTORC1 y la señalización mTORC2. Por ejemplo, la supervivencia de las células endoteliales
2 mediada por PGE está regulada por mTORC2 [40]. PGE
quimiotaxis mediada-2 y la liberación de quimioquinas a partir de mastocitos está regulada por la activación mTORC2 y esto se reduce por pretratamiento de las células con el inhibidor del sitio activo mTOR Torin1 [41]. Por otra parte, la inhibición de la COX-2 y mTOR muestra efectos antitumorales directos e indirectos en los cánceres, y tanto el celecoxib y rapamicina provoca la inhibición del crecimiento tumoral significativa [42]. mTORC1 además de mTOR, contiene la proteína reguladora asociada de mTOR (Raptor), y un grupo de otras proteínas reguladoras [33] - [39]. Raptor regula el montaje de mTORC1, el reclutamiento de los sustratos de quinasa, y la localización subcelular de mTORC1. Akt se activa por fosforilación mTORC1 directamente el complejo TSC1 /TSC2 de ese modo la inhibición de su actividad y la liberación de GAP Rheb unida a GTP para activar mTORC1 [33] - [39]. Cuando se activa, mTORC1 fosforila dos reguladores principales de la traducción del ARNm y la génesis del ribosoma, p70 S6 quinasa (S6-quinasa) y 4EBP1, estimulando de este modo la síntesis de proteínas [33] - [39]. El complejo mTORC2, además de mTOR, contiene compañero Raptor-independiente de mTOR (Rictor) y otras proteínas reguladoras. mTORC1 y mTORC2 fosforilan diversos sustratos para regular las funciones celulares distintos. mTORC1 estimula la proliferación celular mediante el aumento de iniciación de la traducción dependiente de la cubierta que está mediada por sus dos principales objetivos corriente abajo S6 quinasa y 4EBP. mTORC2 es insensible al tratamiento agudo con rapamicina y regula muchos procesos, incluyendo la proliferación celular y la supervivencia, mediante la fosforilación de quinasas, tales como Akt, SG-quinasa, y PKC [33] - [39]. La pérdida o inactivación de los supresores de tumores tales como p53, LKB1, PTEN y TSC1 /2, que antagonizan la activación de PI-3-quinasa dependiente de mTORC1, pueden promover la tumorigénesis a través de una mayor señalización [33] - [39]. Aumento de los niveles y /o fosforilación de abajo objetivos de mTORC1 se producen en diversas neoplasias humanas y se correlacionan con el comportamiento agresivo del tumor y mal pronóstico [33] - [39]. actividad mTORC2 es necesaria para el desarrollo de cáncer de próstata causada por la eliminación PTEN [43].
cAMP regula una gran variedad de procesos, incluyendo la proliferación y la apoptosis a través de los efectores corriente abajo, incluyendo PKA. El efecto de cAMP es idiosincrásica y puede inhibir o estimular la proliferación celular de una manera dependiente de PKA o independiente de PKA [44], [45]. En las células donde cAMP estimula la proliferación celular de una manera independiente de PKA, cAMP activa Rap1 través Epac [45] - [48]. Aquí los efectos de cAMP están mediadas por la señalización PI 3-kinase /Akt [45] - [48]. El tratamiento de las células del cáncer de próstata con el agonista EPAC 8-CPT-2Me-cAMP regula al alza la expresión Epac1, la activación Rap1, la activación de MAPK, la fosforilación de Akt en T308 y S473 en un PI 3-quinasa dependiente y la activación mTORC1 y mTORC2 a juzgar por la fosforilación de S6 -kinase en T389, T37 en 4EBP1 /36 y Akt en los residuos S473, respectivamente [47],. Silenciamiento de la expresión Epac1 por RNAi o tratamiento previo con PI 3-quinasa o inhibidores de mTOR suprime la regulación al alza de 8 CPT-2Me-cAMP inducida por la activación Epac1 de MAPK, mTORC1, y la señalización mTORC2, y en última instancia, el ADN y la síntesis de proteínas [47], [48 ]. Epac la producción de cAMP parejas de Rap1 y PI 3-quinasa activación. Rap1, que a menudo se eleva en líneas celulares de cáncer de próstata altamente metastáticas, regula las señales implicadas en la proliferación celular, la supervivencia y metástasis [49]. Epac1 es upregulated después de la inflamación y juega un papel crítico en la activación de PKC dependiente de PGE
2 de señalización a través de la activación de Rap1 [50].
Como se ha revisado anteriormente, la inflamación crónica promueve la iniciación del tumor, la proliferación, y metástasis upregulating la COX-2-PGE
2-cAMP cascada de señalización. 8-CPT-2Me-cAMP, un análogo específico de cAMP, se une a Epac1, pero no PKA. En las células de cáncer de próstata, este análogo provoca la regulación positiva de Epac1, Rap1GTP, la síntesis de proteínas, la síntesis de ADN, y MAPK, y PI de señalización 3-quinasa Akt-mTORC1-mTORC2. Como consecuencia, las proteínas y la síntesis de ADN se estimulan. Estos efectos se redujeron regulado por el tratamiento previo de las células con inhibidores de MAPK, PI 3-quinasa, mTORC1, o que se dirigen a RNAis Epac1, Raptor, o Rictor [47], [48]. Aquí consideramos la hipótesis de que las funciones de Epac1 como un mediador inflamatorio en cáncer de próstata mediante la promoción de la proliferación celular y la supervivencia. Hemos investigado la regulación de los marcadores proinflamatorios p-cPLA2, la COX-2 y PGE
2 en tres líneas celulares de cáncer de próstata humanas tratadas con 8-CPT-2Me-cAMP. El pretratamiento de las células con inhibidores de la COX-2, un inhibidor de mTORC1 y mTORC2, o la transfección de células con Epac1 dsRNA, Raptor dsRNA, o Rictor dsRNA regulada hacia abajo de inducción 8-CPT-2Me-cAMP de p-cPLA2 y COX-2. proliferación de células cancerosas también fue suprimida. Así, mientras PGE
2 regula la producción de cAMP y EPAC-activación, la activación Epac también da lugar a la COX-2 dependiente de PGE
2 de producción. El resultado neto es un proceso cíclico autocrino-como conducir la proliferación de células de cáncer de próstata a través de la regulación positiva de Ras-MAPK y PI 3-quinasa de señalización Akt-mTOR-.
Materiales y Métodos
Los medios de cultivo se adquirieron de Invitrogen. 8-CPT-2Me-cAMP fue adquirido de Axxora LLC (San Diego, CA). Los anticuerpos contra mTOR, p-Akt
S473, Akt1, S6-quinasa, p-S6-quinasa
T389, p-cPLA2
Ser505 y cPLA2 se adquirieron de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos contra Epac1, COX-2, Raptor, Rictor, EP2, EP4 y se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos anti-actina se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). [
3H] timidina (actividad específica 174 Ci /mmol y [
3H] leucina (actividad específica 115,4 Ci /mmol) se obtuvieron de Perkin-Elmer Life Sciences. Todos los otros materiales utilizados eran de grado analítico y se adquirieron a nivel local. COX-2 inhibidor de SC-58125 o el antagonista de EP4 AH23848 se adquirieron de Caymon (Ann Arbor, MI) y Torin1 se adquirió de Tocris Biosciences (Minneapolis, MN).
líneas celulares de cáncer de próstata humano
en este estudio, se emplearon tres líneas celulares de cáncer de próstata humano, 1-LN, DU145 y PC-3. Como se ha descrito anteriormente [51], la línea celular de cáncer de próstata 1-LN altamente metastásico se obtuvo en esta institución de una metástasis de las células metastásicas menos PC-3 en ratones desnudos y fue una especie de regalo del Dr. Philip Walther (Duke University Medical Center, Durham, Carolina del Norte). Estas células están disponibles bajo petición. DU-145 y las células PC-3 se adquirieron de ATCC. Ellos se hicieron crecer en 6, 12, o placas de 48 pocillos en medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS, glutamina 2 mM, 12,5 unidades /ml de penicilina, 6,5 mg /ml de estreptomicina y 10 nM de insulina (RPMI-S ) en un humidificado de CO
2 incubadora a 37 ° C. Después de alcanzar 90% de confluencia, el medio se aspiró y un nuevo volumen de medio RPMI-S añadió y se utilizaron las células para los experimentos descritos a continuación.
cualitativa PCR para la COX-2, EP2, EP4 y en la próstata células de cáncer estimulados con 8-CPT-2Me-cAMP
1-LN, se cultivaron células de cáncer de próstata DU145 PC-3, y que el anterior. Después de alcanzar 90% de confluencia, las células se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks que contiene HEPES 10 mM, pH 7,4, y NaHCO 3,5 mM
3 (HHBSS). Después, se añadió un volumen de medio fresco RPMI-S y se incubaron las células durante 5 min para el equilibrio de la temperatura. Las células se expusieron a tampón o 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM) durante 30 min y se incubaron como anteriormente. La reacción se terminó mediante la aspiración del medio. El ARN total de las células se extrajo usando RNeasy Minikits (QIAGEN, Valentia, CA) según las instrucciones del fabricante. RNA se cuantificó por absorbancia a 260 nM. El ARN total se transcribió de forma inversa con 1 g de ARN en una reacción de 20-l, utilizando Moloney virus de leucemia murina de la transcriptasa (200 unidades) y oligo (dT) como cebador durante 1 hora a 40 ° C inversa. El ADNc resultante (5 g) se utilizó como plantilla, y un segmento de 225 pb del ADNc de la COX-2, EP2 y EP4 se amplificó utilizando un 20-mer cebadores aguas arriba para (1) COX-2-forward; (5'-TGG TCT GCC GGT TGG TCT G -3 ') y un inhibidor de COX-2-inverso (5'-AGT ATT CAG CTG CTT GTC TGG AAC -3'); (2) EP2-forward: (5'-CGG TTC ATC CAC GGG CGG ACC GC-3 ') y EP2-inverso (5'-CCT CCT GAG AAA GAC AGT GCT -3'); y (3) EP4-forward: (5'-CCT CCT GAG AAA GAC AGT TCG -3 ') y EP4-inverso (5'-AAG ACA CTC TCT GAG CTPT -3'). Un segmento de 302 pb del ratón β-actina (control interno constitutivo) cDNA fue co-amplificado utilizando un conjunto de cebadores proporcionadas en un amplificador de I +; kit D Systems (Minneapolis, MN). La amplificación se realizó en un termociclador Biometra 02:01 PM3 para 28 ciclos (un ciclo: 94 ° C durante 45 s, 60 ° C durante 45 s y 70 ° C durante 45 s). Los productos de PCR se analizaron en un gel de 1,2% de agarosa /bromuro de ethedium. Los geles se fotografiaron y la intensidad de las bandas de ARNm de beta-actina de COX-2, EP2, EP4 y mRNA y se cuantificó.
Medición de cPLA2, la COX-2, Epac1, EP2, EP4 y expresión en células de cáncer de próstata estimulado con 8-CPT-2Me-cAMP mediante transferencia
células de cáncer de próstata occidentales (3 × 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos) se incubaron durante la noche en medio RPMI-S y se lavaron dos veces con HHBSS frío. A continuación, se añadió un volumen de medio RPMI-S a cada pocillo. Después de equilibrar la temperatura, la células en los pocillos respectivos se expusieron a tampón o 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM /30 min) y se incubaron como anteriormente. Las reacciones se detuvieron mediante la aspiración del medio y un volumen de tampón de lisis, que contiene 50 mM Tris • HCl (pH 7,5), NaCl 120 mM, 1% Nonidet P-40, fluoruro de sodio 2,5 mM, pirofosfato de sodio 1 mM, ortovanadato de sodio 0,1 mM , PMSF 1 mM, benzamidina 1 mM, y leupeptina (20 g /ml), sobre hielo durante 20 min. Los lisados celulares se rasparon en nuevos tubos Eppendorf y se centrifugaron durante 5 min a 800 × g a 4 ° C y se determinaron los contenidos de proteína de los lisados. Para cantidades iguales de proteína de lisado, se añadió un volumen de tampón de muestra 4x y las muestras se hirvieron durante 5 min. Las muestras se sometieron a electroforesis en 10% o% en gel de poliacrilamida 12,5, transferido a una membrana de PDVF, y a inmunotransferencia para p-cPLA2S505, COX-2, Epac1, EP2, EP4 y. Las bandas de proteínas se detectaron y se cuantificaron mediante ECF y Phosphorimaging en una tormenta 860 Phosphorimager. Las respectivas membranas se volvieron a sondar para proteína diana no fosforilado o actina. La especificidad de los anticuerpos se determinó mediante el tratamiento de la célula con anticuerpos no inmunes y los lisados celulares transformados como anteriormente. En las condiciones experimentales, no se observó reactividad de estos controles.
Medición de PGE
2 en células de cáncer de próstata estimuladas con 8-CPT-2Me-cAMP
células de cáncer de próstata (3 × 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos) se incubaron durante la noche como anteriormente en medio RPMI-S y se lavó dos veces con HHBSS frío y después se añadió un volumen de medio RPMI-S a cada pocillo. Después de equilibrar la temperatura, la células en los pocillos respectivos se expusieron a tampón, o 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM /30 min) y se incubaron como anteriormente. Las reacciones se detuvieron mediante la aspiración del medio y se añadió un volumen de tampón de lisis por 20 min. Los lisados celulares se rasparon en nuevos tubos Eppendorf y se centrifugaron durante 5 min a 800 × g a 4 ° C y se determinaron los contenidos de proteína de los lisados. PGE
2 niveles en lisados de células se determinaron con un kit de ELISA (ENZO Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Medición de la síntesis de proteínas en células de cáncer estimulados con 8-CPT-2Me-cAMP
células de cáncer de próstata (300 × 10
3 células /pocillo en placas de 48 pocillos) fueron cultivadas en RPMI-S en un humidificado de CO
2 (5%) incubadora a 37 ° C. Al 90% de confluencia, el medio se aspiró y se añadió un volumen de RPMI-S a los pocillos, seguido de la adición de: (1) tampón; (2) 8-CPT-2Me-cAMP (100 M /16 h); (3) (AH23848 1 M /3 h); (4) AH23848 1 M /3 h) a continuación, CPT-8 2Me-cAMP; (5) SC58125 (1 M /3 h); (6) SC58125 1 M /3 h) a continuación, 8-CPT-2Me-cAMP; (7) Torin1 (250 nM /3 h); o (8) Torin1 (250 nM /3 h) a continuación, 8-CPT-2Me-cAMP. [
3H] A continuación se añadió leucina (2 Ci /ml) y las células se incubaron durante la noche como anteriormente. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración del medio y las monocapas se lavaron dos veces con helado de TCA al 5% y las células se lavaron tres veces con PBS enfriado en hielo. Las células se lisaron en un volumen de NaOH 1 N (40 ° C 2 h), la concentración de proteína se estimó y los lisados se contaron en un contador de centelleo líquido [47], [48].
Medición de la síntesis de DNA en celdas de 1 LN estimuladas con 8-CPT-2Me-cAMP
células cancerosas de próstata (3 × 10
3 células /pocillo en placas de 48 pocillos) se cultivaron en medio RPMI-S) en un humidificado de CO
2 (5%) incubadora a 37 ° C. Al 90% de confluencia, el medio se aspiró y se añadió un volumen de RPMI-S, seguido por la adición de compuestos como se describió anteriormente. [
3H] Después, se añadió timidina (2 Ci /ml) y las células se incubaron durante la noche. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración de las monocapas de células a medio y se lavaron dos veces con TCA enfriado con hielo 5% seguido de tres lavados con PBS enfriado con hielo. Las células se lisaron en un volumen de NaOH 1 N (40 ° C /2 h), la concentración de proteína se estimó y los lisados se contaron en un contador de centelleo líquido [47], [48].
Medición de la COX -2 o efectos inhibidores de mTOR en 8-CPT-2Me-cAMP inducida por la regulación positiva de p-CPLA
2, y la COX-2
células de cáncer de próstata (3 × 10
6 células /6 y placas) incubadas durante la noche en medio RPMI-S se lavaron dos veces con HHBSS frío y se añadió un volumen de medio RPMI-S a cada pocillo. Las células en los pocillos respectivos se trataron como se ha descrito anteriormente. Las reacciones se detuvieron mediante la aspiración del medio y se añadió un volumen de tampón de lisis en hielo durante 20 min. Los lisados celulares se rasparon en tubos Eppendorf y se centrifugaron durante 5 min a 800 × g a 4 ° C y el contenido de proteínas de los lisados determinados. Las muestras fueron estudiadas como se ha descrito anteriormente.
Medición de la COX-2 y el inhibidor de mTOR efectos en 8-CPT-2Me-AMPc-upregulation inducida de p-S6-quinasa
T389 en inmunoprecipitados de Raptor células de cáncer de próstata
la fosforilación de S6-quinasa en T389 se considera una medida de la activación mTORC1. células de cáncer de próstata (3 × 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos) incubaron durante la noche en medio RPMI-S se lavaron dos veces con HHBSS frío y se añadió un volumen de medio RPMI-S a cada pocillo. Las células en los pocillos respectivos se trataron como se ha descrito anteriormente. Las reacciones se detuvieron mediante la aspiración del medio y la adición de un volumen de tampón CHAPS lisis, que contiene HEPES 40 mM (pH 7,5), NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, pirofosfato de sodio 10 mM, 10 mM β-glicerofosfato, ortovanadato de sodio 0,5 mM, 0,3 % CHAPS y cóctel inhibidor de la proteasa de Roche (1 comprimido /10 ml). Las células se lisaron en hielo durante 20 min. Los lisados celulares se rasparon en nuevos tubos Eppendorf y se centrifugaron durante 5 min a 800 × g a 4 ° C y luego se determinó el contenido de proteínas de los lisados. Igual cantidad de proteína lisado (200-250 g) se inmunoprecipitaron con anticuerpos Raptor (1:50) Santa Cruz Cat no. sc 81537), seguido de la adición de 40 l de proteína A agarosa. Las mezclas se incubaron durante la noche con rotación a 4 ° C. inmunoprecipitados Raptor se recuperaron por centrifugación (2000 rpm /5 min /4 ° C) y se lavaron dos veces con tampón de lisis CHAPS frío. Se añadió un volumen de 4 x tampón de muestra para las muestras que a continuación se hirvieron durante 5 min, se centrifugó a electroforesis (10% de gel de acrilamida), se transfirió a membrana Hybond-P. Las membranas se inmunotransfirieron con anticuerpos contra p-S6 quinasa-
T389. Las bandas de proteínas se detectaron mediante ECF y cuantificados en una tormenta
860 Phosphorimager [47], [48].
Medición de la activación mTORC2 por la fosforilación de Akt
S473 en Rictor inmunoprecipitados de células de cáncer estimulados con 8-CPT-2Me-cAMP
la fosforilación de Akt en S473 por Rictor se considera una medida de la actividad mTORC2. células de cáncer de próstata (3 × 10
6 células /pocillo en placas de 6 pocillos) incubaron durante la noche en medio RPMI-S se lavaron dos veces con HHBSS frío, y se añadió un volumen de medio RPMI-S a cada pocillo. Investigamos el efecto de los inhibidores de COX-2 y el inhibidor de mTOR Torin1 sobre la fosforilación de Akt
S473 en inmunoprecipitados de células Rictor 1-LN en las condiciones descritas anteriormente. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración del medio y la adición de un volumen de tampón de lisis CHAPS (tampón B). Las células se lisaron en hielo durante 15 min. Igual cantidad de proteína lisado (200-250 g) se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Rictor (1:50, Santa Cruz, CA, ca#81538) mediante la adición de 40 l de proteína A agarosa de lodos. El contenido se incubaron con rotación durante la noche a 4 ° C. inmunoprecipitados Rictor se lavaron con (1) tampón de lisis B suplementado con 0,5 M NaCl; (2) tampón de lisis B; y (3) Tris • HCl (pH 7,4) suplementado con DTT 1 mM, PMSF 1 mM, y benzamidina 1 mM por centrifugación a 2500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Para Rictor inmunoprecipita un volumen de 4 x tampón de muestra se añadió, y las muestras se hirvieron durante 5 min. Después de centrifugar, el sobrenadante se sometió a electroforesis en poliacrilamida al 10% en geles de proteína, transferido a una membrana de PVDF y a inmunotransferencia con anticuerpos contra p-AKT
S473. Las bandas de proteínas se visualizaron y cuantificaron por ECF y Phosphorimaging. Las respectivas membranas se volvieron a sondar para Akt como el control de carga [47], [48].
Los efectos de Epac1 silenciamiento génico sobre COX-2 expresión en células de cáncer estimulados con 8-CPT-2Me-cAMP
Para determinar el papel de Epac1 en la activación de mTORC2 en las células de cáncer de próstata tratados con 8-CPT-2Me-cAMP, la expresión de Epac1 fue silenciado por RNAi [47], [48]. La síntesis química de dsRNA homóloga al objetivo Epac1 secuencia del péptido de secuencia s204VAHLSN209 mRNA 5'-TGT GGC CCA CCT CTC CAA CTC -3 '(Swiss Prot Epac1 número de acceso primario 0.953.958) se ha realizado por Ambion (Austin, TX). dsRNAs se prepararon por recocer el sentido 5 'UGG CCC ACC CCA UCU ACU CU-3' y antisentido 5 'GAG GAG AGG UUG UGG GCA ACA -3' y las hebras de ARN de doble cadena hibridados se purificaron por un kit Ambion. Silenciamiento de la expresión de genes Epac1 antes de la estimulación con 8-CPT-2Me-cAMP se llevó a cabo mediante transfección de células de cáncer con 100 nM (48 h) de Epac1 dsRNA como se describe anteriormente [47], [48]. Las células de control se transfectaron con una concentración equimolar de RNA codificado (Ambion Catálogo número 4610) como anteriormente. La magnitud de Epac1 silenciamiento en células transfectadas, tal como se mide por Epac1 ARNm y los niveles de proteína Epac1, osciló entre 60 a 65% [47], [48]. Las células en placas de 6 pocillos se trataron de la siguiente manera: (1) lipofectamina + tampón; (2) lipofectamina + 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM /30 min); (3) Epac1 dsRNA (100 nM /48 h) + 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM /30 min); o (4) revueltos dsRNA (100 nM /48 h) + 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM /30 min) y se incubaron como se describe anteriormente. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración del medio, se añadió un volumen de CHAPS tampón de lisis B, las células se lisaron en hielo durante 15 min, se transfirió a tubos Eppendorf, se centrifugaron (1000 rpm /5 min /4 ° C), y el sobrenadantes transfirieron a nuevos tubos y la concentración de proteínas determinadas. Las muestras se procesaron como se describe anteriormente.
Medición de los efectos de silenciamiento Raptor o Rictor RNAi silenciamiento de la expresión de p-cPLA2 y COX-2 en células de cáncer de próstata tratados con 8-CPT-2Me-cAMP
se realizó
La transfección de células de cáncer de próstata con Raptor dsRNA o Rictor dsRNA como se describe a continuación. Para determinar aún más la participación de mTORC1 en 8-CPT-2Me-cAMP inducida upregulation de S6-quinasa, que silenció a la expresión del gen Raptor por RNAi, que interrumpe ensamblaje del complejo mTORC1 y suprimir la fosforilación de su objetivo aguas abajo S6-quinasa . El ARNi recocido de Raptor fue comprado a Sigma y consiste en la consecuente sentido (5'-3 ') UCU GCA AAG AUU UGÚ UGA GdT (ID#SAS1-16Hs01-00048387-AS). Las células se transfectaron con 100 nM recocido Raptor dsRNA y control de las células se transfectaron con lipofectamina como se describe anteriormente [47], [48]. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células de control se estimularon con cualquiera de tampón, o 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM /30 min /37 ° C). Las células para el control negativo fueron transfectadas con dsRNA revueltos (100 nM /48 h, Ambion) y después se estimularon con cualquiera de tampón o 8-CPT-2Me-cAMP. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración del medio y las células se lisaron en un volumen de tampón B como se describe anteriormente. Para cantidades iguales de proteína de lisado, un volumen de 4 x tampón de muestra añadido, las muestras se hirvieron durante 5 min, se centrifugaron y a electroforesis en gel de poliacrilamida al 10%. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y respectiva inmunotransferencia con anti-COX-2 y anticuerpos p-cPLA2. Las bandas de proteínas se visualizaron y cuantificaron por ECF y phosphorimaging como se describe anteriormente. Las muestras se procesaron y estudiados como se describe anteriormente.
Para confirmar que la activación inducida 2Me-cAMP-8-CPT de mTORC2 está implicada en la regulación positiva de cPLA2 y COX-2 que la expresión de genes silenciados Rictor por RNAi, que interrumpe ensamblaje de complejos mTORC2 y así suprimir la activación mTORC2. La sonda de siRNA se adquirió de Ambion (pequeños ARN de interferencia ID S226002) de la secuencia de sentido (5'-GGG UUA GUU UAC AAU CAG C -3 ') y antisentido (5'-GCU GAU UGU AAA CUA ACC -3'). Las células se transfectaron con 100 nM de células Rictor dsRNA de control y recocidas fueron transfectadas con lipofectamina como se describe anteriormente [47], [48]. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células de control se estimularon con cualquiera de tampón o 8-CPT-2Me-cAMP (100 mM /30 min /37 ° C). Las células para los controles negativos fueron transfectadas con dsRNA revueltos (100 nM /48 h, Ambion) y después se estimularon con cualquiera de tampón o 8-CPT-2Me-cAMP como anteriormente. Las reacciones se terminaron mediante la aspiración del medio. Las células se lisaron sobre hielo durante 20 min en tampón de lisis CHAPS. Los lisados se transfirieron a tubos Eppendorf, se centrifugaron a 800 rpm durante 5 min a 4 ° C y se determinó el contenido de proteína de los sobrenadantes. Para cantidades iguales de proteína de lisado, un volumen de tampón de muestra 4x añadió, y las muestras se hirvieron durante 5 min, se centrifugó, y electroforesis en gel polyacrylalmide 10%. Las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF y las respectivas membranas de inmunotransferencia con anti-p-cPLA2 o anticuerpos de la COX-2. Las bandas de proteínas se visualizaron y cuantificaron mediante ECF y Phosphorimaging.
Resultados
Regulación al alza de los marcadores inflamatorios p-cPLA2, la COX-2, PGE
2, EP, y EP4 en el cáncer de próstata las células estimuladas con 8-CPT-2Me-cAMP
en primer lugar, evaluar el entorno pro-inflamatorias en tres líneas de cáncer de próstata humano andrógeno-independientes, a saber, 1-LN, DU-145, y PC-3, por la cuantificación de p-cPLA2
Ser505, COX-2, EP2, EP4, y PGE
2 en estas células estimuladas ya sea con tampón o 8-CPT-2Me-cAMP (Figura 1). El tratamiento de células de cáncer de próstata con 8-CPT-2Me-cAMP causó un aumento 2-2,5 veces en la expresión de p-cPLA2
Ser505 comparación con los controles (Figura 1). Un mecanismo plausible por el cual Epac1 puede activar cPLA2 es mediante la elevación del calcio intracelular y la activación de MAPKs. Epac1 regulación de Ca
2 + en libertad desde el retículo endoplásmico se ha informado anteriormente [52]. Epac1 aumenta intracelular de Ca
2 + por hidrólisis mediada por PLCγ de PIP2 la generación de IP3 que eleva intracelular de Ca
2 + [53]. Todas las líneas de cáncer de próstata tres estimuladas con tampón mostraron niveles insignificantes o muy bajos de la COX-2 mRNA y proteína en comparación con las células 8-CPT-2me-cAMP estimulada que mostraron un aumento de 2-3 veces en la COX 2-mRNA y de proteína ( Figura 1A y B).