Antecedentes
Las células T reguladoras abstracto (Treg) que expresan el factor de transcripción forkhead-box proteína P3 (Foxp3) han sido identificados para contrarrestar las respuestas inmunes anti-tumorales durante la progresión del tumor. Además, la presentación de Foxp3 por las células cancerosas en sí también puede permitir que se evaden de efectores respuestas de células T, lo que resulta en un beneficio en la supervivencia del tumor. Para el cáncer colorrectal (CCR) la relevancia clínica de Foxp3 no ha sido evaluado en detalle. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue estudiar su impacto en el cáncer colorrectal (CCR).
métodos y las conclusiones
génica y análisis de proteínas de los tejidos tumorales de pacientes con CCR se realizó para cuantificar la expresión de Foxp3 en tumor infiltración de células de cáncer de colon y Treg. Los resultados se correlacionaron con los parámetros clínico y pacientes de supervivencia global. análisis morfológico Serial demostrado Foxp3 que se expresa en las células cancerosas. Alta expresión de Foxp3 de las células de cáncer se asocia con un mal pronóstico en comparación con los pacientes con baja expresión de Foxp3. En contraste, el nivel de bajo y alto Foxp3 en el tumor de infiltración de células Treg no mostró diferencias significativas en la supervivencia global del paciente.
Conclusiones
Nuestros hallazgos sugieren fuertemente que la expresión de Foxp3 mediada por células de cáncer en lugar de por Treg células contribuyen a la progresión de la enfermedad
Visto:. Kim M, Grimmig T, M Grimm, Lazariotou M, E Meier, Rosenwald a, et al. (2013) La expresión de Foxp3 en el cáncer colorrectal, pero no en las células Treg se correlaciona con la progresión de la enfermedad en pacientes con cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (1): e53630. doi: 10.1371 /journal.pone.0053630
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 7 de noviembre de 2011; Aceptado: 3 de diciembre de 2012; Publicado: 30 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La identificación de las células reguladoras CD4 + CD25 + T ( Treg) se ha demostrado que desempeñan un papel crucial en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. El factor de transcripción caja forkhead P3 proteína (Foxp3) se ha identificado como un jugador clave en la función de Treg y es un marcador obligado de CD4 + CD25 + Treg [1]. Algunas subclases de Treg ejercen su influencia supresiva a través de la expresión de citoquinas inmunosupresoras, tales como interleucina (IL) -10 y factor de crecimiento transformante (TGF) -β [2], [3]. Una alta densidad de tumor infiltrante Foxp3 + Treg en la muestra de tumor se ha asociado con un mal resultado en varios tumores sólidos, incluyendo ovario [4], de páncreas [5], y carcinoma hepatocelular [6]. Estos resultados sugieren un papel crucial para Treg en diferentes entidades tumorales. Por lo tanto la orientación de Treg puede tener un impacto importante en las estrategias de inmunoterapia contra el cáncer y el resultado clínico de los pacientes con cáncer [7].
Treg son sospechosos de reducción de actividad de las células T, pero no se sabe si la presencia de Treg pueden tener un impacto en la evolución clínica y en la supervivencia relacionada con tumor de los pacientes con CRC. El significado pronóstico de la detección de Treg en pacientes con enfermedad limitada y avanzado permanece todavía controvertida. Hasta la fecha, pocos estudios han analizado la infiltración en el CCR Treg Foxp3 + usando tinción. Un estudio reciente demostró que la densidad fue mayor en Treg localmente limitada que en la enfermedad metastásica, pero no se asoció con la supervivencia de pacientes con CRC [8]. Contrariamente a los resultados observados en la mayoría de los otros carcinomas humanos, no se observó una relación significativa entre el número absoluto de Foxp3 + células T infiltrantes y el pronóstico en varios estudios con pacientes con CCR. Por otra parte, otros estudios sugieren que una alta frecuencia de tumor infiltrante Foxp3 + Treg se asocia con un pronóstico favorable en el CCR [9].
Los datos clínicos más recientes de pulmón [10], de mama [11], [12] , de páncreas [13], hepatocelular [14], y el cáncer de vejiga urinaria [15], así como melanoma [16] proporcionan primera evidencia de una expresión Foxp3 también en células tumorales. Sin embargo, se desconoce la importancia biológica de la expresión de Foxp3 en las células cancerosas de pacientes con CRC. En particular, la contribución de la expresión de Foxp3 en relación con las células tumorales en comparación con la expresión relacionada con Treg en el CCR clínica no se ha evaluado hasta ahora. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue evaluar la expresión de Foxp3 entre el tumor infiltración de células Treg y el cáncer en pacientes con CCR en diferentes etapas de la enfermedad, así como para discriminar su significado pronóstico a largo plazo.
Resultados
Detección de CD4, CD25, Foxp3 y citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF-ß genes por RT-qPCR y análisis inmunohistoquímico
Para analizar si CD4, CD25, Foxp3, IL-10, y la expresión de TGF-β en CRC puede estar asociada con la progresión tumoral clínico se investigó tumores de enfermedad limitada (UICC I /II) y enfermedad avanzada (UICC III /IV). análisis RT-qPCR observó una elevación significativa de la expresión génica de las células CD4 y CD25 en tumores de enfermedad limitada (UICC I /II) en comparación con los tumores de enfermedad avanzada (UICC III /IV). De acuerdo con este hallazgo, la expresión del gen de Foxp3 y citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF-β se redujo significativamente en los tumores de enfermedad limitada (UICC I /II) en comparación con los de la enfermedad avanzada (UICC III /IV) (
Figura
1A
).
(a) aumento significativo de la expresión génica de las células CD4 y CD25 en la etapa de la UICC I /II en comparación con los tumores en estadio UICC III /IV. La expresión de genes de Foxp3, IL-10, y TGF-β se redujo significativamente en la fase I /II en comparación con los de UICC III /IV. La normalización se realizó con el tejido normal. El valor de cuantificación relativa, veces de diferencia, se expresa como 2
-ΔΔCt. * P & lt; 0,001. (B) Foxp3 +, IL-10 +, y TGF-β + que expresan las células de cáncer aumentó de UICC I /II de la UICC III /IV en comparación con el tejido normal. El resultado de la tinción se expresa en porcentajes de positividad (%). Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar; todas las pruebas por parejas (Tukey) dar lugar a p & lt; 0,001, con excepción de control frente a la UICC I /II en Foxp3
+ (p & lt; 0,050).
A continuación, se analizó la expresión de Foxp3 y citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF-β en las células cancerosas. Como se muestra en
Figura
1B
, Foxp3 +, la IL-10 +, y TGF-β + que expresan las células de cáncer aumentaron entre principios y etapas tardías de la enfermedad en comparación con el tejido normal. Se encontraron Foxp3
+ células cancerosas que expresan en 60 de los 65 casos de tumores (n = 60/65, 92,3%). Además, teñidas 36 de los generales de 65 casos con un anticuerpo anti-Foxp3 diferente (clon 2481) y confirmó los resultados (datos no mostrados).
El análisis inmunohistoquímico de las células CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, y citoquinas inmunosupresoras IL -10+ y TGF-β + Treg en
a continuación examinó Treg y las células cancerosas para un análisis detallado de la expresión de Foxp3, IL-10 y TGF-β mediante técnicas de inmunohistoquímica. En primer lugar, se analizó la expresión de CD4 +, CD25 +, + Foxp3, y citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF-ß de Treg. Como se muestra en
Figura
2A
, el aumento de CD4 +, CD25 +, Foxp3 +, IL-10 +, y TGF-β + expresión se observó en los tumores de enfermedad limitada (UICC I /II) en comparación a los tumores avanzados de la enfermedad (UICC III /IV) y el tejido normal. En general, Foxp3 + Treg expresar en cantidades diferentes se encontraron en 61 de 65 tumores de los pacientes (n = 61/65, 93,8%). Inmunofluorescencia doble tinción demostró que Foxp3 + Treg eran de un fenotipo de células T CD4 + (
Figura
2B
). Sólo se encontró una porción muy pequeña de menos del 5% de las células para representar una subpoblación de células T CD8 + que expresan Foxp3 (datos
no se muestra
).
(A) Aumento de CD4 +, CD25 +, Foxp3 + , IL-10 +, y TGF-β + expresión en la etapa UICC I /II en comparación con los de UICC III /IV. El resultado de la tinción se expresa en porcentajes de positividad (%). Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar. Todas las pruebas pairwise resultan en p & lt; 0,001 con tres excepciones: Foxp3
+, control vs. UICC III /IV, p = 0,091; IL-10
+, la UICC I /II vs UICC III /IV, p = 0,021; TGF-ß
+, la UICC I /II vs UICC III /IV, p = 0,020. (B) Ejemplo representativo de un doble tinción de inmunofluorescencia de Foxp3 + y CD4 + en Treg. Foxp3 expresión se observó principalmente en las células CD4 + T reguladoras (flecha) (magnificación × 400). FITC, verde fluoresceinisotiocianato, Cy3, indocarbocyanin rojo, y DAPI 4 ', 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Contratinción nuclear
Gene y análisis de proteínas de la expresión de Foxp3 en las células cancerosas de pacientes con CRC y en líneas celulares de cáncer de colon humano por RT-qPCR, inmunofluorescencia doble tinción y citometría de flujo
en primer lugar hemos demostrado la expresión de Foxp3 en las células cancerosas de los pacientes con CCR mediante inmunofluorescencia doble tinción (
Figura
3
). Para confirmar la expresión de Foxp3 en las células tumorales se realizó RT-qPCR, análisis de FACS y la inmunofluorescencia doble tinción análisis en diferentes líneas celulares de cáncer de colon humano (SW480, SW620, y HCT-116). Como se ha demostrado por FACS 3,8% al 6,1% de las células de cáncer de hecho expresadas Foxp3 (
Figura
4A y B Opiniones).
G
eno análisis por RT-qPCR confirmó su expresión (expresión relativa en las líneas celulares osciló entre 1,76 y 2,08,
Tabla
1 |).
ejemplo representativo de un doble tinción de inmunofluorescencia, que muestra la expresión de Foxp3 y costaining EPCAM en las células cancerosas de los pacientes con CCR (100 × magnificación anteriormente; magnificación × 400 más abajo). FITC, verde fluoresceinisotiocianato, Cy3, indocarbocyanin rojo y DAPI 4 ', 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Nuclear counterstaining
(A) ensayo de citometría de flujo de la expresión de Foxp3 en SW480, SW620, y líneas celulares de cáncer de colon HCT-116 en comparación con el control de isotipo. 3,8% a 6,1% de las células de cáncer de colon Foxp3 expreso; PE: ficoeritrina; FS: delantero de dispersión lineal. (B) Los ejemplos representativos de inmunofluorescencia doble tinción de Foxp3 + expresión en SW480, SW620, y las células de cáncer HCT-116. Cy3, indocarbocyanin rojo y DAPI 4 ', 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Counterstaining nuclear (magnificación × 400)
Correlación de las células cancerosas Foxp3 + con la expresión de citoquinas inmunosupresoras IL -10 y TGF-β
para examinar si la expresión de las citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF-β se correspondían con el Foxp3 + que expresan las células cancerosas se estratificó en dos grupos diferentes de acuerdo con los porcentajes de expresión en la inmunohistoquímica análisis. Teniendo en cuenta Foxp3 + expresión en las células del cáncer como una variable continua, el análisis de regresión mostró que la expresión celular de cáncer de Foxp3 + tenía una correlación directa débil pero significativa con la expresión de las citoquinas inmunosupresoras IL-10 (R
2 = 0,23, p & lt; 0,001, n = 65; r = 0,48) y el TGF-β (R
2 = 0,33, p & lt; 0,001, n = 65; r = 0,57) (
Figura
5A y B Opiniones) .
(A /B) correlación significativa de la expresión de células de cáncer Foxp3 + con la expresión de IL-10 (A) y TGF-β (B). Análisis de regresión; R
2, coeficiente de determinación. (C /D) Ejemplo representativo de un doble tinción de inmunofluorescencia de IL-10 + (C) y TGF-β + (D) en Foxp3 + células cancerosas (flechas). FITC verde fluoresceinisotiocianato, Cy3 rojo y DAPI 4 ', 6-diamidino-2- phenylindoldihydrochlorid azul -. Contratinción nuclear
inmunofluorescencia doble tinción indicaron la expresión de las citoquinas inmunosupresoras IL-10 y TGF-beta en Foxp3 + que expresan las células cancerosas (flechas) (
Figura
5C y D
).
Correlación de Foxp3 + Treg con células de cáncer de Foxp3 +
Para examinar si Foxp3 + expresión Treg se correspondía con la expresión en células de cáncer de Foxp3 +, se estratificó dos grupos diferentes de acuerdo a los porcentajes expresión de análisis inmunohistoquímico. Teniendo en cuenta la expresión de células de cáncer de Foxp3 + como una variable continua, el análisis de regresión mostró que la expresión celular de cáncer de Foxp3 + tenía una débil pero significativa correlación inversa con la expresión de Foxp3 + Treg (R
2 = 0,17, p = 0,01, n = 65; r = -0.41) (
Figura
6A
). La inmunohistoquímica mostró un incremento en la expresión de Foxp3 + Treg Foxp3 en negativo cáncer de tejido estromal (flecha) (
Figura
6B
). En contraste, no hubo o expresión insignificante Foxp3 + Treg Foxp3 que se encuentra en el tejido de cáncer positivo (flecha) (
Figura
6C
).
(a) es significativa correlación inversa de la expresión de células Foxp3 + cáncer con la expresión de Foxp3 Treg. Análisis de regresión; R
2, coeficiente de determinación. (B) Un mayor número de Foxp3 + Treg Foxp3 en el tejido de cáncer negativo (flecha). (C) Sólo de vez en cuando o ninguna Foxp3 + Treg Foxp3 en el tejido canceroso positivo (flecha). DAB de color marrón, Haemalaun color azul - contratinción nuclear. Ejemplo representativo demuestra zona de aumentos x100 (izquierda) y x200 (derecha).
La supervivencia global
Análisis multivariado de regresión de Cox se realizó por etapas incluyendo la edad, el género, el tumor primario (colon o recto), la UICC (I /II o III /IV), la profundidad de la invasión tumoral (T categoría 1/2 o 3/4), la diferenciación (1/2 o 3/4), metástasis de ganglios linfáticos (categoría N), Foxp3 (%), Treg (%), TGF-ß (%), e IL-10 (%). El procedimiento por pasos mantuvo en el modelo de la categoría N y la expresión de Foxp3 en células de cáncer de colon como parámetros de pronóstico (estadística Chi-square, p & lt; 0,01,
Tabla
2
).
resultados univariados utilizando de Kaplan-Meier
Los factores pronósticos identificados a partir del modelo de regresión de Cox se presentan en las Figuras 7A y C. El valor medio de expresión de células de cáncer de Foxp3 + mediante análisis inmunohistoquímico para todas las muestras de tejidos estudiados de los 65 tumores se determinó en el 16%. Entre los pacientes con CCR, los que tienen alta Foxp3 + expresión de células de cáncer (& gt; 16%) tuvieron un peor pronóstico que aquellos con niveles de Foxp3 + expresión bajas (& lt; 16%) (p & lt; 0,001, test log-rank) (
Figura
7A
y
Tabla
3
).
(A) Los pacientes con alta expresión de Foxp3 + células cancerosas ( & gt; 16%, como media de corte) tuvo un peor pronóstico que aquellos con los perfiles de expresión de Foxp3 + células de cáncer de bajas (& lt; 16%, con una media de corte: 16%), (p & lt; 0,001, prueba de Log-Rank). (B) No hay diferencia significativa en la supervivencia global comparando pacientes con perfiles de expresión de bajo y alto Foxp3 + Treg (media de corte: 12%), (p = 0,202, test log-rank). (C) Los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos tuvieron un peor pronóstico que los que no tienen metástasis en los ganglios linfáticos (p & lt; 0,001, log-rank test). Los tiempos de los datos censurados se indican mediante líneas verticales cortas.
Teniendo en cuenta el análisis inmunohistoquímico de las muestras de las muestras 65 de tejido para la expresión de Foxp3 + Treg se calculó el valor medio en un 12%. No hubo diferencia significativa en la supervivencia global comparando pacientes con niveles bajos y altos de expresión de Foxp3 + Treg (& gt; 12% o & lt; 12%) (p = 0,204, test log-rank) (
Figura
7B
y
Tabla
3
).
en los pacientes sin metástasis en los ganglios linfáticos se observaron diferencias significativas en la supervivencia global en comparación con los pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos. (p & lt; 0,001, prueba de log-rank) (
Figura
7C
)
Otros parámetros tales como el TGF-ß, IL-10, la UICC, y la categoría T mostraron diferencias adicionalmente significativas en la supervivencia global para la correspondiente expresión y grados inferiores, respectivamente (p & lt; 0,001, test de rangos logarítmicos) guía
la edad, el sexo, el tumor primario, y la diferenciación histológica no se asociaron con. el pronóstico en el análisis univariado.
Discusión
el presente estudio proporciona por primera vez pruebas de un aumento significativo de la expresión relacionada con el tumor del factor de transcripción Foxp3 en células de cáncer colorrectal que se asocia con un pronóstico adverso . proteína detallada y el análisis de genes se utilizó para estudiar sus perfiles de expresión en cada tejido tumoral de los pacientes. Con base en los hallazgos clínicos más recientemente descritos de una expresión de Foxp3 en las células cancerosas de los tumores como de pulmón, hepatocelular y cáncer de vejiga urinaria, así como melanoma hemos sugerido que los niveles de expresión elevada Foxp3 no fueron necesariamente asociados a Treg solo, sino también a las células del cáncer [10 ], [14], [15]. La expresión de Foxp3 por las células cancerosas les permitiría regular por disminución las respuestas de células T efectoras dirigidos contra el tumor. Esto daría a la evidencia clínica de un mecanismo eficaz de una evasión directa tumor derivado de la destrucción inmunológica en el CCR. Al discriminar la expresión de Foxp3 de las células cancerosas se infiltren Treg y la correlación con la supervivencia global durante un largo plazo de seguimiento que proporcionamos nuevos conocimientos en su significado pronóstico.
De acuerdo con estudios anteriores en varias enfermedades malignas encontramos significativamente los números más altos de la infiltración de Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 +) en todas las muestras de CRC en comparación con tejidos de colon normales [4] - [6], [17] - [20]. Sin embargo, la asociación de la expresión de Foxp3 en Treg y su impacto sobre la supervivencia global sigue siendo controvertido. datos ambiguos sugieren que la infiltración del tumor por Foxp3 + Treg no siempre se asocia con un mal pronóstico, pero, por el contrario, pueden estar asociados con un mejor pronóstico en algunos tipos de cáncer como en el CCR [8], [9], [21], [22]. Por otra parte, no se observó una relación significativa entre el número absoluto de Foxp3 + Treg y el pronóstico en el CCR [23], [24]. Mejora de la supervivencia y el papel potencialmente protector de Treg podrían explicarse por su capacidad de reducir el desarrollo de una agresiva y citotóxicos, potencialmente proliferogenic medio de citocinas, que es la base para un progreso inflamación impulsada de enfermedades malignas [25], [26] .
los estudios experimentales en ratones mostraron que las células CD4 + CD25 + Treg no sólo juegan un papel central en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica, sino que también Treg son potentes inhibidores de las respuestas inmunitarias antitumorales [27], [28]. Estudios previos han examinado la capacidad de supresión de células T CD8 + + CD25 + Foxp3 en tejidos de cáncer de colon [29]. En CRC especímenes el número absoluto de células T CD8 + CD25 + Foxp3 + fueron bajos (& lt; 5%). Además, estas células estaban ausentes en la mayoría de muestras de tejido normal, pero presente en la mayoría de los especímenes de CRC; sin embargo, su relevancia clínica sigue siendo desconocido [29]. Varios grupos observaron la expresión de Foxp3 por varios tipos de cáncer y su potencial papel en la vigilancia inmunológica mediante la producción de citoquinas inmunosupresoras como la IL-10 y TGF-β [30].
Por último, se analizó la supervivencia global de los pacientes con baja o alta infiltración Foxp3 + Treg en el tumor en comparación con la supervivencia de pacientes con la expresión baja o alta Foxp3 de sus células cancerosas. Aquellos pacientes con alta Foxp3 + perfil de expresión en células de cáncer se asociaron con un peor pronóstico que los pacientes con bajo perfil de expresión de Foxp3 + en sus células cancerosas. Esta correlación de patrón de alta expresión Foxp3 con mal pronóstico no se observó para la infiltración de Treg en el tumor. Las células cancerosas la expresión de Foxp3 seguido por la secreción de citoquinas inmunosupresoras en el microambiente del tejido tumoral puede dar el tumor una poderosa herramienta para eludir la destrucción inmunológica. Curiosamente, se observó una correlación inversa entre el número de Foxp3 + Treg y el nivel de células de cáncer de Foxp3 + en nuestros pacientes con CRC que sugiere un efecto anti-proliferativo de TGF-β en Treg.
En conclusión, a pesar del hecho que el tamaño de la muestra en esta cohorte es pequeño para sacar conclusiones definitivas, nuestro estudio muestra por primera vez este que la alta expresión de Foxp3 en células de cáncer se asocia con un mal pronóstico en el CCR. Análisis multivariado de regresión de Cox demostró metástasis en los ganglios linfáticos (categoría N) y la expresión de Foxp3 en células de cáncer de colon como parámetros de pronóstico significativo de la supervivencia en el CCR humano.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
la aprobación ética para este estudio se obtuvo del Comité Ético de investigación humana de la Universidad de Würzburg. Todos los pacientes con toma de tejido tumoral, así como muestras de tejidos de colon normales firmaron un formulario de consentimiento antes de la extirpación quirúrgica del cáncer intestinal para permitir esta investigación a realizar.
Pacientes y controles
El sesenta cinco pacientes con diagnóstico histológico de cáncer de CRC sometidos a resección quirúrgica curativa en nuestro servicio entre 01/2001 y 06/2004 se incluyeron en el estudio. La etapa histológico del tumor se determinó de acuerdo con el sistema de puesta en escena -TNM Union Internationale Contre le Cancer (UICC) [31]. Los tumores fueron evaluados para la ubicación, el estadio y el grado de diferenciación. Los datos relativos a la edad, sexo, nivel de infiltración de la pared, y la metástasis de los ganglios linfáticos fueron recogidos en una base de datos. visitas médicas regulares de los pacientes después de la terapia curativa se realizaron a intervalos de acuerdo con las directrices gubernamentales para pacientes con tumores. Los pacientes que se sometieron a ningún tratamiento neoadyuvante o resección R1 se excluyeron del análisis. muestras de tejido tumoral, así como muestras de tejidos de colon normales de los pacientes se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis. tejidos de colon normales de individuos sanos sirvieron como controles (n = 10). El análisis inmunohistoquímico confirmó que no hay tumor analizado desde la cohorte de pacientes expresó hMLH1 y hMSH2 indicativo de inestabilidad de microsatélites (reparación de genes positivos [MMR] de estado). El fenotipo mucinoso de CRC podría estar asociada con falsas reacciones positivas subcelulares mediante técnicas de inmunohistoquímica y por lo tanto fue excluido de nuestro estudio. Características clínicas de la población del estudio se resumen en la
Tabla 3
. Todos los pacientes completaron por lo menos unos 60 meses de seguimiento después de la resección.
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer de colon humano SW620, SW480, y HCT-116 se obtuvieron a partir de ATCC (Manassas, VA ) y las células se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2 utilizando medio RPMI 1640 (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad, CA) suplementado con 10% (v) de suero v /bovino fetal (Life Technologies, GIBCO, Carlsbad , CA), 1% (v /v) L-glutamina (Biochrom AG, Berlín, Alemania) y 1% (v /v) de penicilina /estreptomicina (Biochrom AG, Berlin, Alemania) |
. citometría de flujo análisis (FACS)
las células cancerosas de las líneas celulares de cáncer de colon humano SW620, SW480, y HCT-116 fueron cosechadas en una fase de crecimiento exponencial utilizando la solución de enzima libre de disociación celular (Merck Millipore, Billerica, MA) y analizados para la expresión de Foxp3. Después de lavar con DPBS (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) dos veces, 5 × 10
5 se trataron las células con el kit de tinción de amortiguación Foxp3 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubaron con PE- anticuerpo conjugado Foxp3 o IgG1 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) durante 30 min a 4 ° C en la oscuridad. La fluorescencia de Foxp3 se midió y se analizó con un citómetro de flujo FACS (Coulter EPICS XL, Beckman Coulter, Brea, EE.UU.).
inmunohistoquímico y de inmunofluorescencia tinción
anticuerpos
CD4 y CD25 fueron proporcionados por Dako (Hamburgo, Alemania). Dos clones de anticuerpos Foxp3 diferentes (ab22510 monoclonal de ratón y de cabra ab2481 policlonales) se adquirieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido), el anticuerpo TGF-β fue proporcionado por Serotec (Düsseldorf, Alemania), y IL-10 anticuerpo por R & amp; D Systems (Wiesbaden -Nordenstadt, Alemania). anticuerpos de control de isotipo se adquirieron de eBioscience (San Diego, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios utilizados para inmunofluorescencia doble tinción inmunohistoquímica y fueron proporcionados por Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (Suffolk, Inglaterra). EPCAM Secundaria y anticuerpos CD4 fueron FITC-conjugado AffiniPure burro IgG anti-cabra y anticuerpo secundario de Foxp3, IL-10, y TGF-β fue conjugado con Cy3 AffiniPure burro anti-IgG de ratón a una dilución 1:200 (Jackson ImmunoResearch).
Para las células de carcinoma colorrectal cytospin preparativos de los pacientes con CCR se cultivaron en cultivos primarios de corto plazo y líneas celulares de cáncer de colon humano establecidas fueron cosechadas en una fase de crecimiento exponencial usando una solución de disociación celular enzima libre (Merck Millipore, Billerica , MA). Después de lavar con DPBS (Life Technologies, Gibco, Carlsbad, CA) dos veces, las células se ajustaron a una concentración de 2 x 10
5 células /ml. Cytospins se realizaron con suspensión de células 50 l a 550 rpm durante 1 min en un Cytospin4 citocentrífuga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
La tinción de CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, e IL 10 se realizó en secciones de criostato de serie de los 65 especímenes de CRC se congelaron en tumores en etapa temprana (UICC I /II) y los tumores en etapa tardía (UICC III /IV) con el tejido normal del colon vecinos y 10 especímenes de colon normal. Todos los tumores se tiñeron positivas para citoqueratina-20 (CK-20) (Dako, Hamburg, Alemania) y negativo para citoqueratina-7 (CK-7) (Dako), un patrón característico de adenocarcinoma de colon [32]. En primer lugar se evaluó H.E. secciones de cada tejido tumoral para diferenciar entre las áreas celulares de cáncer, áreas del estroma y la infiltración de células inmunes. A continuación, se tiñeron para CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, e IL-10 en las siguientes secciones de serie. Para citoplásmica Foxp3 expresión, citoplasmático perinuclear, y patrón de tinción nuclear se determinaron diferencialmente [30]. secciones de criostato de serie (5 M) se incubaron con el anticuerpo primario o anticuerpo de control y con el anticuerpo secundario conjugado con FITC (fluoresceinisotiocianato). A continuación, los portaobjetos se incubaron a continuación con el segundo anticuerpo primario seguido de incubación con anticuerpo conjugado con Cy3 secundario. Los portaobjetos se contratiñeron con DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) y se cubre con polivinilo-alcohol medio de montaje (DABCO, Sigma-Aldrich) y se analizaron utilizando una cámara Zeiss (Oberkochen, Alemania).
para la inmunohistoquímica, el pre-tratamiento (fijación) de los portaobjetos fue el mismo que el descrito para inmunofluorescencia. Después de la incubación con el anticuerpo primario, se utilizó una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con AffiniPure burro anti-ratón o una IgG anti-cabra de burro (Jackson ImmunoResearch). Las láminas fueron incubadas en DAB (3,3 'diaminobencidina) (BioGenex, San Ramon, EE.UU.), de contraste con Haemalaun y montadas con Glycergel (Dako, Hamburgo, Alemania). La cuantificación de cada tinción inmunoenzimática de las células tumorales de 65 tejidos tumorales individuales en seis campos magnificados individuales (× 400 aumentos) para cada muestra tinción se obtuvo por recuento de células realizado por dos investigadores independientes cegados para la enfermedad subyacente. Los campos magnificados eran representativas para la sección del tumor entero. El resultado de la tinción se expresa en porcentajes de positividad (%). Todos los valores se expresan como media ± desviación estándar.
cuantitativa en tiempo real PCR con transcripción inversa análisis
Para el análisis de la expresión génica de las células CD4, CD25, Foxp3, TGF-β, e IL-10 por RT-qPCR, se extrajo el ARN celular total utilizando el RNeasy Minikit de Qiagen (Hilden, Alemania). Las áreas de interés (únicas regiones epiteliales) para cada sección de tejido se microdissected manualmente utilizando una hoja de bisturí. Igual cantidad de áreas de tejido fueron evaluados (2 × 1,5 cm
2 de superficie por sección, grosor de 10 micras). extracción de ARN de las muestras de pacientes y líneas celulares de colon humano establecidos (por Foxp3) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los conjuntos de cebadores se obtuvieron de Qiagen, 18S ARN pares de primers (adelante: TCA AGA ACG AAA GTC GGA GGT TCG, revés: TTA TTG CTC CTC AAT GGG TGG CTG) fueron diseñados por Biomers (Ulm, Alemania). ADNc de colon humano emparejado se adquirió de Pharmingen (Heidelberg, Alemania) como control y se estandarizó a la línea base. La deshidrogenasa genes de mantenimiento gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH), ß-actina, y 18S ARN [33] se utilizaron para la cuantificación relativa y el control de calidad de ADNc. Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo con un Opticon 2 Sistema de DNA Engine (MJ Research, Biozym, Oldendorf, Alemania). El valor de cuantificación relativa, veces de diferencia, se expresó como 2
-ΔΔCt. Para el análisis de cáncer de colon líneas celulares de expresión se indica en valor medio, Ct y la expresión relativa (genes Foxp3 /limpieza).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando SAS 9.2. La supervivencia global se define como el período de tiempo entre la asignación al azar y la muerte de cualquier causa. Los pacientes, que se perdieron durante el seguimiento fueron censurados en la fecha del último contacto. La supervivencia global fue evaluada por medio de PROC PHREG (modelo de riesgos proporcionales de Cox). Los parámetros de pronóstico potencial, identificados en un procedimiento por etapas, se han investigado más a fondo por el método de Kaplan-Meier (PROC LIFETEST). Para el análisis univariado valor medio de corte, ya sea alta o baja expresión se fijó en el 12% de Foxp3 Treg en el tumor infiltrante y el 16% de Foxp3 en las células cancerosas. El análisis univariante de importancia para la expresión de Foxp3 Treg de tumor infiltrante y las diferencias de expresión de células de cáncer en las curvas de supervivencia se evaluaron mediante la prueba de log-rank. De la misma manera las curvas de supervivencia se compararon para N y T categorías, así como tumor primario.
Se analizaron dos grupos independientes de pacientes usando la prueba t de Student (Satterthwaite). Se analizaron más de dos grupos de aplicar PROC GLM (análisis de varianzas) con la prueba post-hoc (Tukey). Distribuciones de frecuencias se compararon mediante tablas KXM (Chi-square). coeficiente de correlación de Pearson se utilizó para describir y para poner a prueba las correlaciones bivariadas. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Reconocimientos
Los autores agradecen al Sr. Dipl.-Math. Mathias Brosz para el asesoramiento estadístico y la señora Sabine Müller-Morath, la señora Mariola Dragan, Nadine Gutermuth, y la señora Ingrid Strauss por su apoyo técnico.