Extracto
La exposición humana al bisfenol A (BPA) es ubicuo. Los estudios en animales han encontrado que el BPA contribuye al desarrollo del cáncer de próstata, pero los datos humanos son escasos. Nuestro estudio examinó la asociación entre los niveles urinarios de BPA y cáncer de próstata y evaluó los efectos del BPA en la inducción de alteraciones del centrosoma como un mecanismo subyacente promoción de la carcinogénesis de próstata. El estudio, que incluyó a 60 pacientes de urología, encontrado niveles más altos de BPA urinario (creatinina ajustados) en pacientes con cáncer de próstata (5,74 mg /g [IC del 95%, 2,63, 12,51]) que en los pacientes con cáncer no prostático (1,43 mg /g [IC del 95%; 0,70; 2,88]) (
p = 0,012
). La diferencia fue aún más significativo en los pacientes & lt; 65 años de edad. Se observó una tendencia hacia una asociación negativa entre urinaria BPA y suero de PSA en pacientes con cáncer de próstata, pero no en pacientes con cáncer no prostático.
in vitro
estudios examinaron las anomalías centrosomales, la nucleación de microtúbulos, y el crecimiento independiente de anclaje en líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP cuatro, C4-2, 22Rv1, PC-3) y dos líneas de células epiteliales de próstata normales inmortalizadas (NPREC y RWPE-1). La exposición a dosis bajas (0,01 a 100 nM) de BPA aumentó el porcentaje de células con dos amplificación centrosoma a ocho veces. Respuestas a las dosis ya sea en pico o han llegado al mesetas con 0,1 nM de exposición BPA. Esta baja dosis también promovió la nucleación de los microtúbulos y el nuevo crecimiento en los centrosomas en RWPE-1 y mejoró el crecimiento independiente de anclaje en C4-2. Estos hallazgos sugieren que el nivel de BPA urinario es un marcador pronóstico independiente en el cáncer de próstata y que la exposición al BPA puede reducir los niveles séricos de PSA en pacientes con cáncer de próstata. Por otra parte, la interrupción del ciclo de duplicación del centrosoma por bajas dosis de BPA puede contribuir a la transformación neoplásica de la próstata
Visto:. Tarapore P, J Ying, Ouyang B, Burke B, B Bracken, Ho SM (2014) la exposición al bisfenol a se correlaciona con el inicio temprano del cáncer de próstata y promueve el centrosoma amplificación y crecimiento independiente de anclaje
in vitro
. PLoS ONE 9 (3): e90332. doi: 10.1371 /journal.pone.0090332
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Noviembre 2013; Aceptado 30 de enero de 2014; Publicado: 3 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Tarapore et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos nacionales de Salud (P30-ES006096, U01-ES019480, U01-ES020988), un Premio al Mérito Administración de Veteranos (I01-BX000675), una fuente de financiación interna de la Universidad de Cincinnati a SMH y PT y un médico Departamento de Programa de Investigación Dirigido por el Congreso de la concesión de Defensa (PC094619) a PT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la segunda neoplasia maligna más común entre los hombres en América del Norte. El envejecimiento es un factor de riesgo bien establecido para CaP [1]. Uno de cada seis hombres desarrollará CaP largo de su vida; Sin embargo, el cáncer rara vez se diagnostica en hombres y lt; 40 años de edad, con casi dos tercios de los casos reportados [2], [3] en los hombres a los 65 años de 2006 a 2010, la edad media al diagnóstico fue de 66 años de acuerdo con la las estadísticas del Instituto Nacional del cáncer de Vigilancia de Epidemiología y Resultados finales de Estudios (2013) [4]. Principales factores que contribuyen distintos de la edad son la raza y la historia de la familia [1], mientras que poco se sabe sobre el impacto de los disruptores endocrinos en el CP.
El bisfenol A (BPA) es un compuesto orgánico con la fórmula química (CH
3)
2C (C
6 H
4OH)
2. BPA se utiliza para hacer las resinas de plástico de policarbonato y resinas epoxi, que están presentes en miles de productos de consumo [5], [6]. En los Estados Unidos, la exposición a BPA es generalizada, superior a 90% en la población general [7]. La absorción dérmica, inhalación e ingestión de alimentos y agua contaminados son las principales vías de exposición [8]. Como un disruptor endocrino que imita el estrógeno y la hormona tiroidea, BPA también actúa como un disruptor metabólico y inmune. Por lo tanto, los efectos adversos sobre la salud del BPA son extensas [9], [10], y los niveles más altos de exposición al BPA se correlacionan con un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares, obesidad, diabetes, trastornos del sistema inmune, y una serie de disfunciones reproductivas [11], [ ,,,0],12], [13]. Por otra parte,
in vitro
en animales y los estudios han demostrado que la exposición al BPA puede aumentar el riesgo de glándula mamaria, el cerebro y los cánceres de próstata [9]. Sin embargo, los estudios en humanos que vinculan la exposición al BPA a mayor riesgo de cáncer son escasos. Uno de estos estudios en China mostró que la incidencia de meningioma fue 1,6 veces mayor en los adultos con mayores concentraciones de BPA en la orina que en aquellos con concentraciones más bajas [14]. estudios similares para CaP no han estado disponibles hasta ahora.
Un centrosoma comprende un par de estructuras cilíndricas llamadas
centriolos
ha rodeado de material de pericentriolar. Centrosomas están involucrados en la organización del citoesqueleto de microtúbulos interfase, husos mitóticos, y los cilios. Se cree que la disfunción del centrosoma (número e integridad), un sello distintivo de muchos tipos de cáncer, para iniciar la transformación neoplásica y promover la progresión de la enfermedad [15], [16]. Un número anormal de los centrosomas puede resultar en mitosis mono- o multipolar, lo que lleva a un aumento de la aneuploidía [15], [16]. Otra característica de interrupción centrosómicas es anormalidades en los microtúbulos (MT) nucleación y el anclaje. Tales anomalías se observaron con mayor frecuencia en las células de cáncer de mama que en las células epiteliales normales de mama [15], [16]. Además, un número significativo de genes asociados con un mayor riesgo CaP están en vías que conducen a la disfunción centrosoma [17], [18]. Estas observaciones nos han llevado a examinar, en los modelos basados en células, los efectos adversos del BPA en el ciclo del centrosoma como un mecanismo que contribuyen a la carcinogénesis de próstata.
Se utilizó un estudio clínico de la sección transversal para examinar la asociación entre la exposición al BPA y PCA. La hipótesis de que el BPA juega un papel en la carcinogénesis de próstata. Se encontró que los pacientes con CaP son más propensos que los que no tienen CaP a tener niveles más altos de BPA en la orina. Se ha observado una tendencia hacia una correlación negativa entre el BPA urinario y los niveles de PSA en suero en pacientes con CaP. Se realizó
in vitro
estudios para evaluar los efectos del BPA en número centrosoma, la formación del áster MT, y la colonización en agar blando en dos líneas inmortalizadas epiteliales normales de la próstata celulares (RWPE-1 y NPREC) y cuatro CaP líneas celulares (LNCaP, C4-2, 22Rv1, PC-3). Se encontró que el porcentaje de células con amplificación del centrosoma (CA) aumentó en respuesta a la exposición al BPA en dosis bajas y que la relación era no monótona para la mayoría de las líneas celulares. Por otra parte, la exposición a bajas dosis de BPA promueve la organización aster TM en el no canceroso RWPE-1 y aumenta el crecimiento independiente de anclaje en la línea celular C4-2 CaP independiente de los andrógenos. En conjunto, estos resultados revelan una relación previamente desconocida entre la exposición a BPA y CaP y sugieren un mecanismo que subyace en el papel de BPA en la transformación neoplásica y la progresión de la enfermedad.
Materiales y Métodos
Pacientes y la colección de las muestras de orina
los pacientes fueron reclutados de la clínica urológica en la Universidad de Cincinnati Medical Center bajo un protocolo aprobado por la Universidad de Cincinnati Junta de Revisión Institucional. La Tabla 1 enumera las características del paciente y la información de diagnóstico. Después de firmar un formulario de consentimiento informado, los pacientes fueron sometidos a un examen rectal digital y se les pidió que proporcionar una muestra de orina de 20 a 50 ml antes de su programada biopsia de próstata guiada por ultrasonido. Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por la Universidad de Cincinnati Junta de Revisión Institucional. Las muestras de orina se centrifugaron, se recogieron los sedimentos para un estudio de biomarcadores CaP [19], y los sobrenadantes se almacenaron en alícuotas a -80 ° C para el análisis de BPA. Entre las 60 muestras utilizadas para este estudio, 27 eran de pacientes con CP (CP) y 33 eran de pacientes sin CaP (no CaP).
Medición de BPA en las muestras de orina
niveles de BPA en las muestras se determinaron en el Laboratorio de Química Orgánica de la analítica del Centro Wadsworth del Departamento de Salud del Estado de Nueva York, (Albany, Nueva York). cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) acoplada con electrospray de triple cuadrupolo espectrometría de masas (ESI-MS /MS) se utilizó para cuantificar BPA, una técnica similar a la descrita anteriormente, con algunas modificaciones [20], [21]. En resumen, 500 l de cada muestra de orina se mezcló con 1 ml de glucuronidasa (2 l /ml) para la digestión y extracción. Para el control de calidad, 5 ng de
13 C
12-BPA se añadió a cada mezcla. Los extractos se aplicaron a una HPLC Agilent serie 1100 en interfaz con un Applied Biosystems API 2000 electrospray MS /MS (Applied Biosystems, Foster City, CA) para cuantitativa de BPA. Los datos fueron adquiridos mediante la supervisión en la reacción múltiple para las transiciones de 227 & gt; 212 para el BPA, y 239 & gt; 224 para
13 C
12-BPA. El límite de detección mínimo (MDL) del BPA en este protocolo fue de 0,05 ng /ml. Para concentraciones por debajo del MDL, se utilizó un valor igual a la MDL dividido por la raíz cuadrada de 2 en los análisis estadísticos [22]. Las concentraciones conocidas fueron corregidos para las recuperaciones de la norma sustituta (método de dilución isotópica). La norma de BPA se disparó a matrices de muestras seleccionadas y pasa a través de todo el procedimiento analítico dado una recuperación del 88% ± 8% (media ± DE). Una curva de calibración externa se preparó mediante la inyección de 10 l de 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 50, y 100 ng /ml de normas, y el coeficiente de regresión fue de 0,99.
Normalización de la orina BPA
niveles de creatinina en orina se utilizan para ajustar la variabilidad de dilución y para determinar la validez de una muestra de orina lugar para evaluar la exposición química [23]. Un kit de creatinina (urinaria) ensayo de Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI) se usó de acuerdo con el protocolo del fabricante para medir los niveles de creatinina urinaria. Los niveles de creatinina se utilizaron para ajustar las concentraciones urinarias de BPA medidos por el HPLC-ESI-MS /MS para obtener los niveles de BPA "creatinina ajustados" (niveles de BPA) en mg /g.
el CaP líneas de células PC-3, LNCaP, C4-2, y 22Rv1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en la norma, se recomienda, condiciones. Una descripción del origen de la línea celular inmortalizada NPREC epiteliales normales de la próstata se ha publicado [24]; la otra línea inmortalizada epiteliales normales de próstata celular, RWPE-1, se adquirió de ATCC (Manassas, VA) y se cultivó en medio de queratinocitos-SFM Definido (Invitrogen, Carlsbad, CA) con suplemento de crecimiento de la promoción. Los cultivos celulares se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado con un 5% de CO
2 atmósfera.
tratamientos BPA
Las células de cada línea celular se sembraron en placas de seis pocillos con cubreobjetos de vidrio en 25.000 células /pocillo. Después de 24 h, el medio se cambió a fenol medio libre de rojo con 10% de suero tratado con carbón vegetal durante otras 24 h, en cuyo momento se añadió BPA para lograr una concentración final de 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, o 100 nM. El experimento se repitió cinco veces para generar un total de cinco muestras por línea de células por concentración de BPA.
inmunofluorescencia indirecta
Para la inmunotinción de los centrosomas, las células se fijaron con metanol durante 5 minutos a -20 ° C y luego se procesa para γ-tubulina (anticuerpo GTU88 clon, Sigma Immunochemicals), α-tubulina (DM1A clon, Sigma Immunochemicals), y centrin (sc-50452, Santacruz Biotechnology) tinción como se describió anteriormente [25]. En breve, se extrajeron las células en 1% de NP-40 en PBS durante 10 min. Las células se probaron con anticuerpos primarios, y los complejos de anticuerpo-antígeno se detectaron con Alexa Fluor 488- o anticuerpos 594 conjugados (Molecular Probes). Las células también se tiñeron para el ADN con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Invitrogen). células inmuno fueron examinadas por microscopía de fluorescencia.
microtúbulos (MT) la formación de aster ensayo
El efecto de BPA en la dinámica de los microtúbulos se determinó mediante un ensayo de formación de aster MT descritos anteriormente [25]. En resumen, las células se trataron con nocodazol (1,5 mg /ml) durante 40 min en hielo para despolimerizar interfase MTs, se lavaron con PBS para eliminar el nocodazol, y se incubaron en medio caliente fresco durante 10 min a 37 ° C para permitir la MT rebrote .
Medidas
El número de centrosomas por célula fue anotado por microscopía de fluorescencia. Al menos 150 células se examinaron por tratamiento, y se usó el porcentaje de células con un número anormal de los centrosomas calculados a partir del número total de células examinadas como medida de resultado para el análisis. Una de las principales anormalidad en CA se definió como una célula con más de dos centrosomas.
independiente del anclaje ensayo de crecimiento
Las células se sometieron a ensayo para el crecimiento independiente de anclaje mediante la medición de la eficiencia de formación de colonias en semisólida medio como se describe [26]. En resumen, las células se cultivaron en las condiciones descritas anteriormente, en presencia o ausencia de 0,1 nM BPA, para ~ 10 pasajes. Elegimos 0,1 nM, porque esta concentración indujo el mayor porcentaje de células con CA para la mayoría de las líneas celulares (ver Resultados). Aproximadamente 2.500 células /35-mm así fueron incorporados en agar blando. Las células fueron alimentados dos veces por semana con medio fresco con y sin BPA. Después de 2-3 semanas, las colonias se contaron bajo un microscopio. Los experimentos se realizaron por triplicado y se repitió dos veces. Formadoras de colonias eficiencia es el número de colonias obtenidas dividido por el número total de células cultivadas en placas, multiplicado por 100.
El análisis estadístico
La medida principal en el análisis clínico fue una variable continua de urinario nivel de BPA después de la normalización o ajuste para el nivel de creatinina en orina. Inspección inicial de la distribución mostró que esta variable era muy sesgada hacia la derecha. Por lo tanto, su variable log-transformado (LnBPA) se utilizó como la variable dependiente en los modelos estadísticos. El modelo estadístico principal era un modelo de efectos fijos para evaluar la asociación entre el estado y LnBPA CaP (1 = sí; 0 = no). Se aplicaron métodos tanto no ajustados y ajustados a nuestro modelo de efectos fijos. En el método no ajustada, el estado de CaP fue la única variable independiente. En el método ajustado, se incluyeron edad (estratificada como la edad ≥65 vs. & lt; 65 años) y los niveles séricos de PSA como covariables que controlan. Se realizó
post hoc
comparaciones de medias entre el CP y los pacientes no-PCA y unas comparaciones similares en los subgrupos de pacientes estratificados por edad. pruebas de suma de rangos de Wilcoxon se utilizaron para validar los resultados de los modelos de efectos fijos para asegurar que todos sus resultados fueron robustos (datos no mostrados). Para BPA urinario y otras variables numéricas independientes tales como los niveles de PSA sérico, las relaciones fueron evaluados con modelos de regresión lineal y /o coeficientes de correlación.
En el
in vitro
análisis para cada línea celular, se utilizó el modelo de efectos fijos para evaluar la asociación del porcentaje de células con CA a la concentración de BPA se usa para tratar las células y
post hoc
el análisis ajustado para comparaciones múltiples utilizando el test de Bonferroni. Los datos del ensayo de crecimiento independiente de anclaje se analizaron mediante dos muestras
t-pruebas
. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con un software de SAS 9,3 paquete (SAS, Cary, NC).
P-valores
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
nivel de BPA urinario está asociado con CaP y puede tener valor pronóstico
Se estudiaron 60 pacientes de urología, 27 con CaP y 33 sin CaP. La edad media (± desviación estándar [DE]) de los pacientes con CaP fue 69,7 ± 10,3 años (min, 56 años; máx. 87 años); eran mayores que los no-PCA, que eran de 62,8 ± 7,15 años (min 46 años;.. como máximo 77 años;
p
= 0,003). Los niveles de PSA en suero de PCa y los pacientes no-PCA no fueron diferentes. La puntuación de Gleason del 71% de los pacientes con CaP fue de 6, y 7 en los otros. Sus características basales se resumen en la Tabla 1.
En todos los sujetos (CaP y no CaP), los niveles de BPA urinario no se asociaron con la edad y el PSA sérico y no se correlacionaron con la puntuación de Gleason del cáncer y el cáncer características relacionados con la PI en sujetos con CaP (Tabla 2). Sin embargo, los pacientes con PCa tenían mayores niveles de BPA urinario (creatina ajustado), con una media geométrica de CI 5.74 [95%; 2,63, 12,51] mg /g (media ± desviación estándar de 1,75 ± LnBPA de 1,97), mientras que los niveles de BPA en orina de pacientes con CaP no tenían una media geométrica de CI 1,43 [95%; 0,70, 2,88] mg /g (media ± desviación estándar de 0,35 ± LnBPA de 2,14;
p = 0,012
, la figura 1A & amp;. 1D). El análisis estratificado mostró que la asociación positiva fue significativa sólo entre los 30 pacientes urológicos menores de 65 años (media y mediana edad = 58 años de edad, la edad mínima = 46 años). En los pacientes más jóvenes (& lt; 65 años), la media geométrica de los niveles de BPA en orina en los pacientes con CaP fue 8,08 [IC del 95%; 2.40, 27.15] mg /g (media ± desviación estándar de 2,09 ± LnBPA de 1,71) frente a una media geométrica de CI 0.90 [95%; 0,36, 2,25] mg /g (media ± desviación estándar de LnBPA de -0.11 ± 2.09) entre los pacientes no PCA (
p = 0,006
; Fig. 1B & amp; 1D). Por otra parte, los análisis de regresión lineal de este grupo más joven reveló una tendencia hacia una asociación negativa entre los niveles de BPA en orina y las concentraciones de PSA sérico en los pacientes con CaP (n = 10, r = -0.52,
p
= 0,10), pero sin tal tendencia en pacientes no PCA (Fig. 1C). La correlación no significativa en el nivel debido al tamaño pequeño de la muestra 5%.
Los niveles urinarios de BPA están asociados con CaP. El BPA transformación logarítmica se conoce como LnBPA. Los valores en el gráfico son la media ± SD de LnBPA. (A) Los niveles urinarios de BPA son más altos en los pacientes con CaP que en los no-PCA. Medios de LnBPA = 1,75 ± 1,97 en el CP (azul, n = 27) frente a 0,35 ± 2,14 en la no-CP (rojo, n = 33),
p = 0,012
. (B) LnBPA en el CaP vs. LnBPA en la no-CP, estratificada por edad = 65 niveles de BPA en orina son significativamente mayores en los pacientes con CaP jóvenes que en los respectivos pacientes con CaP no sólo en el grupo de edad & lt; 65 años de edad;
p = 0,006
. análisis de regresión (C) lineal de suero de PSA en pacientes vs LnBPA & lt; solamente 65 años de edad (n = 30). cuadrados llenos azules representan los pacientes con CaP; rojas inversas-círculos representan los pacientes no CaP. líneas continuas azules y rojas representan las líneas de regresión, respectivamente. (D) La comparación de la media geométrica de BPA en el CP y los grupos no-PCA. La media geométrica (Geo) se define como la exponencial de la media de LnBPA. Los valores son medias geométricas (IC del 95%) de BPA en la unidad de mg /g de creatinina.
Las dosis bajas de BPA promueven la amplificación centrosoma (CA):
CA es comúnmente observada en los tumores humanos y es un factor importante que contribuye a la inestabilidad cromosómica [15], [27]. Dependiendo de si la célula está en el G1 o S /G2 /M del ciclo celular, las células normales muestran una o dos centrosomas, respectivamente. Se determinó si las células de tratamiento con BPA cambiado el número de centrosomas, mediante el tratamiento de cultivos de células con concentraciones crecientes de BPA (0,01 a 100 nM) (Figs. 2 y 3). Las células no tratadas que sirvieron como controles mostraron el perfil centrosoma normal esperado, en el que la mayoría de las células (& gt; 90%) contenía una o dos centrosomas (Fig 3-I, los grupos A, C, E, G, I, K. ). El NPREC sin tratar tenía menor cantidad de las células con aberraciones centrosomales (1,7%), seguido de C4-2 (2,9%), LNCaP (3,5%), 22Rv1 (4,9%), RWPE-1 (7,3%), y PC-3 ( 10,4%) (Fig.2). Por el contrario, todas las líneas celulares tratadas con BPA mostraron un aumento (de dos a ocho veces, Tabla 3) en el número de células con tres o más centrosomas (Fig. 2, Fig. 3-I paneles B, D, F, H, J, L). Las curvas de dosis-respuesta de las dos líneas celulares no cancerosas, NPREC y RWPE-1, y dos líneas de células de CaP, LNCaP y 22Rv1, revelan un (bifásica) relación de respuesta no monótona, con la respuesta máxima con 0,1 nM BPA ( Figura 2). Por otro lado, las otras dos líneas de CaP, C4-2 y PC-3, muestran una curva de dosis-respuesta que el aumento de mesetas en la misma baja concentración de BPA (0,1 nM) (Fig. 2). La línea de células epiteliales de próstata no canceroso inmortalizado NPREC-1, mostró el mayor cambio veces (media ± DE, 8,1 ± 2,4) en el perfil del centrosoma (Tabla 3), lo que sugiere que su ciclo de duplicación del centrosoma puede ser más sensible a los efectos de la baja -dose BPA en la promoción de CA.
las líneas celulares NPREC, RWPE1, LNCaP, C4-2, 22Rv1 y PC3 se trataron con medio que contenía% CSS 10 más el 0, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM y 100 nM BPA para 72 h. Las células fueron fijadas con metanol al 100% frío y se inmunotiñeron para centrosomas y núcleos. El número de centrosomas por célula fue marcado por microscopía de fluorescencia. Los resultados se muestran como un promedio determinado a partir de cinco experimentos separados. El gráfico de dispersión fue generado del porcentaje de células con un número anormal de los centrosomas en respuesta a BPA. Los análisis se ha realizado mediante un modelo de efectos fijos para cada línea celular.
post hoc
comparación de medias se ajustaron mediante pruebas de Bonferroni. El factor de cambio es el porcentaje de células anormales con los centrosomas en 0.1 nM BPA /el porcentaje de células anormales con los centrosomas a 0 nM BPA.
(I) Un aumento en el número de centrosoma. Las líneas celulares NPREC, RWPE1, LNCaP, C4-2, 22Rv1 y PC3 se trataron con medio que contiene 10% CSS plus 0 o 0,1 nM BPA para 72 h. Las células fueron fijadas con metanol al 100% frío y se inmunotiñeron para centrosomas (anti-γ-tubulina, rojo) y el núcleo (DAPI, azul). Las células fueron examinadas por microscopía de fluorescencia. Las flechas apuntan a las posiciones de los centrosomas, y los paneles de las imágenes derecha muestran ampliadas de las áreas indicadas. Barra de escala, 10 micras. (II) Centrosoma amplificación en presencia de BPA no es debido a la separación de centríolos. células RWPE-1 se trataron con 0,1 nM BPA durante 3 días. Las células se fijaron y se inmunotiñeron para centrosomas (anti-γ-tubulina, rojo), centríolos (anti-centrin, verde), y el núcleo (DAPI, azul). Las flechas apuntan a las posiciones de los centrosomas. Los paneles muestran en magnificada imágenes buenas de las áreas indicadas. Barra de escala, 10 micras.
dosis bajas de BPA no afectó la división centríolo
Estructuralmente, el centrosoma se compone de un par de estructuras cilíndricas llamadas centriolos que actúan como el la duplicación de unidades. Para verificar la integridad de los centrosomas, que immunostained células para centrin, un constituyente principal del cilindro centríolos, que permite la visualización de la pareja de centríolos dentro del centrosoma. Higo. La figura 3 muestra imágenes representativas de las células RWPE-1. Cada punto detectado por el anticuerpo para gamma-tubulina (Fig 3-II;. Paneles A y D) se resolvió a un par de puntos (que representa un par de centríolos) revelado por anticuerpo para centrin con una ampliación mayor (Fig 3-II.; los paneles B y e, los grupos a, una "d ', d"). Por consiguiente, estos datos indican que los centrosomas están intactas, que contiene un par de centriolos. Los perfiles centrosoma determinó por recuento de la señal de centrin fueron similares a los determinados por contar la señal de γ-tubulina (Fig. 2). Resultados para LNCaP, C4-2, 22Rv1, y las células NPREC fueron similares. Por lo tanto, el BPA no tuvo efectos sobre la separación del centrosoma o división centríolo.
Las dosis bajas de BPA mejorado la formación de aster MT
El anclaje de MTs y su posterior elongación para formar MT arrays radiales (aster) son eventos críticos durante la interfase y también conducen a la formación del huso mitótico asociados con la función del centrosoma normal [28]. células RWPE-1 próstata ensayadas para la formación de aster MT (Fig. 4). Las células fueron tratadas primero con nocodazole completamente en hielo para depolymerize MTs interfase; entonces nocodazole se retiró y las células se incubaron en medio caliente fresco para MT rebrote. La capacidad de los centrosomas para nuclear, ancla, y alargar MTs se determinó por co-inmunotinción para centrosomas (anti-γ-tubulina) y MTS (anti-α-tubulina). El aster MT actividad de centrosomas formando se evaluó de acuerdo con el protocolo establecido previamente [25]. No tratados células RWPE-1 mostraron la formación de aster insignificante. Después aguda de tratamiento de 2 h con 0,1 nM BPA, aster cortos se observaron 56% de las células. Tres días después del tratamiento con BPA (exposición crónica), ~37% de células mostró áster (Fig. 4A, 4B paneles g-i). Así, nuestros datos indican que el BPA aumenta la formación de MT aster.
Se realizó el ensayo de formación de aster microtúbulos 2-inmunotinción para centrosomas (anti-γ-tubulina, rojo) y MTS (anti-α-tubulina, verde). La formación de aster centrosómicas fue evaluado como positivo si centrosomas tenían un aster MT con más de 15 mts. Los resultados que se muestran en (A) son la media ± error estándar (EE) de tres experimentos. Para cada experimento, & gt; se examinaron 200 células. La significación se calcula utilizando la prueba t vs 24:00 de Student. *
p
≤0.00002.
exposición al BPA crónica promueve el crecimiento independiente de anclaje de células C4-2
La capacidad de la exposición al BPA crónica de transformar o promover maligna crecimiento de NPREC, RWPE-1, LNCaP, y las células C4-2 se determinó mediante un ensayo de colonias de formación en agar blando. Las células se cultivaron en medio con o sin 0,1 nM BPA durante 10-14 pasajes antes de que se sembraron en agar blando. La formación de colonias para NPREC, RWPE-1, y LNCaP fue & lt; 2%, y la exposición a 0,1 nM BPA no cambió la eficiencia de formación de colonias. Sin embargo, las células C4-2 BPA-expuestos producen sustancialmente más, más grande, de crecimiento más rápido colonias en agar blando (Tabla 4, Fig. 5). El porcentaje de eficiencia de formación de colonias (media ± DE) aumentó a 19,25 ± 7,05% con el tratamiento BPA comparación con 2,03 ± 0,40% en los controles no expuestos (
p Hotel & lt; 0,001). El diámetro de las colonias era 50 a 400 micras de controles vs. 100-1,200 micras de células C4-2 BPA-tratada.
imágenes representativas de las colonias después de 2 semanas de incubación en agar. células C4-2 en presencia de 0,1 nM BPA formaron colonias más grandes (B, B ', 100-1200 diámetro micras), en comparación con las cultivadas en ausencia de BPA (A, A', 50-400 diámetro m).
Discusión
La evidencia de que la exposición al BPA contribuye a CaP se deriva de los estudios en animales [29], [30], [31], [32] o basado en células [33 ], [34], [35], [36] modelos. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que proporciona evidencia preliminar de una asociación de la exposición al BPA con CaP en un entorno clínico. Nuestros resultados en 60 pacientes urológicos muestran que el nivel de BPA urinaria es un biomarcador pronóstico independiente del CP, ya que se detectaron niveles más altos de BPA en orina en los 27 pacientes con CaP (media geométrica, [IC del 95%, 2,63, 12,51] 5,74 mg /g creatinina) en comparación con los de los 33 pacientes no PCA (media geométrica, 1,43 [IC del 95%; 0,70, 2,88] g /g de creatinina) (
p
= 0,012). El límite de detección para este estudio fue de 0,05 ng /ml. Varios estudios de población han establecido ahora BPA como un contaminante ambiental ubicuo detectable en la orina de los individuos en la mayoría de las poblaciones de los Estados Unidos. En el primer estudio a gran escala de la sección transversal de la participación de los EE.UU. 2,517 participantes de la Encuesta Nacional 2003-2004 Examen de Salud y Nutrición (NHANES) [7], el BPA se detectó en el 93% de la población en una media geométrica y un 95
º percentil concentración de 2,6 mg /g y 11,2 g /g, respectivamente; el límite de detección fue de 0,4 ng /ml frente a 0,05 ng /ml en nuestro estudio. Un estudio posterior de 2.747 adultos participantes en el estudio NHANES 2003-2006 [37] informaron de una media geométrica de 2,05 mg /g de creatinina (25
percentil: 1:18, 75
percentil: 3,33); el límite inferior de detección fue de 0,36 ng /ml. Por lo tanto, la media geométrica de los niveles de BPA en orina en los pacientes con CaP en el presente estudio fue ~2-2.5 veces mayor que las medias geométricas de los Estados Unidos en grandes estudios transversales. Por el contrario, la media geométrica en los pacientes no CaP en este estudio fue ~ 50% más bajo que la media geométrica de estos dos estudios de población.
A fuerza de este estudio es el uso de el método recomendado por el centros para el control y la Prevención de Enfermedades que implican la extracción en fase sólida junto con la dilución de isótopos-HPLC-MS /MS para medir BPA urinaria total en un laboratorio de referencia. Por otra parte, hemos corregido por las variaciones causadas por factores que afectan a la dilución urinaria mediante la expresión de nuestros datos en relación con las concentraciones de creatinina en orina. Por último, todos los pacientes tenían confirmada por biopsia, en lugar de auto-reportados, el CP. Una posible limitación de nuestro estudio fue que el BPA urinaria total en nuestros pacientes se midió una sola vez. Sin embargo, de acuerdo con la literatura actual, las concentraciones de BPA urinaria total (libre más conjugados) en muestras puntuales (medición de una sola vez) es un método fiable para evaluar la exposición de todas las fuentes de referencia a través del tiempo cuando el tamaño de la muestra es suficientemente grande [38]. Aunque los estudios toxicocinéticos han demostrado que el BPA y su principal metabolito, el BPA-glucurónido, tienen vidas medias más cortas (~ 2,5 h) en el torrente sanguíneo y que se excretan rápidamente con la orina [39], [40], la población de la sección transversal los estudios han sugerido sustancialmente vidas medias más prolongadas debido a la exposición no alimentarios, la bioacumulación en los tejidos del cuerpo, como la grasa, y la función hepática, especialmente las relacionadas con la glucuronidación de BPA [12], [39]. La presencia de altas concentraciones de BPA en la orina puede indicar que los hábitos de vida de estos pacientes pueden mantener los niveles más altos de exposición. A este respecto, en un estudio clínico, los niveles de BPA en las muestras de orina recogidas en el mismo día a partir de parejas masculinas y femeninas correlacionados [41], el apoyo a la premisa de que los estilos de vida similares pueden determinar el nivel de exposición al BPA. Por otra parte, un estudio reciente mostró una mayor variabilidad dentro de la persona (más de 1-3 años) en los niveles de BPA en comparación con la variabilidad total de 80 mujeres [42]. En conjunto, estos estudios ponen de relieve la importancia de nuestro hallazgo de que un muestreo de una sola vez de BPA urinario se correlaciona con CaP.
El análisis estratificado mostró que la asociación entre los niveles de BPA en orina y PCA es altamente significativa (
p
= 0.006) entre los 30 pacientes & lt; y 65 años (media y mediana edad = 58, edad mínima = 46), pero que esta asociación no alcanzó significación entre la mitad de los pacientes & gt; 65 años (figura 1).. Estos hallazgos son interesantes, pero desconcertante. A primera vista, sugieren que una mayor exposición al BPA se asocia con la aparición temprana de CaP. Sin embargo, sobre la base de la teoría de la reprogramación de desarrollo del riesgo de cáncer [43], nuestros resultados plantean la posibilidad de reprogramación-vida temprana de CaP en los seres humanos. En estudios con ratas, los recién nacidos alimentados con niveles de relevancia ambiental de BPA tenían un mayor riesgo de desarrollar tumores de próstata [29], [44].