Extracto
Antecedentes
fibroblastos asociados al cáncer, compuesta por fibroblastos o miofibroblastos activados, se encuentran en el estroma que rodea los tumores sólidos. Estos miofibroblastos promover la invasión y la metástasis de las células cancerosas. Mecanismos que regulan la activación de los fibroblastos y la iniciación de la tumorigénesis invasiva son de gran interés. La regulación positiva de la proteína del citoesqueleto, palladin, se ha detectado en los miofibroblastos del estroma que rodean muchos cánceres sólidos y en pantallas de expresión de genes implicados en la invasión. Utilizando un modelo de cáncer de páncreas, se determinó la consecuencia funcional de la sobreexpresión de palladin exógena en fibroblastos normales
in vitro
y su efecto en las primeras etapas de la invasión tumoral.
Principales conclusiones
Palladin expresión en fibroblastos del estroma se produce muy temprano en la tumorigénesis.
In vivo
, la expresión concordantes de palladin y el marcador de miofibroblastos, alfa actina de músculo liso (α-SMA), se produce en las etapas temprana displásicos en el estroma peritumoral y aumenta progresivamente en la tumorigénesis pancreática.
In vitro
introducción exógena de 90 kD palladin en fibroblastos dérmicos humanos normales (HDF) induce la activación de los fibroblastos estromales en miofibroblastos como marcada por la inducción de la α-SMA y vimentina, y a través del cambio físico de la morfología celular. Además, la expresión palladin en los fibroblastos aumenta la migración celular, invasión a través de la matriz extracelular, y creación de túneles a través de la que las células cancerosas pueden seguir. La invasión de fibroblastos y la creación de túneles resultados del desarrollo de protuberancias celulares invadopodios similar que expresan proteínas y enzimas proteolíticas invadopodios. palladin expresión en fibroblastos se desencadena por el co-cultivo de fibroblastos normales con k-ras-que expresan las células epiteliales.
Conclusiones
En general, la expresión palladin puede impartir propiedades miofibroblastos, a su vez, promover la invasivo potencial de estas células tumorales con peri-degradación invadopodios guiado de la matriz extracelular. expresión Palladin en fibroblastos puede ser desencadenada por la expresión k-ras en las células epiteliales adyacentes. Estos datos apoyan un modelo en el que los fibroblastos activados Palladin facilitan la metástasis del estroma dependiente y el crecimiento del epitelio tumorigénico
Visto:. Brentnall TA, Lai LA, J Coleman, Bronner MP, Pan S, R Chen (2012) La excitación de Stroma asociada a cáncer: La sobreexpresión de Palladin Activa fibroblastos para promover la invasión tumoral. PLoS ONE 7 (1): e30219. doi: 10.1371 /journal.pone.0030219
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: Marzo 22, 2011; Aceptado: 15 de diciembre de 2011; Publicado: 23 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Brentnall et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el gen y Mary Ann Walters Fondo para la Investigación del cáncer de páncreas (TAB), la Fundación Canaria (TAB), y los NIH NCI 5K07 CA116296 (RC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los fibroblastos desempeñan un papel fundamental en la invasión del cáncer, metástasis, y la quimiorresistencia [1] - [7]. fibroblastos asociados con el cáncer son miofibroblastos con propiedades contráctiles y actina de músculo liso alfa (α-SMA) tinción es una característica de estas células [8]. El mecanismo por el cual los miofibroblastos mejorar la tumorigénesis es subrayada por tres estudios claves que revelan: 1) los fibroblastos asociados al cáncer actúen como chaperones en las células cancerosas desde el sitio primario en el nicho metastásico 2) el bloqueo de los fibroblastos activados
antes
iniciados invasión tumoral puede prevenir el cáncer; pero la detención de los miofibroblastos después de la invasión ha comenzado es demasiado tarde para prevenir el cáncer y 3) el tratamiento terapéutico de cáncer pancreático que reduce los fibroblastos asociados con el cáncer es más eficaz en la prolongación de la supervivencia de la quimioterapia estándar que se dirige sólo a las células del cáncer [9] - [11 ].
El 90 kD isoforma de palladin, una proteína del citoesqueleto embrionario y vital para la motilidad celular, se sobreexpresa en los fibroblastos asociados con el cáncer de una multitud de tipos de tumores incluyendo páncreas, mama, pulmón, riñón, ovario y pero se expresa a niveles más bajos en los fibroblastos estromales normales [12] - [15]. fibroblastos Palladin expresan también se encuentran adyacentes a las células cancerosas en los ganglios linfáticos y metástasis en el hígado [12]. La desregulación de palladin a partir de células cultivadas resultados en la organización aberrante actina, adhesión celular y la motilidad dysregulated, y la alteración de la morfología celular bruto [16] - [20]. No es de extrañar, palladin se ha detectado en las pantallas de expresión de genes específicos de la invasión de páncreas y cáncer de mama [21], [22].
Una asociación interesante entre los fibroblastos y palladin asociados con el cáncer en el marco de cáncer de páncreas ha salido a la luz. Hemos informado una forma altamente penetrante, rara de cáncer pancreático familiar (Family X) que es causada por una mutación en una región altamente conservada de 90 kD palladin. Esta mutación induce anormalidades del citoesqueleto y mejora la migración cuando se transfecta en células que normalmente expresan cantidades mínimas de la 90 kD palladin isoforma [19]. Fue llamativa la que la proteína se sobreexpresa palladin preferentemente y de forma ubicua en el compartimiento del estroma del cáncer de páncreas en lugar de las células del epitelio ductal [12], [23].
El papel fundamental de palladin en la motilidad celular y la creciente conciencia de que activa los fibroblastos en realidad puede asociarse con las células cancerosas para promover la invasión y la metástasis dio lugar a estas investigaciones. En este documento, el uso de cáncer pancreático como un modelo, que desentrañar 1)
cuando
en la progresión neoplásica hace palladin activar los fibroblastos, 2) la
mecanismo
subyacente a la transición de los fibroblastos normales en un miofibroblastos activados en el ajuste del cáncer y 3)
cómo Francia el miofibroblastos podría ayudar a las células cancerosas para escapar. Además, también exploramos los efectos de un 90 kD palladin heredado mutado en los fibroblastos de un Vástago predisposición al cáncer de páncreas (Familia X o FX). ¿Podría un Palladin mutado fibroblastos del estroma iniciar el cáncer?
Resultados
Palladin expresión en fibroblastos asociados al tumor ocurre al principio de la progresión neoplásica y co-localiza con α-SMA en el cáncer de páncreas humano
inmunohistoquímica (IHC) tinción de marcador de miofibroblastos, α-SMA, y palladin 90 kD se llevaron a cabo de forma concomitante en los bloques de microarrays de tejidos humanos que contienen todas las etapas histológicos de cáncer de páncreas humano, incluyendo las lesiones precancerosas (Figura 1). páncreas normal carecían de 90 kD expresión de la proteína palladin excepto en el revestimiento de las células endoteliales. Por el contrario, 90 expresión palladin kD aumenta con la progresión neoplásica en las lesiones displásicas pre-cancerosas y la característica más sorprendente fue que la tinción palladin se limitó a los fibroblastos inmediatamente adyacentes a las células ductales displásicas (Figura 1). En el cáncer de páncreas, difusa y fuerte expresión palladin se observó en todo el estroma, particularmente en el área que rodea a las células de adenocarcinoma, de acuerdo con los informes anteriores [12], [23]. La expresión de α-SMA en el estroma cáncer paralelo mucho a la de palladin como se informó anteriormente en el carcinoma de células renales [15]. Co-expresión de α-SMA y palladin en los fibroblastos que rodean las lesiones precancerosas sugiere que el fenotipo de miofibroblastos se activa al principio de la progresión neoplásica y se hace más generalizada en el cáncer.
A) Expresión de palladin y α- SMA se examinó mediante la tinción IHC en muestras de páncreas. A la izquierda: hay poca o ninguna tinción en el páncreas normal. Medio: expresión aumenta en los fibroblastos peritumoral de displasia pancreática o PanIN 2. Derecho: la expresión es más alto y más extendida en los fibroblastos que rodean el cáncer de páncreas. B) lecturas semi-cuantitativos proporcionan IHC resultados de la tinción de los microarrays de tejidos de la normalidad (NL), displasia de bajo grado (PanIN 2), displasia de alto grado (PanIN 3) y el cáncer (CA) por palladin y α-SMA. La tinción de palladin o α-SMA se puntuó como 0 a 4. Véase también la Tabla S1.
Palladin hasta regula α-SMA y activa los fibroblastos para convertirse en miofibroblastos
Sobre la base de la expresión de la proteína de palladin y α-SMA en fibroblastos peri-tumoral, hemos tratado de desentrañar la relación entre estas proteínas. Palladin es notablemente hasta reguladas durante la transición después del tratamiento de fibroblastos-a miofibroblastos con TGF-β1 [4] como se a-SMA [3]. En las células del músculo liso vascular, se requiere la expresión palladin para α-SMA upregulation [24], [25]. Nos preguntamos qué efecto regulador estas dos proteínas asociadas a miofibroblastos podrían tener una sobre la otra y el fenotipo de miofibroblastos (ver datos abajo). La transfección de los 90 kDa isoforma de tipo salvaje (WT) o P239S mutantes (FX) palladin en fibroblastos dérmicos humanos normales (HDFS) hasta regula marcadores miofibroblastos, α-SMA y vimentina, y es suficiente para desencadenar un fenotipo de miofibroblastos siguiente palladin inducción. Por día 5 post-transfección palladin, α-SMA es significativamente elevado (27,4% ± 2,8%) e incluso aumentó aún más por día 9 (79% ± 15,7%) (Figura 2). La transfección de palladin también resultó en la regulación positiva de las proteínas contráctiles 11 miofibroblastos reportados por Malstrom et al. [26] (incluyendo la cofilina, vimentina, profilina, caldesmón, tropomiosina, enolasa alfa, beta actina, tubulina, Rho GTP disociación inhibidor 1, calponin, y la peptidil-prolil cis-trans isomerasa A). Este análisis proteómica se discute con mayor detalle más adelante
.
células A) HDF transfectadas con 90 kD palladin (WT o FX) o vector vacío (EV) se examinaron para determinar los marcadores miofibroblastos a-SMA y vimentina a través de SI. Rojo = α-SMA o vimentina; Azul = DAPI. B) las células HDF se trataron como anteriormente en (A) y la expresión de α-SMA se analizó por RT-PCR. RNA se cosechó en el número de días indicado después de la transfección. C) Expresión de α-SMA se analizó por RT-PCR. GAPDH se utilizó como control interno de carga y la expresión relativa de cada muestra en comparación con las muestras tratadas TGF-beta 1 se representan como veces de inducción ± SD.
fibroblastos activados-Palladin desarrollan un fenotipo de miofibroblastos
Introducción de 90 kD palladin (WT o FX) en células HDF (en lo sucesivo también como HDF-WT o HDF-FX) dio lugar a alteraciones en la morfología celular (Figura 3A). En condiciones normales de crecimiento (con medio completo), los fibroblastos que expresan Palladin demostraron una disminución de la superficie celular, y un aumento de protuberancias celulares delgadas con apéndices pico-como en comparación con las células de control parentales. cambios en el citoesqueleto incluyen tanto el alargamiento y engrosamiento /agrupamiento de las fibras de estrés de actina (Figura 3A). protuberancias celulares delgadas con apéndices en espiga son visibles por microscopía electrónica en los fibroblastos que expresan Palladin (Figura 3B). Debido a que muchos cánceres se forman en un ambiente inflamatorio, y porque el cáncer se considera la herida que no se cura [27], que también examinó los fibroblastos que expresan Palladin después de incubación en hiriendo a los medios de comunicación (medios condicionados a partir de fibroblastos que fueron heridos con una punta de pipeta ) para determinar si nuevos cambios fueron notables (Figura 3A). Los cambios morfológicos se han mejorado notablemente en comparación con los fibroblastos de control de vacío-vector (Figura 3C). Las células desarrollaron una forma más fusiforme o mesenquimales con salientes largos y delgados en comparación con los fibroblastos de control de vacío-vector (Figura 3C).
A) HDF transfectadas con WT-palladin (WT) o FX-palladin (FX) se compararon con el vector vacío (EV), utilizando si el análisis de las células teñidas con faloidina cultiva en medios completos o medios hiriendo. B) teñido con faloidina protrusión de células HDF-WT se magnifica por micrografía de electrones (
inserción
). C) HDF se trataron como anteriormente en (A) y se cultivaron en hiriendo medios de comunicación. Faloidina células teñidas se analizaron mediante una prueba IF. Parcelas ilustran la superficie relativa de células (
Top of) y la duración media de las protuberancias (
parte inferior). Los datos son representativos de dos experimentos independientes; los valores se expresan como la media ± SEM. (T-test, *, valor de p & lt; 0,05; **, valor de p & lt; 0,01).
Palladin que expresan los fibroblastos además un disparador estimulante mejora la capacidad invasiva y migratoria
a continuación pregunta si la expresión palladin 90 kD afectaría a la migración y /o la capacidad invasiva de los fibroblastos. La migración se probó utilizando un sistema transwell donde las células pueden atravesar directamente a través de los poros de una cámara superior a una cámara inferior. Invasion fue probada usando un transwell Matrigel recubierto. Se compararon los resultados de los ensayos de incubación con medio completo, hiriendo a los medios de comunicación (medio condicionado recogido de las células confluentes HDF heridos de forma manual con una punta de pipeta), o medios acondicionados de Panc-1 en las células epiteliales. Estudios anteriores han demostrado que la exposición de las células a heridas medios de comunicación, aumenta la tasa de migración de las células epiteliales [28]. De acuerdo con estudios recientes que muestran efectos anti-migratorias de expresión palladin en células de cáncer de mama [29], en ausencia de una señal de la herida, los fibroblastos-Palladin activado no han mejorado la migración o invasión. Sin embargo, una señal de la herida aumentó drásticamente la migración y la capacidad invasiva de los fibroblastos activados Palladin (WT y FX) en comparación con el control del vector vacío (HDF-EV) (Figuras 4A & amp; 4B). Si bien el factor de crecimiento epidérmico (EGF) tuvo un resultado similar sobre las células como (no se muestran los datos) de los medios heridos, la incubación con medio acondicionado a partir de células de cáncer de páncreas (Panc-1) no mejorar la invasividad de las células que expresan Palladin (Figura 4B) .
a) la migración a través de un transwell se comparó para HDF transfectadas con el vector vacío (EV), WT-palladin (WT), FX-palladin (FX) cuando se expone a medios completos o medios normales de la herida. Los datos mostrados son la media ± SEM representativo de tres experimentos independientes. (T-test, *, p-valor & lt; 0,05) B) La invasión a través de un transwell matrigel cubierta se comparó para las células HDF tratados como anteriormente en (A) cuando se expone a completar los medios de comunicación, medios de comunicación hiriendo o medios acondicionados de Panc-1 Células. Los datos mostrados son la media ± SEM representativo de tres experimentos independientes. (T-test, **, valor de p & lt; 0,01) C) células HDF se transfectaron como anteriormente en (A) y se sembraron en cubreobjetos recubiertos con gelatina marcados con Rojo Texas. se muestran imágenes representativas tomadas a través de SI. DAPI (azul) se utilizó para visualizar los núcleos. D) de proteína de lisados de células transfectadas HDF como anteriormente en (A) se ensayaron para determinar la actividad de RhoA. Cada muestra se realizó por triplicado en dos experimentos independientes. Las barras de error indican SD. (T-test, **, valor de p & lt; 0,01) E) Ensayo de proliferación de células HDF transfectadas como anteriormente en (A). Los datos indican la media ± SD de tres pozos independientes.
Para comprobar si las células que expresan Palladin eran capaces de degradar la matriz extracelular, HDF-EV, HDF-WT, y HDF-FX se cultivaron en cubreobjetos recubiertos con gelatina fluorescentemente marcado. En presencia de los medios de comunicación herida, se observó la agrupación de gelatina y la superficie de la gelatina fue destruida por las células HDF-FX Palladin-expresión de HDF-WT o, pero no de la normal parental HDF-EV (Figura 4C). Estos cambios destructivos son mucho más dramático y extendido de lo que se esperaría normalmente con invadopodios solo. Nos preguntamos si los miofibroblastos inducida Palladin habían mejorado la contractilidad que podría causar una "extracción" de la matriz. Para responder a esto, se investigó si RhoA, una proteína implicada en el movimiento del citoesqueleto y remodelación [30], se activa en las células que expresan Palladin y encontramos que los niveles de RhoA se incrementaron casi 2 veces (Figura 4D). Esto sugiere que la expresión palladin exógeno promueve la capacidad de miofibroblastos tanto a invadir y destruir la matriz extracelular (Figura 4C). Los efectos invasivos de herir a los medios de comunicación y EGF sobre los fibroblastos que expresan Palladin no se debieron a una diferencia en las tasas de proliferación (Figura 4E).
Anterior investigadores han sugerido que los fibroblastos asociados al tumor pueden conducir las células cancerosas a través de la matriz extracelular [31]. Nos preguntó si los fibroblastos Palladin activadas podrían adaptarse a ese paradigma. Para examinar esta hipótesis, se realizaron ensayos de invasión en 3D utilizando diapositivas desarrollados por Bellbrook Labs (Figura 5A). Dos pozos circulares estaban conectados por un canal recto central de 1 mm x 1,8 mm. El canal se llenó de matrigel diluido fluorescente; EGF se añadió a la bien en un lado de la canal como un atrayente y HDF o HDF-palladin activado fueron cargados en el pozo opuesto. la invasión de células en el canal de matrigel llenas se evaluó a intervalos de 12 horas como los fibroblastos se movieron hacia el atrayente. De acuerdo con nuestros ensayos de invasión Transwell, fibroblastos-Palladin activado invadieron los canales con mayor rapidez y emigraron a través del canal en un número significativamente mayor que el control de fibroblastos (Figura 5B). Incluso con tiempo prolongado, ninguna de las células HDF sin palladin fueron capaces de cruzar el canal. Por el contrario, los fibroblastos Palladin activado cruzaron completamente el canal 1 mm por 72 horas, la creación de túneles que fueron utilizados por otros fibroblastos activados que siguieron atrás. Los negros túneles creados por los fibroblastos Palladin activadas son bastante claramente visibles en el canal fluorescente de color rojo de la invasión de cámara 3D (Figura 5C). Además de la extensa túnel creado por los fibroblastos Palladin activadas hacia el atrayente, las células que contienen Palladin-parecía tener movimiento mejor direccional hacia el atrayente EGF que las células control (Figura 5B); este último con frecuencia un círculo de vuelta al hogar bien donde empezaron.
A) Esquema del ensayo de 3-D que muestra la invasión de Texas rojos marcados gelatina mezcla /matrigel en el canal con 5 ng /ml de EGF como atrayente en el el puerto y las células izquierda (HDF ± palladin etiquetados con Qtracker 585 con o sin Panc-1 marcado con QTracker655) sembró en el puerto derecho. el movimiento celular se evaluó como células atraviesan el canal (derecho de movimiento direccional izquierda) mediante microscopía confocal. B) fibroblastos-Palladin activado (verde) invadir más en el canal de matrigel roja en todos los puntos temporales a prueba (24 y 72 horas)
(paneles de la derecha)
comparación con HDF con EV
(paneles de la izquierda)
. se muestran imágenes representativas tomadas con microscopía confocal. Las barras indican 100 micras. C) La región en caja amarilla se muestra a mayor aumento a la derecha.
top
, matrigel rojo es uniforme en el canal vacío antes de la invasión.
medio, fibroblastos activados-Palladin (emisión de fluorescencia verde) creado túneles negros (carentes de señal Rojo Texas; véase la flecha) dentro de la matriz.
Bottom Restaurant, fibroblastos (blanco faloidina mancha) puede moverse en fila india a través de los túneles. Se muestra son imágenes representativas tomadas con microscopía confocal. Las barras indican 50 micras. D) células Panc-1 (rosa; ver puntas de flecha) siguen fibroblastos-Palladin activado (blanco) a través del canal mientras que no siguen la HDF-EV. Se muestra son imágenes representativas tomadas con el microscopio confocal de 72 horas después del co-cultivo. Los canales fueron fijadas y teñidas con DAPI.
células Panc-1 se añadieron un día después de los fibroblastos para evaluar si estas células epiteliales harían uso de los túneles creados anteriormente por los fibroblastos invasores. De hecho, hemos sido capaces de identificar las células Panc-1 siguiendo las células de fibroblastos Palladin activadas a través de los túneles (Figura 5D). fibroblastos activados-palladin tuvieron una influencia directa sobre el comportamiento y el aspecto de las células Panc-1 en las células epiteliales de cáncer de páncreas. Después de co-cultivo de células Panc-1 y fibroblastos Palladin activadas en el hogar bien de las diapositivas en 3D a la invasión, las células cancerosas migran Panc-1 distancia- mucho más lejos algunos de cruzar por completo el canal- mientras que el control palladin de libre co -cultures reveló las células Panc-1 apenas dejando así el hogar. Además, en presencia de fibroblastos Palladin activadas, las células Panc-1 desarrollaron una apariencia alargada (Figura 5D).
Palladin promueve la invasión a través del desarrollo de invadopodios lleno de enzimas de la matriz que destruyen
Para desentrañar el mecanismo que subyace a la capacidad invasiva de los fibroblastos que expresan Palladin, se examinaron los "pies" de los fibroblastos Palladin activadas, que se habían vuelto más prominente con la transición en miofibroblastos (Figura 3B). HDF, transfectadas con y sin palladin, se sembraron en cultivos polarizados recubiertos con Matrigel. Aunque el tamaño de los poros de la transwell era demasiado pequeño para una célula entera para ir a través, podría dar cabida a los podosomes, que tuvieron que penetrar en primer lugar la capa de Matrigel (Figura 6A). Los invadopodios /podosomes que invadieron a través de los poros de la matriz cubiertas fueron separadas del cuerpo celular con una navaja. Se utilizó el análisis proteómico cuantitativo marcado para comparar las proteínas en los "pies" de los fibroblastos que expresan Palladin en relación con los "pies" de los fibroblastos normales de los padres. El análisis proteómico reveló que más de 200 proteínas se dysregulated por ≥1.5 veces en los "pies" de los fibroblastos que expresan Palladin relación con los de control de las células marcadas. Estas proteínas incluyen proteínas disregulados invadopodios [30], [32], [33], relacionados con ras y las proteínas de unión a GTP, y las enzimas proteolíticas, (proteínas seleccionadas, ver Figura 6B; para la lista completa, véase la Tabla S2). Estamos particularmente interesados en las proteínas, incluyendo invadopodios Cortactin, filamin A, el beta-integrina 1, vinculina, profilina, alfa-actinina, y cofilina [32], [33]. Casi la mitad de las proteínas identificadas hasta reguladas en nuestro análisis proteómico se informó recientemente como nuevos componentes invadopodios [34].
A) La parte inferior de un 3 micras transwell muestra podosomes /invadopodios de un fibroblasto HDF-WT que ha invadido a través del matrigel a través de SI. Los "pies" se cortaron con una navaja de afeitar para el análisis proteómico. células B) HDF transfectadas con el vector GFP-vacío (EV) o palladin (WT)-GFP de tipo salvaje fueron examinados con tinción phalloidin a través de SI. fibroblastos que expresan palladin tienen protuberancias lineales (
puntas de flecha
) llenos de proteasas y lisozimas como catepsina D. mostradas son imágenes representativas. C) El análisis proteómico de los "pies" revela la sobreexpresión de enzimas proteolíticas, las proteínas Rho activación, y verifica la presencia de proteínas previamente identificadas en invadopodios. Se muestran las proporciones de proteínas de fibroblastos con WT o FX relativa a palladin vector vacío. Ver también la Tabla S2. células D) HDF transfectadas con palladin de tipo salvaje se cultivaron en cubreobjetos de matrigel cubierta. Se detectaron pistas degradadas erosivos mediante microscopía electrónica. La barra indica 1 micra.
análisis proteómico cuantitativo reveló la sobre regulación de la proteína, la alfa-actinina unión palladin-que es otra proteína relacionada invadopodios-que se ha asociado con un mal pronóstico en el ovario y páncreas [ ,,,0],35], [36]. El marcado aumento de alfa-actinina en el estroma del cáncer de páncreas y precáncer fue validado por IHC (Figura S1). Validación de la expresión aumentada de proteínas invadopodios seleccionado -cofilin, cortactin, y profilina-detectada por el análisis de proteómica se realizó por inmunofluorescencia y /o análisis de transferencia Western (Figura S2).
Además de las proteínas invadopodios, proteolítica enzimas también eran hasta reguladas en los "pies" de los fibroblastos que expresan Palladin incluyendo ADAM22, aminopeptidasas, y catepsina D y B (Figura 6C). La tinción inmunofluorescente de la catepsina D, confirmó que la proteína se sobreexpresa de forma selectiva en el HDF-FX y las células WT, pero no en los fibroblastos de los padres con vector vacío (Figura 6C). Curiosamente, la catepsina D se ha demostrado que estimula la invasión de fibroblastos y el crecimiento y, según informes está involucrado en las interacciones paracrinas entre epitelio tumor y fibroblastos [37]. Además de la expresión de enzimas proteolíticas y proteínas de la matriz de remodelación, destrucción de Matrigel por las células HDF-WT Palladin que expresan es evidente por microscopía electrónica (Figura 6D).
Palladin está regulado en los fibroblastos por el adyacentes k-ras activado células epiteliales
Palladin generalmente no mutado en el cáncer de páncreas esporádico (datos no presentados) o en los cánceres de páncreas familiares, distinto de la familia X [38] - [41]. Sin embargo, la expresión de 90 kD palladin se ha informado en los fibroblastos que rodeaban displásicos de páncreas o células ductales cancerosas en el 96% de los cánceres de páncreas, mientras que los fibroblastos que rodean a las células ductales normales no lo hacen [12], [23] (Figura 1). La hipótesis de que la señalización paracrina entre las células epiteliales cancerosas y fibroblastos era probablemente responsable de la sobre regulación de la expresión palladin en los fibroblastos, con el tiempo convirtiéndolos en miofibroblastos asociados a tumores. Para probar esta hipótesis, los fibroblastos humanos normales fueron co-cultivadas en un transwell con células inmortalizadas normales ductales pancreáticas (células HPDE) y con líneas celulares de cáncer ductal pancreático que tienen mutaciones de K-RAS (MiaPaCa y Panc-1). Durante el día 5 de co-cultivo, palladin fue hasta reguladas en los fibroblastos adyacentes a las dos líneas de células ductales cáncer de páncreas (Figura 7A). En comparación, los fibroblastos normales que estaban adyacentes a las células ductales pancreáticas normales no expresan palladin (Figura 7B).
A) se examinaron las células HDF para la expresión a través de palladin SI tras la co-cultivo con líneas celulares de cáncer de páncreas, MiaPaCa o Panc-1, durante 7 días. TGFß1 se muestra como un control positivo para hasta la regulación de palladin en los fibroblastos normales, no hay células epiteliales es el control negativo. Las barras de escala indican 20 micras. B) Se examinaron las células HDF para α-SMA o expresión palladin a través de IF tras la co-cultivo con células normales de los conductos pancreáticos epiteliales (HPDE) que eran falsamente transfectadas o transfectadas con el tipo salvaje o mutantes K-ras. Las barras de escala indican 20 micras.
A continuación nos preguntamos qué era la señal de las células cancerosas que un máximo de regular palladin en fibroblastos adyacentes? A la luz de nuestros datos que muestran la evolución en el tiempo más temprano para la regulación de palladin en los fibroblastos peri-tumoral se produce en la displasia de bajo grado (conocido como PanIN 2 en el páncreas), la hipótesis de que la regulación palladin debe ocurrir relativamente temprano en la tumorigénesis . mutaciones K-ras son ubicuos en el cáncer de páncreas: presente tanto en las células ductales cancerosas y precancerosas [42]. Debido palladin sobre-expresión se observó en los miofibroblastos inmediatamente adyacentes a las células ductales precancerosas (Figura 1), se especuló si k-ras de activación solo en las células ductales era suficiente para causar la sobre regulación de 90 kD palladin en fibroblastos normales vecinos . Un experimento de co-cultivo similar, usando los cultivos polarizados se ideó con los fibroblastos normales en la cámara inferior; la cámara superior contenía células normales pancreáticos ductales epiteliales (HPDE) transfectadas con los de tipo salvaje k-ras, K-ras mutado, o un vector vacío. La expresión de cualquiera constitutivamente activa de tipo salvaje
o
K-ras mutado en células HPDE fue suficiente para causar la sobre regulación de palladin y α-SMA en los fibroblastos normales adyacentes (Figura 7B). Ni la expresión de α-SMA palladin ni se incrementaron a co-cultivo con células parentales ductales pancreáticas (HPDE) transfectadas con un vector vacío.
Regulación al alza de α-SMA y palladin en fibroblastos por las células cancerosas adyacentes se evita mediante silenciamiento de 90 kD palladin
para determinar si el ras-inducidas transformación de fibroblastos en miofibroblastos se basaban en una vía palladin dependiente, que utiliza shRNA para generar clones estables de HDF, con la eliminación palladin y luego mide palladin y α-SMA la producción después de 9 días de co-cultivo de los fibroblastos normales con la línea celular de cáncer de páncreas, Panc-1. No fue posible detectar la expresión de α-SMA por RT-PCR tras la co-cultivo de células HDF transfectadas de forma estable con cualquiera de tres canales distintos shRNA construcciones diana de 90 kD palladin (Figura 8A; datos no mostrados). Sin embargo, se observó la regulación positiva de α-SMA en co-cultivo con células Panc-1 si se transfectaron células HDF con un control de shRNA plásmido o en células HDF no tratados. Había también una consecuencia funcional para silenciar palladin en fibroblastos, como se demuestra por ensayos de migración y la invasión (Figuras 8B y 8C amp;). silenciamiento palladin disminuye las funciones previamente asociados con el fenotipo de miofibroblastos. En conjunto, estos resultados indican que las células ductales que contienen k-ras activados son suficientes para un máximo de regular la expresión palladin en fibroblastos adyacentes a través de la señalización paracrina. Esto a su vez hace que el fibroblasto de transformarse en un miofibroblastos. silenciamiento completo de palladin abroga el proceso.
células HDF
A) fueron transfectadas establemente con el control shRNA (C) o shRNA contra 90 kD palladin (Pal shRNA). a-SMA expresión tras la co-cultivo con células Panc-1 se analizó mediante RT-PCR. Análisis de HDF sin tratar (U) se muestra para comparación. El primer carril es un control negativo no molde; GAPDH se muestra como control interno de carga. Se muestra datos de un representante shRNA clon estable (de tres construcciones independientes shRNA probado). B) La invasión a través de un transwell recubierto matrigel se comparó para HDF transfectadas como en (A). Se muestra la media ± desviación estándar. Se muestra es representativa de datos de un clon ARNhc estable (de tres construcciones shRNA probados). Las células C) HDF como en (a) se cultivaron hasta la confluencia en cubreobjetos y heridos con la prueba de arañazos. La migración se evaluó a través de SI 24 horas después de la herida. Se analizaron al menos 3 observaciones para cada condición. Azul = DAPI. Se muestra es representativa de datos de un clon ARNhc estable (de tres construcciones shRNA probado).
palladin mutado (FX) confiere algunas diferencias en la expresión y el comportamiento de proteínas en los fibroblastos en comparación con los de tipo salvaje palladin (WT)
Por varias razones, se incluyeron en estos experimentos el estudio de la mutación P239S en una región altamente conservada de 90 kD palladin que causa una forma rara de cáncer pancreático familiar autosómica dominante. ¿Cómo podía la desregulación de una proteína del citoesqueleto en fibroblastos peri-tumoral predisponer a un cáncer tan letal, altamente penetrante? En estos estudios, se encontró que el FX palladin fibroblastos que expresan fueron significativamente más invasivo que contienen fibroblastos de tipo salvaje palladin. Además, el análisis del proteoma cuantitativa detectó la expresión de 88 proteínas que eran únicas para el HDF-FX (Tabla S2) y no detectada en HDF-WT.