Extracto
La expansión de los leucocitos mieloides linaje de ratones portadores de tumores se ha propuesto como una causa de la inmunosupresión sistémica . Se demuestra que la terapia de radiación de tumores conduce a una disminución en el número de células mieloides en la sangre y una disminución en el tamaño del bazo. La frecuencia de células mieloides no disminuye hasta el nivel visto en ratones libres de tumor: se demuestra que la enfermedad metastásica puede evitar que el número de células mieloides de regresar a la línea de base, y que la recurrencia del tumor de la enfermedad residual se correlaciona con la re-expansión de las células de linaje mieloide. resultados de la terapia de radiación en aumento de la proliferación de las células T en el bazo y mientras que las respuestas de células T a antígenos extraños no son alteradas por la carga tumoral o la expansión de células mieloides, las respuestas a antígenos asociados a tumores se incrementan después de la radioterapia. Estos datos demuestran que el número de células mieloides están directamente vinculadas a la carga del tumor primario, que este contrae la población después de la radioterapia, y que la terapia de radiación pueden abrir una ventana terapéutica para la inmunoterapia de la enfermedad residual
Visto:. Crittenden MR, Savage T, Cottam B, Bahjat KS, Redmond WL, Bambina S, et al. (2013) La expansión periférica mieloide murina Impulsado por la progresión del cáncer es revocada por la radioterapia del tumor. PLoS ONE 8 (7): e69527. doi: 10.1371 /journal.pone.0069527
Editor: María G. Castro, Universidad de la Escuela de Medicina de Michigan, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Abril, 2013; Aceptado: June 11, 2013; Publicado: July 25, 2013
Derechos de Autor © 2013 Crittenden et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por fondos de investigación de un Susan G Komen para la Cura de la carrera Premio catalizador (KG110131) y la Sociedad Americana de investigación del cáncer Académico Grant (RSG-12-168-01-LIB) para MJG, y Wayne D. Kuni y Joan e . Premio Fundación Kuni Kuni Académico de MRC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
células mieloides juegan un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer. macrófagos asociados a tumores son críticas para la angiogénesis, invasión, metástasis, inmunosupresión y la respuesta al tratamiento [1], [2], [3]. Recientemente los estudios se han centrado en la población de células mieloides que se expande con frecuencia en la sangre periférica de pacientes con cáncer [4], [5]. Ciertos modelos de ratón se asocian con expansiones extremas mieloides detectables en el tumor, el bazo y la sangre periférica, y estas células mieloides son capaces de suprimir la activación de células T
in vitro
[6], [7], [8].
modelos de tumores trasplantables con sus células de cáncer clonal idénticas proporcionan un modelo útil para estudiar las características clave de la expansión mieloide. Si la expansión mieloide está vinculada al número de células de cáncer, el tratamiento del tumor primario debe evitar la expansión mieloide. Gemcitabina y quimioterapia 5-FU se ha demostrado que el control de la expansión mieloide en los bazos de ratones portadores de tumores [9], [10], [11]. Sin embargo, cada uno de estos agentes se ha descrito que tienen un efecto inhibidor directo sobre las poblaciones mieloides
in vitro
[10], [11]. Si bien estos no son particularmente quimioterapias mielotóxicas, los posibles efectos sistémicos de quimioterapias en proliferación activa precursores mieloides puede confundir la contribución de la reducción de la carga tumoral. La extirpación quirúrgica del tumor primario también causa una disminución en las células mieloides [9], [12]. Es interesante que este efecto es incompleta, ya que las células no vuelven a los niveles no tratados previamente. Estos datos sugieren que los tumores tienen un efecto sobre las células mieloides que persiste más allá de la escisión. Sin embargo, en este modelo el efecto de la escisión del tumor es transitoria, como la expansión mieloide regresa con la recurrencia del tumor primario y la metástasis [12]. Por lo tanto, estos datos podrían ser reinterpretados para sugerir que las células cancerosas residuales pueden evitar una normalización completa de números mieloides. En el modelo quirúrgico, trauma también puede actuar como un factor de confusión. Trauma se ha demostrado que causa una movilización de las células mieloides con similares propiedades fenotípicas, morfológicas y función a las células mieloides inducidas por el tumor [13]. Esta expansión mieloide inducido por trauma puede ocultar en la medida de la reducción de las células mieloides causadas por la extirpación quirúrgica del tumor primario, y añadir a cualquier expansión mieloide sostenida por la enfermedad residual
.
La consecuencia de la terapia de radiación tumor a sistémico poblaciones mieloides no se ha descrito. terapia de radiación se puede administrar de una manera altamente específica del sitio, dando como resultado el control de tumores específicos y en circunstancias normales no hay ningún efecto sobre los tumores fuera del campo de destino. Por lo tanto, la terapia de radiación proporciona una técnica para afectar del tumor primario en las células mieloides periféricos sin los efectos de confusión de la quimioterapia y la cirugía. Se demuestra que la terapia de radiación de tumores 4T1 causa una disminución del número de células mieloides en la sangre y una disminución en el tamaño del bazo. enfermedad sistémica, medida por metástasis pulmonares, no se ve afectada por la radioterapia del tumor primario. Se demuestra que la expansión mieloide sigue de cerca el crecimiento del tumor primario, pero que después del tratamiento, los números mieloides no se reducen al nivel observado en los ratones libres de tumor, lo que sugiere que luego del tratamiento local, la enfermedad local y metástasis residuales se combinan para sostener los números mieloides. Cuando los tumores primarios se repitieron como resultado de la enfermedad local residual, la expansión mieloide regresó. Se demuestra que mientras que los números mieloides son regulados por el crecimiento del tumor y la influencia de la terapia de radiación, el número de células T no cambian. Sin embargo, la terapia de radiación del tumor primario mejoró la mieloide: CD8 y resulta en aumento de la proliferación de las células T endógenas en el bazo. Para probar si la expansión y la contracción mieloide afectadas in vivo las respuestas de células T en, que mide la respuesta específica de antígeno frente a antígenos asociados a la vacuna y asociados a tumores. Hemos demostrado que no hubo ningún cambio en el
in vivo
respuesta a
Listeria monocytogenes
vacunación en tumor-cojinete y los ratones tratados, pero que la combinación de la terapia de radiación con resultados de vacunación en aumento de las respuestas a la vacuna antígeno compartido con el tumor. Estos datos apoyan la hipótesis de que la expansión mieloide está directamente vinculada a la carga tumoral, que estas células de contrato después de la radioterapia, y que la terapia de radiación pueden abrir una ventana terapéutica para la inmunoterapia de la enfermedad residual.
Materiales y Métodos
Ética
Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Earle A. Chiles Instituto de Investigación IACUC (Animal Welfare Aseguramiento Nº A3913-01).
Animales y líneas celulares
la línea celular de carcinoma mamario 4T1 [14] (BALB /c) se obtuvo de la ATCC (Manassas, VA). La línea de Panc02 murino de células de adenocarcinoma de páncreas [15] (C57BL /6) fue proporcionado amablemente por el Dr. Woo (Mount Sinai School of Medicine, Nueva York). viejos C57BL /6 ratones de 6-8 semanas y BALB /c se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) para su uso en estos experimentos.
Los anticuerpos y reactivos
anticuerpos conjugados con fluorescencia CD11b -AF700, Gr1-PE-Cy7, IA (MHC de clase II) -e780, Ly6C-PerCP-Cy5.5, CD4-e450, e450-FoxP3, CD25-APC, CD4-PerCP Cy5.5, CD8-FITC, IFN? -APC, y CD40L-PE se compraron de eBioscience (San Diego, CA). Ki67-FITC, CD4-V500, TNF-PE-Cy7 y Ly6G-FITC se adquirieron de BD Biosciences (San Jose, CA). CD8-PE-TXRD fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA).
radioterapia de tumores
Los tumores se inocularon por vía subcutánea en la pierna justo debajo de la rodilla a una dosis de 5 × 10
4 4T1 células o 2 × 10
5 Panc02 y permitido establecer durante 14 días antes de la iniciación del tratamiento. La dosificación se basa en los últimos estudios clínicos [16], con tres 20 fracciones diarias de tratamiento Gy administrados usando un acelerador lineal Elekta Sinergia (Atlanta, GA) con 6 MV de fotones que incorpora un bloqueo de haz medio para minimizar la dosis para el torso y 1 cm de bolo.
análisis clonogénico de células de cáncer metastásico
Para el análisis clonogénico de células de cáncer metastásico, los pulmones fueron disecados en fragmentos de aproximadamente 2 mm, seguido de agitación en 1 mg /ml de colagenasa (Invitrogen), 100 mg /ml de hialuronidasa (Sigma, St Louis, MO), y 20 mg /ml de DNasa (Sigma) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. El digesto se filtró a través de 100 de malla de nylon micras para eliminar los restos macroscópica. diluciones en serie de las células tumorales se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos en medio que contenía 60 mM 6-tioguanina para seleccionar las células de cáncer más de las células del estroma y las colonias se contaron después de 7 días. La dilución en serie y el recuento de colonias se utilizaron para calcular el número de células cancerosas clonogénico en el órgano original.
citometría de flujo de las células mieloides en la sangre y el bazo
La expansión de las células mieloides en la sangre periférica se midió utilizando un ensayo de bolas de sangre entera. Toda la sangre se recogió en tubos de EDTA de ratones vivos a través de la vena safena, y 25 l de sangre fresca se tiñó directamente con los cócteles de anticuerpos fluorescentes. Se añadieron un número conocido de perlas fluorescentes ACCUCHECK (Invitrogen) a cada muestra, a continuación, los glóbulos rojos se lisaron con Cal-Lyse solución de lisis de sangre completa (Invitrogen), y las muestras analizadas en un BD LSRII citómetro de flujo. Se determinó el número absoluto de células en la muestra en base a la comparación de eventos celulares a talón eventos (células /l). Por citometría de flujo análisis de esplenocitos, bazos homogeneizados se lavaron y se tiñeron con anticuerpos específicos para antígenos de superficie, a continuación, se lavaron las células y se fijaron utilizando una célula reguladora kit de tinción de T (eBiosciences) y intracelularmente tiñeron para FoxP3 y Ki67. La proporción de cada tipo de células infiltrantes se analizó en un BD LSRII. clasificación de flujo de células de la sangre se realizó utilizando un clasificador de células BD FACSAria a más de 98% de pureza. La morfología de las poblaciones de células clasificadas se determinó por Cytospin seguido de tinción con DiffQuick. Muestras de sangre fueron teñidas utilizando Wright's-tinción de Giemsa (Ricca Chemical Company, Arlington, TX). Las imágenes fueron adquiridas mediante un TE2000-S microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse con el software de adquisición y análisis de NIS-Elements, o en un escáner de diapositivas Leica SCN400.
citoquinas grano de Ensayo
Los tumores se cosecharon en hielo y se homogeneizaron en 4,5 l de PBS que contiene HALT inhibidor de la proteasa por mg de tejido. El residuo celular se eliminó por centrifugación a 14.000 g durante 15 minutos a 4 ° C, y los sobrenadantes se almacenaron en alícuotas a -80 ° C hasta su uso. Los niveles de citoquinas en los sobrenadantes fueron detectados utilizando un ensayo de bolas múltiplex murino (Life Technologies, Grand Island, NY) y se leyeron en un lector de matriz Luminex 100. Las concentraciones de citocinas de las réplicas de cada muestra de tumor se calcularon de acuerdo con una curva estándar.
cepa bacteriana y de vacunación
Acta-borrado (Δ
Acta
)
L. monocytogenes
expresar el péptido AH1-A5 Lm-AH1-A5) se han descrito anteriormente [17]. Las bacterias se cultivaron a midlog en caldo de infusión de cerebro-corazón, se lavaron y se resuspendieron en DPBS para inyección. Una dosis de 5 x 10
6 UFC fue entregado por vía intravenosa y se confirmó mediante siembra de inóculo residual. Los ratones de control o ratones portadores de tumores 4T1 que dejan sin tratar o tratados como los anteriores, con tres fracciones diarias de tratamiento de 20 Gy se vacunaron 1 día después de la dosis de radiación final con 5 × 10
6 UFC Lm-AH1-A5. Los bazos se recogieron 7 días después de la vacunación y suspensiones celulares se estimularon con 2 M de LLO
91-99 (GYKDGNEYI), AH1 (SPSYVYHQF) o vehículo DMSO en presencia de brefeldina A durante 5 horas a 37 ° C. células estimuladas se lavaron y se tiñeron con CD4-PerCP Cy5.5 y CD8-FITC, después se fijaron y se permeabilizaron usando un BD Cytofix /Cytoperm plus kit (BD Biosciences) y se congelaron a -80 ° C. Para el análisis de las células se descongelaron y se tiñeron con forma intracelular IFN-APC, TNF-PE-Cy7 y CD40L-PE. Las células se lavaron y se analizaron en un citómetro de flujo BD LSRII y los datos se interrogaron utilizando BD FACSDiva (BD Biosciences) y flojo (la estrella del árbol, Ashland, Oregón).
Estadísticas
Los datos fueron analizados y se representan usando Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA). números mieloides en la sangre a través del tiempo se ajustaron a curvas polinómicas de segundo orden utilizando Prism. conjuntos de datos individuales se compararon mediante la prueba t de Student y el análisis a través de múltiples grupos se realizó mediante ANOVA con grupos individuales evaluados mediante la comparación de Tukey.
Resultados
La expansión de las poblaciones mieloides se asocia con la progresión del cáncer en modelos animales y en pacientes con cáncer. En ratones, la expansión mieloide varía entre modelos de tumores, por ejemplo, con expansiones mieloides particularmente pronunciadas descritas en el modelo de carcinoma mamario 4T1 [18]. En estos modelos, los ratones portadores de tumores avanzados presentan extremadamente grandes bazos, que contiene una expansión particularmente notable en el CD11b
+ Gr1
+ población. Para realizar el seguimiento de expansión mieloide en los ratones a través del crecimiento del tumor, sin la necesidad de sacrificar al animal de monitorizamos poblaciones mieloides en la sangre periférica. Preparación estándar de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) por centrifugación en gradiente de densidad puede conducir a la pérdida de poblaciones de granulocitos, que constituyen la mayoría de las células mieloides en la sangre periférica. Por lo tanto, hemos desarrollado un flujo de sangre total ensayo de citometría de incorporación de recuento de perlas para medir el número absoluto de células mieloides circulantes. Las medidas repetidas de varios ratones demostraron que esta población mieloide expandido en 2-3 registra mediante el crecimiento del tumor, aumentando dramáticamente la celularidad global de la sangre periférica. En los ratones ingenuo el CD11b
+ células mieloides en términos generales consistía en Gr1
+ y Gr1
- células (Figura 1a), donde el CD11b
+ Gr1
+ células fueron uniformemente MHC de clase II ( IA) negativo y el CD11b
+ Gr1
- células incorporadas tanto MHC de clase II de las células negativas y positivas (Figura 1aii). En 4T1 ratones portadores de tumores se observó fenotipos similares, pero un gran aumento en el número de estas células, en particular una expansión de CD11b
+ Gr1
+ células, se observó consistente con las observaciones de otros investigadores [4] , [19]. La radioterapia de ratones portadores de tumores establecidos 4T1 controla el crecimiento tumoral; Sin embargo a pesar de altas dosis de radiación, los tumores se repiten de forma local (Figura 1b). La terapia de radiación del tumor primario resultó en una diferencia significativa en las células mieloides periféricas, en comparación con los ratones no tratados, dentro de una semana de terapia de radiación (p & lt; 0,01 día 21 después de la exposición tumoral) (Figura 1b). En este punto, el número de células mieloides circulantes en ratones tratados fueron significativamente inferiores a los niveles previos al tratamiento durante algo más de una semana antes de la expansión regresó (RT d14 vs. RT d21 (p & lt; 0,05), d14 RT vs. RT d23 ( p & lt; 0,05), RT d14 d27 vs. RT (p = 0,26)). El número de células mieloides en ratones tratados de circulación sigue siendo significativamente menor que en los ratones no tratados hasta aproximadamente dos semanas después del tratamiento (p & lt; 0,05 día 27 después de la exposición tumoral). En este punto, la recurrencia del tumor primario fue evidente (Figura 1BI) lo que sugiere una posible relación entre la carga del tumor primario y los números mieloides. Estos datos demuestran que la terapia de radiación del tumor primario se invierte de forma transitoria la expansión mieloide asociada al tumor.
a) i) La citometría de flujo de la sangre periférica entera fresca de ratones Balb /c portadores de tumores no tratados previamente y 4T1, mostrando CD11b
+ SSC
poblaciones mieloides hi. ii) Gr1 e IA (MHC de clase II) en la tinción cerrada CD11b
+ SSC
poblaciones mieloides hi de los ratones no tratados previamente y 4T1 portadores de tumores. b) i) Promedio y desviación estándar del diámetro de la pata de ratones BALB /c 4T1 que llevan tumores dejados sin tratar (NT) o tratados que comienza el día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy de radiación focal (RT). Mieloide células /l de sangre periférica ii) los ratones se deja sin tratamiento, y iii) los ratones tratados comenzando el día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy de radiación focal. iv) las curvas de los gráficos II equipado) y iii) trazados sin mediciones. c) i) ensayos por clonación de las metástasis pulmonares presentes en la eutanasia en ratones BALB /c que llevan 4T1 tumores dejados sin tratar (círculos vacíos - NT) o tratados que comienza el día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy de radiación focal (círculos negros - RT). ii) las células mieloides /l de sangre periférica de los ratones no tratados (Naïve) y ratones el día 17 después de la inyección intravenosa de 4T1 (I.v.) o s.c. (Por vía subcutánea) iii) celularidad total del bazo en ratones no tratados (NT) y los ratones el día 24 después de la inyección intravenosa de 4T1 (I.v.) o s.c. (Por vía subcutánea) d) i) células /l de sangre periférica mieloide de ratones C57BL /6 que llevan Panc02 tumorales recogidas en diferentes puntos temporales. ii) el día 24 de diámetro pierna y iii) las células mieloides /l de sangre periférica de ratones C57BL /6 que llevan Panc02 tumor se deja sin tratamiento (NT) o tratados que comienza el día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy de radiación focal (RT). En cada gráfico, cada símbolo representa un ratón. NS = No significativo; * = P & lt; 0,05; ** = P & lt; 0,01; *** = P & lt; 0,005; **** = P & lt; 0,001. Los datos representan varios experimentos repetidos.
El modelo 4T1 es espontánea metástasis, principalmente a los pulmones. Las metástasis se siembran dentro de los 10 días de la implantación del tumor primario - después de este tiempo la extirpación quirúrgica del tumor primario no cura los ratones, sino que eventualmente resulta en la mortalidad debido al crecimiento progresivo de la enfermedad metastásica [20]. Para controlar la progresión metastásica en nuestro modelo de radioterapia, cosechamos los pulmones de los ratones que requerían la eutanasia debido a su tumor primario inferior o igual a 12 mm, o debido a malas condiciones. En los ratones tratados con la terapia de radiación 14 días después del reto del tumor, control del tumor primario resultó en la cosecha de pulmón retardada en comparación con los ratones no tratados. Sin embargo, en la cosecha de pulmón, el análisis clonogénico demostró que las metástasis continuaron progresando (Figura 1CI). Incluso en los ratones cuando el tumor tratado con radiación se mantuvo estable, o que progresan lentamente, en un plazo de 35-50 días de desafío a todos los ratones se volvieron lo suficientemente mal como para requerir la eutanasia, y esto fue universalmente morbilidad asociadas con una amplia carga de la enfermedad pulmonar. Estos datos confirman gran cantidad de datos históricos que la radioterapia focal del tumor primario es una terapia altamente local, lo que resulta en el control del cáncer exclusivamente en el campo de radiación: en los cientos de miles de pacientes tratados por año con la terapia de radiación, efectos abscopal - inducida por el tratamiento de control de tumores fuera del campo de radiación - son extremadamente raros donde la radiación es la única modalidad de tratamiento [21]. Dado que la expansión mieloide en pacientes se ha asociado con la enfermedad invasiva y metastásica [5], es posible que la enfermedad metastásica residual impide la plena normalización de los números mieloides después de la terapia local. Para examinar la contribución de la enfermedad metastásica a la expansión mieloide, los ratones fueron inyectados con 4T1 tumores por vía intravenosa para formar directamente metástasis en ausencia de un tumor primario. Ratones portadores de la enfermedad metastásica única exhibido periférica expansión mieloide (Figura 1cii), pero hubo muchas menos células mieloides presentes que en los ratones con tumores primarios sub-cutánea síncronas. Esta relación se mantuvo en el bazo, donde sólo los ratones portadores de metástasis mostraron significativamente más células de ratones portadores no tumorales, pero esto fue significativamente menor que los ratones con tumores primarios sub-cutáneas (Figura 1ciii). Ya que sabemos que la radioterapia focal controla el tumor primario localmente pero no controla las metástasis, los ratones que recibieron la terapia de radiación conservar las funciones de su enfermedad local residual
y
su carga de tumor pulmonar. Por lo tanto, estos datos son consistentes con la combinación de la enfermedad local y metástasis residual prevenir los números mieloides que regresan a la línea de base después de la radioterapia, y es consistente con las observaciones después de la quimioterapia [9] y la escisión quirúrgica [9], [12].
Este efecto de la radioterapia no se limitaba al modelo 4T1. El modelo de tumor de adenocarcinoma de páncreas Panc02 impulsa expansión mieloide con la progresión tumoral, aunque en menor medida que 4T1 (Figura 1di). La terapia de radiación de tumores Panc02 causó un control transitoria del crecimiento del tumor (Figura 1dii), seguido por una consecuencia agresivo [22]. Como tratamiento de 4T1, la terapia de radiación para tumores Panc02 resultó en una disminución significativa en las células mieloides periféricos (Fig. 1diii). En conjunto, estos datos demuestran que la terapia citotóxica dirigida al tumor primario provoca un sistémica, aunque la inversión transitoria de la expansión mieloide impulsado por el crecimiento del tumor.
En el punto más bajo de las células mieloides en la sangre después de la radioterapia, los bazos fueron visiblemente más pequeño (Figura 2a). Nos contaron las células en el bazo como una medida de la contracción mieloide después de la radioterapia, y mientras celularidad total de bazo disminuyó siete días después de la radioterapia, se mantuvo en un tamaño intermedio - significativamente menos células que los ratones sin tratamiento (p & lt; 0,01) y significativamente más células que los ratones sin tumores (p & lt; 0,01) (Figura 2BI). Para determinar si la disminución en el número mieloides sistémicos fue causada por el tratamiento con radiación independientemente de los efectos sobre el tumor, los ratones portadores de tumores 4T1 fueron tratados con radiación para la pierna contralateral no portador de un tumor. Los ratones que recibieron terapia de radiación al tumor muestran significativamente menos células totales en el bazo de los ratones no tratados o aquellos tratados en la extremidad contralateral (Figura 2 BI). CD11b
+ células eran, con mucho, la mayor población en el bazo ampliada de ratones portadores de tumores, y el CD11b
+ población en el bazo mostraron un resultado intermedio similares después de la radioterapia del tumor primario, con los ratones tratados con la radioterapia de tumores que presentan un número significativamente menor CD11b
+ células que los ratones no tratados o ratones irradiados en la pierna no portadores de tumor (Figura 2 B II). Una vez más, a pesar de la reducción causada por la radiación del tumor, los ratones tratados retuvo una elevación significativa en las células mieloides sobre ratones portadores no tumorales y no hubo diferencia significativa entre los ratones no tratados y ratones irradiados a la pierna no tratamiento (Figura 2 B II). La respuesta mieloide similar a la radiación del tumor visto en la sangre periférica y en los resultados de bazo en una estrecha correlación entre estas medidas independientemente de tumor o el estado de tratamiento (Figura 2c). Dado que la terapia de radiación al tumor y a la extremidad opuesta se irradiar la piscina de sangre a través del tratamiento, que la terapia de radiación administrada a la extremidad opuesta es no reducir el número de mieloides en el bazo indica que el efecto sobre las poblaciones mieloides no se debe a los efectos directos de la radiación en las células mieloides o cualquier potencial de dispersión-dosis.
a) bazos recién extirpados de 4T1 ratones BALB /c portadores de tumores d24 dejan sin tratamiento (NT) o tratados a partir del día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy radiación focal (RT). Las cajas que se muestran son de 3 cm de ancho. b) i) celularidad total del bazo en ratones ingenuos (no tumoral) y los ratones el día 24 después de la inyección de 4T1 deja sin tratar (tumor NT) o tratados que comienza el día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy de radiación focal para el tumor (tumor RT) o a la extremidad opuesta no afectado (tumor pierna RT). ii) El número de CD11b
+ células por bazo en ratones del experimento se muestra en i). c) El número de CD11b
+ células en el bazo representa frente a la cantidad de CD11b
+ células /l de sangre periférica en la cosecha para cada grupo del tumor y el tratamiento.
Para determinar si cualquier población mieloide específica se vio especialmente afectada por la radioterapia, se realizó adicional sub-fenotipificación de las células mieloides en la sangre periférica. El anticuerpo reconoce tanto Gr1 Ly6G y Ly6C, y los anticuerpos a estos marcadores se utiliza para distinguir subpoblaciones dentro de CD11b
+ células [6]. En consonancia con la literatura, en el CD11b
+ Gr1
+ células fueron dos poblaciones principales que se distinguen por Ly6C y Ly6G: una población claramente distinta de Ly6G
-Ly6C
+ células y una gran población de Ly6G
+ células que muestran la variación expresión de Ly6C (Figura 3ai-III). Después de recibir radioterapia, hubo una pérdida aparente de CD11b
+ Gr1
+ Ly6G
+ células que expresan niveles más bajos de Ly6C (Figura 3aiii). El uso de controles para identificar Ly6G
+ Ly6c
- células (Figura 3aiv) hemos demostrado que la terapia de radiación al tumor resultó en una disminución significativa de CD11b
+ Gr1
+ Ly6G
+ células que fueron Ly6C
-. Esto no ocurrió cuando el miembro opuesto se irradió (Figura 3av). Para caracterizar estas poblaciones, se solucionaron estos sub-fenotipos de la sangre periférica de ratones portadores de tumores 4T1 (Figura 3B). De acuerdo con las caracterizaciones anteriores [6], Ly6G
-Ly6C
+ células tenían la morfología de los monocitos, Ly6G
+ Ly6C
+ tenía la morfología de los neutrófilos y Ly6G
+ Ly6C
- células tenían la morfología de los neutrófilos maduros. Del mismo modo, los frotis de sangre de los ratones portadores de tumores demostraron una marcada expansión en los neutrófilos, los cuales fueron muy disminuido después de la terapia de radiación al tumor (Figura 3c). Estos datos demuestran que la terapia de radiación de los resultados tumorales en una inversión particular de la expansión de neutrófilos impulsada por el tumor.
a) La citometría de flujo de la sangre periférica enteros y frescos de i) los ratones no tratados o ratones portadores de tumores 4T1 ii) no se tratan o iii) se irradió, mostrando Ly6C y Ly6G dentro de CD11b cerrada
+ Gr1
hi poblaciones mieloides. iv) Los histogramas de expresión Ly6C en cerrada CD11b
+ Gr1
hiLy6G
+ células, incluyendo tinción control negativo (FMO) y que muestra el porcentaje Ly6C
- en los ratones irradiados en el tumor (tumor RT) o el miembro opuesto (tumor pierna RT). v) El porcentaje de CD11b
+ Gr1
hiLy6G
+ células que son Ly6C
- a partir de ratones no tratados (n tumoral) y los ratones el día 24 después de la inyección de 4T1 deja sin tratar (tumor NT) o tratados comenzando el día 14 con 3 dosis diarias de radiación focal 20 Gy al tumor (tumor RT) o a la extremidad opuesta no afectado (tumor pierna RT). Cada símbolo representa un ratón. b) Cytospins de ordenada CD11b
+ Gr1
células hi de los ratones no tratados que son i) Ly6C
+ Ly6G
-, ii) Ly6C
+ Ly6G
+, o iii) Ly6C
-Ly6G
+. Cada citospina se muestra junto a la parcela pureza especie con una mayor ampliación en el cuadro de inserción. c) Wright-Giemsa tinción de frotis de sangre d24 de i) los ratones no tratados (n tumorales) y los ratones del día 24 después de la inyección de 4T1 ii) se deja sin tratar (tumor NT) o iii) tratados comenzando el día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy radiación focal en el tumor (tumor RT). El cuadro de inserción se hace girar y se muestra con aumento mayor. NS = No significativo; * = P & lt; 0,05; ** = P & lt; 0,01; *** = P & lt; 0,005; **** = P & lt; 0,001. Los datos representan múltiples experimentos replicados; cada subfigura incluye datos de un experimento de replicación diferente.
expansiones mieloides tumorales guiado están relacionados con el medio ambiente inflamatoria local y la expresión de GM-CSF por ingeniería genética [23] o IL-1β [24] por el cáncer las células se ha demostrado que impulsar la expansión mieloide. Para determinar si la terapia de radiación influenciada números mieloides mediante la modulación de estas citoquinas, se analizaron sus niveles en el tumor. Los niveles de GM-CSF, IL-1α, IL-1β y no se alteraron en el tumor después de la terapia de radiación (Figura 4a). Estos datos indican que el balance de estas citoquinas inflamatorias y factores de crecimiento en el tumor no está dirigiendo el cambio en los números de mieloides. Aunque no podemos descartar la regulación de otros factores de crecimiento, que es tal vez más relevante que después de la radioterapia de los tumores primarios son significativamente más pequeños por el diámetro (Figura 4bi) y el peso (Figura 4bii). Si se calcula el número de células en el bazo por mg de tumor primario, no hay diferencia entre ratones no tratados y se irradió (Figura 4biii). Por lo tanto, incluso sin la regulación del factor de crecimiento en el sitio del tumor, una carga tumoral más pequeño significará menos factores de crecimiento derivados del tumor para influir números mieloides. Por lo tanto, estos datos sugieren que la contracción mieloide siguiente citotóxica y terapia citorreductora está determinada principalmente por las fluctuaciones en el número de células cancerosas.
a) ensayo de bolas para i) GM-CSF, ii) la IL-1α y iii) IL-1β en homogeneizados de 4T1 tumores en día 24 después de la inyección de 4T1 deja sin tratar (NT) o tratados a partir del día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy de radiación focal en el tumor (RT) o en la extremidad opuesta no afectado (RT de Opp ). b) los gráficos reto d24 siguiente tumoral muestran i) de diámetro pierna ii) el peso del tumor y iii) esplenocitos por peso /tumor de bazo de los ratones se dejaron sin tratar (NT) o tratados que comienza el día 14 con 3 dosis diarias de 20 Gy de radiación focal (RT) . En cada gráfico, cada símbolo representa un ratón. NS = No significativo; * = P & lt; 0,05; ** = P & lt; 0,01; *** = P & lt; 0,005; **** = P & lt; 0,001. Los datos son representativos de tres experimentos repetidos.
Las subpoblaciones de células mieloides de ratones portadores de tumores puede ejercer efectos supresores sobre la función de las células T
in vitro
. Por esta razón se examinaron las células T en el bazo después de la radioterapia. Debido a la expansión mieloide en el bazo, las células T constituyen un porcentaje más pequeño de los esplenocitos; número sin embargo total de células T CD8 no fue diferente en los ratones portadores de tumor o después de la radioterapia del tumor (Figura 5a). Que las células T CD8 se mantienen constantes mientras que las células mieloides aumentan los resultados en un mieloide drásticamente sesgada: la proporción de células T - en el bazo aumenta la relación de una media de aproximadamente 1,7 CD11b
+ por CD8
+ para 29 CD11b
+ por CD8
+ (p & lt; 0,001). El resultado de la disminución inducida por la radiación en las células mieloides es una mejora en la mieloide: CD8 en el bazo - a 20 CD11b
+ por CD8
+ (p & lt; 0,01) - lo que sugiere un potencial algo mejorada para iniciar
de novo
respuestas inmunes. Consistente con los datos de las células T CD8, no hubo ningún cambio en el número de células no regulador CD4 T en ratones portadores de tumor y los ratones tratados en comparación con los controles (Figura 5b). Sin embargo, la carga tumoral y la radioterapia se acompaña de un aumento en el número de células T reguladoras (T
reg) en el bazo (Figura 5b), medido por CD4
+ células que expresan CD25 y FoxP3 (Figura S1 ). Curiosamente, la terapia de radiación aumentó significativamente la proliferación de las células CD8 T y células no reguladoras T CD4 (Figura 5C) como se mide por la expresión de Ki67 (Figura S1), lo que sugiere que las respuestas inmunes endógenos pueden ser más activos en el bazo después de la terapia de radiación de la tumor primario.